Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 84
Текст из файла (страница 84)
!! тЬе ехрепптепс Ьаа тчогттетт тче!1, чету!сп1е гасПоасичтту аЬоп!тС Ье аааоссатет) тчссЬ йе гпетпЬгапеа соптасп!п8 чессог РттА а!опе. риттЬеппоге, й! а тагПоас6чиу аЬоо!д Ье сошр!ете!у ге!еаает) Стоит сЬе тпептЪгапеа ас сетпрегаилгеа шосЬ !отчет сЬап тЬе еатипасетт Т . Оп йе ойет Ьапй сопят)етаЫе гагПоасилсу аЬои!8 Ье аааоссасетт тчссЬ сЬе шешЬтавеа соптасосп8 сЬе саг8ет РЬСА; сЬе е!и6оп о! сЬь гаттсоастсчсту аЬооЫ аЬотч а аЬатр тетпрегатоге ттереп<)епсе. Чету !Ьс!е таттсоасссч!ту яЬоо!тт Ъе ге!еааетт антош йе тпетоЬгапеа оп61 а аписа! сетаретасше са геасЬет), апт) йеп -90% о! сЬе таМоаