Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 81
Текст из файла (страница 81)
1г' СЬе реа)сз аге пог ъчеП аерагагес|, апа!ухе -05 р! ог ечегу ойег Сгас6оп еПЬег Ьу асЬогргюп Со РЕ-81 61гегв (р1еаяе аее СЬарСег 13, РгоСосо1 7, 5сер 3) ог Ьу сЫп-1ауег сйготасойгарЬу. Роо! сЬояе Сгассюпа сопса|п|п8 гагПо!аЬе1ес| оййопис1еосЫе сЬас с|о пос сопса!и арргес!аЫе апюипса ог' ишпсогрогасес1 (у>ир]АТР. 1с сЬе гасйо!аЬе!ес1 оПЕопис1еосЫе |а со Ье иаес1 сп епгутас!с геассюпа, сЬеп ргосеес| аа со!- 1омъ. ОсЬегсч|ае„ргосеес| со 5сер 8.
а. Ехсгасс сЬе роо1ед ггассюпя сч|сЬ ап ес)иа! чо1шпе ог" РЬепойс|Пого(огт. Ь. Вас)с-ехсгасс йе огйапк РЬахе сч|сЬ 50 р! ог 10 тхс Тпя-С! (РН 8.0), апс! согпЬ|пе сЬе ссчо ас!иеоиа РЬааеа. с. Ехсгасс сЬе сот|йпес! аг!иеоиа РЬааеа сч)сЬ ап ес)иа! чо1шпе ог" сЫого|опп. д. АсЫ 0.1 чо|шпе ог 3 м аог!!шп асесаге (РН 5.2), ппх иеП, апс! аеЫ 3 чо1шпеа ог" ейапо1.
!псиЪасе йе аатр1е |ог 30 т|писеа ас 0'С, апд сЬеп сепсг|ги8е П ас тахппшп зреес! Сог 20 т|писеа ас 4"С ш а гпкгоййе. 1)ае а ппсгорсрессог егрпррес| чбсЬ а с|сарояаЪ|е 6р со геточе сЬе ейапо1 (счЬкЬ яЬои16 сопса|п чету 16|1е гайюас6нйу) Сгот йе сиЬе. АгЫ 500 р1 ос 80% есЬапо1 со йе сиЬе, чогсех П Ьпейу, апс! сепсг|гийе сЬе сиЪе айаш ас тах- ппигп хреес! Сог 5 т!писез сп а ппсго6лйе.
(Ле а писгорсрессог ес!шррес! сч!сЬ а с!(ярозаЫе с|р со геточе сЬе есЬапо1 Сгот сЬе сиЬе. 5сапс! йе ореп сиЬе Ъе|йпс1 а Р1ех|81ая асгееп ип|П йе геяс$иа! ейапо1 Ьаа ечарогасед. !)!аао!че йе ргес!РПасег1 о1сйопис!еосЫе сп 20 р! ог ТЕ (РН 7х5) апд всоге |с ас — 20"С. РГО1ОСО! 6 Риппса6оп о1 Кайо!аЬе!ес1 О11цопис1ео1Ыеь Ьу СЬгота1оцгарЬу оп а 5ер-Ра1с С„в Со!итп т Н!5 РКОтОСОЬ ччн!сн ь л моо!Рсслтюн ое РКОсеооке5 деаспЬед Ьу Ьо ес а1. (!984), ЗапсЬег-РехсагЕог ап6 ()гбеа (1984), апг1 2011ег апс1 8ш!ЕЬ (!984), г1еаспЬеа а шесЬос( Еог йе аерагас!оп оЕ гайо1аЪе1ес1 01!8опис1еосЫеа Егош ишпсогрогасег1 гайо1аЬе1 ЕЬас са1сеа асЬ апса8е оЕ сЬе гечегыЫе аЕВсшсу оЕ 01!8опис!еосЫеь !ог 61ка 8е1.
ТЬ)а ргососо1 сап Ье ихес) оп1у со рип(у о118опис1еос!с1ея саггу!08 а 5'-РЬохрЬасе 8гоир, гайо(аЬе)ес1 ог ип1аЪе(ес1. ТЬе шесЬос) беасПЪе6 ш Ргогосо1 1 аЬои!с1 Ье паем Со рип(у 0118опис!ео6с1ех Рйй Ьее 5'-Ьудгоху! 8гоиры МА1ЕШАсЯ СА()Т!ОЬЬ Р1еахе хее Аррепйх 12 Еог арргорпасе Ьапс)!!08 оЕ гпасепа15 шаг)сед хч(ЕЬ <! >. ВиЕЕег5 апг$ йо1и6оп5 Р!еахе хее Аррепйх ! Еог сотропепра оЕ х(ос(с хо!ииопы Ьи((егх, апд геакепи.
О!!исе а!ос!с хо106опх со йе арргорпасе сопсепсгаиопы Асесопии)е (5;4, 30;4, апг) !00а4) <!> С)ае со сп! НРЕС-кгас(е асесогасп!е (с00аГа) Еог еаеЬ 5ер-Ра!с со!испп. Ргераге сЬе еи!псеб ао1ибопа оЕ асесопкп!е сп НсО)иас ЬеЕоге иае. Аттоп(ит Ьссагбопаге (25 тм, рН 8.0) Атгпоп)ит ЬссагЬопаге (25 тм, рН 8.0) сои!а)п)пд 5;4 ( Еч) асегопсги1е М!х 5 пс! оЕ асесапип!е се!ЕЬ 95 пс! оЕ 25 псы апппоппнп ЬкагЬопасе. ТЕ (рН 7.б) )х(ис1е!с Ас!415 апд О1фопис!ео6деб Каг)101аЬе1ег) 0118опис)еос(г)е <! > ТЬе асагсгпк гпасепа! Еог рипбеабоп Ь сЬе геасбоп гшхшге Егосп Ргососо! 2 (е!сЬег 5сер 5 ог 5сер 5), атсег сс Ьаа Ьееп Ьеасес( со бк С со гпасбгасе ЬаесепорЬаке Т4 ро!упис!еосгае К!пасе. прес!а1 ЕЕ!и!ргпепЕ Сепгг(Еи8а1 ечарогагог (бачап! 5реес(гас ог едисча)еп0 М(сготи8е ГиЬеь (1.5 т)) )п а гас)с ог Егасиоп соИессог С)аес( Еог сЬе ео!!есбоп оЕ гас!Ро!абе!еб о!скопис!еосгаеа е!ш!пк 6 от сЬе со!шпп.
10.28 Ргогосо! 6: Риг()ссаг(оп о( Каг(101аЬе1ег( 01(еопис(еог(г(ел Ьу СЬготагоегарЬу ои а $ер-Ра)г Сл Со1ити 10.29 $ер-Ра)г сlазяс со!итал, ьИогг Ьог(у 5ер-Ра(г с!агл!с со!шппя (ачаВаЫе Ьогп сЬе Суасегл Р!ч(г(оп оГ М(!!(роге) сопсаш 360 ша(со!шпп оГ а Ьуг(горЬоЫс (Си) гечегьег(-рЬаяе сЬгошасоагарЬу геяп. ТЬе зерагас(оп рппс!р!е гпа(сея ые о( сЬе (асс сЬаг йе о!сдопис(еосЫе аг(ьогЬг со сЬе со!шпп лчЬеп сЬе ро!апсу оГ сЬе ьо!чепс (л Ь(аЬ (е.е., ациеоиа Ьи((егл) ап6 е!осел Ггогп йе со!шпп гчЬеп йе ро!апсу оГ йе яо!чепс 6 гег(исег( (ей., а ппхсиге оГ шесЬапо! апг( НлО). А яерагасе со!шпп ы геци(гед сог еасЬ рЬоврЬогу!ас(оп геассюп. $уг(пие Г10-сс ро(ургору!епе) МЕТЫОсл 1. Ргераге а $ер-Ра)г Сга гечегяейрЬаае со1шпп аа Г011оччи а.
АпасЬ а ро1ургору1епе вуппце сопса!и!пи !О ш! ауасесошсп1е со а $ер-Ра)с Сш со1шпп. Ъ. $!очч1у риаЬ йе асесошсп1е сЬгоиВЬ сЬе $ер-Ра)г со!шпп. с. Кеточе ГЬе луг(п$е Ггот йе $ер-Ра)г го1итп апг) йеп са)се йе р!ипаег оис оГ сЬе Ъагге1. ТЬга ргечепса алг Ъе!пд ри11ег1 Ъас)г !псо сЬе со1шпп. КеапасЬ сЬе Ъагге1 со йе со1шпп. й Ний оис сЬе огВап!с зо!чепс шЫс гсчо 10-пл1 а1н)посв оГ ясеп1е Н О. Кереас $(ер с айег еасЬ счаяЬ. 2.
Ел)1исе йе гайо!аЬе1ег1 0116опис1еосЫе ргерагасюп со !.5 ш1 чч!(Ь асеп1е Н О, апс1 арр!у йе еп6ге аашр1е со йе со1шпп сЬгопдЬ сЬе ьуппВе. 3. ЪЧааЬ сЬе $ер-Ра)г со!шпп чч!(Ь сЬе Г011очч!06 Гоиг яо!ис!опт. Кереас Всер 1с аусег еасЬ счаьЬ. (0 ш! оГ 25 шм ашгпошшп Ь|сагЬопасе (рН 8.0) 10 ш! оГ 25 шМ апипопшгп ЫсагЬопасе(55ч асегоппп!е (0 пл! оГ 5% асегопЬп!е (0 пл! оГ 50С асеСопип!е 4. Е1исе сЬе гайо!аЪе!ег1 о1!Вопис1еосЫе чч(й сЬгее 1-гп1 а1и!иоса оГ 3056 асесопКп1е. Со11есс еасЬ Ггассюп ш а яерагасе !.5-гп! ппсгойце сиЬе.
Кереас $сер !с аусег еасЬ е!06оп. 6 'ччАКМЪ(С Весаиае рЬоарЬогу!ас(оп геасс(опа аге о(сеп сагпег! оис лч(сЬ > ! 00 иС! о( гайо!аЪе(ег! АТР йе апюипг о( гайоасг(ч!Су (и СЬеае со!игпи (гас!(опа гпау Ье сопя!г)егаЫе. Ехегс(ае саге апг( Ье й!(аепг аЬои( йароаа! о( ип(псогрогагег( гайоасг(ч(гу, р(реССе С!рь, апг( ш!сго(иае СиЪеа. 5. Кесочег СЬе 01(цопис1еосЫе Ьу ечарога6пц сЬе е1иасе со г(гупеаа ш а сепсп6лаа! ечарогасог ($ачапс $реег)Час ог Ьь ег!и!ча1епс). 6. (л(аяо1че сЬе гайо1аЪе1ей 01(цопис1еосЫе ш а ыпа!! чо!шпе (10 р1) оГ ТЕ (РН 7.6).
Рго1осо! 7 ЕаЬе! ~пц о1 5упйе6с О! ~цопис!ео6деь Ьяпц Йе К!епоч~ Ггадгпеп1 о1 Е. сой 0МА Ро!угпегаье! о исонс|сиот|ое5 лкс с|5с|лссч слвксю |н Рнозгнокчслт|он килст|онх сага!ред Ъу ЪассепорЬа8е Т4 ро1упис!еоСЫе Ыпаае (р!еазе атее Ргогосо! 2). Рог аоспе ригрозея Ьоъчечег (е.8., ъчЬеп ияп8 о118опис!еосЫех аа ргоЬеа |и 5оисЬегп ЬуЬг161га6опь), |с )а ппрогсапс со га6)о1аЬе1 со а Ь|8Ьег арес)Ве ас6|6су. Ас Ьея, РЬокрЬогу1а6оп гехи!та 1п йе )псогрогасюп ос опе асош ог' "Р рег шо1еси!е ог о!18опис!ео6де.
РгоЬеь ог'Ь18Ьег крес|6с ас6Ы6ев сап Ье оЬ|а)пей ияп8 йе К1епоъч сга8шепс ог" Е. соВ РХА ро!ушегаье 1 со зупсЬеяке а ьсгапд ог' РХА сошр1епъепсагу со сЬе ьупсЬес)с о118опис!еосЫе (5сибепс)с1 ап|1 ъЛ|а1!асе 1984; ()!1г)сЬ ес а1. 1984Ъ; Сот геч)еъч, р1еаае атее ЪЧесшиг 1991). А аЬогс ргипег 1х ЬуЬг161кед со ап о118опис!еосЫе се|пр!асе ъчЬоае хеъ)иепсе 1а сЬе сошр1ешепс ог сЬе с$еягед га61о1аЬе1ес) ргоЬе. ТЬе ргипег 1а сЬеп ехсепбе6 ияп8 сЬе К!епоъч Сга8шепс со (псогрогасе [а-||Р) ЙХТРз 1п а Сешр1аге-6!гессе|) п|аппег. Агсег йе геассюп, |Ье сешр!асе апс) ргобисс аге аерагасе6 Ьу бепасига6оп Со11оъчег) Ъу е!ессгорЬогеяь сЬгои8Ь а ро1уасгу1ашЫе 8е1 ипъ)ег гепатит)п8 соп616опв (р!еаье аее Р18иге 10-1). |Л|1|Ь сЬ)в п|есЬод, 1| 1х роя)ые со 8епегасе о118опис1еосЫе ргоЪеа сЬас сопса)п хечега! га61оасс)че асопы рег шо1еси1е ос о118опис1еосЫе ап6 со асЬ(ече хрес|Ье ас6|66еа ав Ь|8Ь аз 2 х 1Ою ерш!С|8 ог'ргоЬе.
1п а шо61()салоп ос сЬ)х га61о1аЬе!1п8 ргосебиге, !оп8ег ргоЪеа сап Ье ьупсЬеяке6 Столп съчо оВВопис!ео|Ыеа сЬас сопса)п соп|р1е|пепсагу аеъ)иепсеа ас сЬе|г 3' сегппш (П1гкЬ ес а1. 1984а). Неге, сЬе съчо о118опис1еосЫез аге аппеа1е6 ч|а сЬе|г сошр!ешепсагу 3' вес)иепсех ап|1 сЬеп ехсепбе6 ъч)сЬ сЬе К!епоъч Сга8гпепс.
ВосЬ ьсгап|Ь аге ехсепбеъ) (ап6 гас))о1аЪе!е6), гези1с|п8 1п а 6ир1ех йас и|ау Ье сопядегаЫу 1оп8ег сЬап еЬЬег ос |Ье съчо ог)8!па! о!|8опис!еосЫея А1сЬоиВЬ сЬ)в шейю6 гег)шгев съчо о1|8опис1еосЫея 1с Ьаз сЬе абчапса8е сЬас Ъой асгапбз ог сЬе рго6исс аге га6)о1аЬе1ед. 5сгапд зерага6оп ап6 ри66сабоп Ьу ро!уасгу!аспЫе Ве1 е1ессгорЬогеяа аге сЬегесоге по !оп8ег шапдасогу. !пасеай сЬе га61о!аЪе!е6 ргоЪев сап Ье рипВед Ъу сЬгоп|асо8гарЬу |Ьгои8Ь 8ерЬабех С-15 ог В)о-Се! Р-60, ехаеп6а11у аз 6еаспЬед ш Ргососо! 5 ог" сЬ)а сЬарсег. чъЬеп р1апшп8 ап ехрегипепс ог' сЬ)а суре, р!еахе сопядег йе го11оъч)п8 ро|пся ° Т)се хреефс асипгу оу г)ге [и-~~Р]ИНТРь 1и Ме геас6оп. ТЬе прес(йс ас6Ысу ог а с)ХТР ъчЬоае а-РЬоарЬасе Ьаа Ьееп сошр1есе1у аиЪхйсисе6 Ъу ||Р 1а -9000 Сйпгпо1е.
Ргерагасюпа ъч)сЬ!оъчег прес(Ве ассп46еа сопса)п а ппхсиге ог" ЬосЬ яр-!аЬе!ед ап6 ип1аЬе1ег) пю1еси!ея ТЬия 1|" а яп8!е га6)о!аЬе1е6 с1!ъ(ТР ъч)сЬ а хрес)Ве асс)ч)су ог'3000 С)lшпю!е (а |пс1|Ые6 |и сЬе аупсЬес)с геассюп ап|1 йеге аге оп1у йгее роясюпь ас ъчЬ(сЬ |Ьас пис1еосЫе сап Ье 1псогрогасе6 |псо йе Впа! ргос)исс, ап ачега8е ог оп1у опе асоп| ог" '|Р ъч|11 Ье ргезепс ш еасЬ |по1еси!е ог" ргоЬе (|.е., йе арес)рю асспбсу ъч111 Ье арргохипасе!у ес)иа! со йас ог а ргоЪе 1аЬе1е6 10.30 з впав-е1гепбеб ОНА 1епр!е1е еупгие11с огдопвс1еоббе згр) игр 1пгее оп1еЬе!еб бпгре шепот 1гадюеп1 о1 Е. сог ОНА ро1уюегеее 1 бепа1оге еерага1е 1еюр1а1е ОНА 1гою гебю!аЬ1е1еб ргобис1 Ьу рперагагпе е1вс1гориогеве спбег бепа1вппд сопбаюпе тгоодЬ а ро1уеспу~егп1бе де1 оп!аЬе!еб 1еюр!е1е габю1аов!еб ргобосг габю1аЬе!еб гпагКег НС!)КЕ 10-1 ЕаЬе11па о! Буп!Ье6с О1!доббс)ео6Ые !!з1па йе К!епонн Ггаатеп! о! Е.
со0 0Ь!А Ро1утпегазе ! Р!еазе зее гехг !ог бега11з. Ъу ЬасгепорЬаце Т4 ро1упис1еогЫе Ыпазе). 1Е гЬе зег)иепсе оу гЬе деяге6 ргоЬе апс) йе зре- с16с ас6гбгу оу !Ье ана)!аЫе ргесигзогз аге )споннп, Ь гз роза)Ые !о рге61сг гЬе ргоЬе'з зрес)Вс ас!!н)гу гнЬеп опе, гзно, гЬгее, ог а1! Еоиг !и-згр)с)1!Трз аге изс!ис1е11 !п гЬе геасбоп. ° ТЬе соисеитта6ои оу" г!)17ТРз т йе теасгюи. Ро1угпепка6оп оу пис1еоГЫез гн)11 пос ргосеег! егбс)епг!у ип1езз гЬе сопсепггагюп ог еасЬ с)ХТР гп гЬе геасгюп гегпагпз а! 1 )гм ог дгеагег (1 )г!и! = -0.66 п0/)11) гЬгоицЬоиг йе соигзе оу ОЬе геас6оп.
Са1си!аге !Ье гога1 1)иап6гу оу еасЬ г)ХТР гЬас ънои16 Ъе !псогрогагег! )пго ОЬе ргоЪе, апаши!пд йас а!1 оу гЬе з)п01е-зггап6- е6 зег)иепсез гп гЬе геас6оп аге ые11 аз гешр!асез. ТЬе !о!а! ашоипс оу еасЬ д! 1ТР !п гЬе геасгюп зЬои16 Ье гЬе зшп оу гЬе агпоипс гЬаг сои!д Ъе !псогрогагед юсо йе ргоЪе р1ы 0.66 пег!11. ° ТЬе ртгтет тмзг Ье о) зифсгеиг !еидги аис! зресфс)гу го Ь)игг го йе гетр!иге пил ртотоге зуийез)з аг йе арртортгаге розгггои. Рпшегз изег! !ог 1Ь!з ригрозе аге изиа11у 7-9 пис1еогЫез 1опа апг) аге сошр!егпеп!агу го зег)иепсез ас ог с1озе го йе 3' сегш)пиз ойЬе гегпр1асе о110опис1еогЫе. Весаизе йе згаЪ11иу оу зисЬ зЬогс ЬуЬгЫз гз г!)йки1г го ргес))сг, гЬе гагю оу рпгпег го !егпр!аге гЬаг а!нез гЬе шахппшп у)е16 оу 6л11-!епВзЬ ргоЬе зЬои16 Ье дегегпипе6 ешргпса1!у ЪеГоге ешЪагЫпц оп!ауде-зса1е 1аЬе!1пд геасгюпз.
Ртгосо1 7: 1аЬе11иК ог 5уигЬеггс ОПеоиис1еобг)ез !7згиК йе К!еиогн РтаКтеиг о) В. со11 ВЫА Ро!утетазе 1 10.3! 10.32 Сйаргег 1О: Ног)с)п~ и зй 5улгйес)с Ойчолис1еог)бе РтЬея ° Тйе Япа1 ргобисг Ь а боиЫе яггалбеб Егаетелг оЕ 1лХА зчйояе 1ещяй Ея ез)иа1 го ог яйуйг)у 1еяя гйаи гйаг оЕ гйе гетр1асе Еберепб)пе ол йе 1осайоп оЕ гйе яез)иепсея сотр1етелсагу го йе рптег).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
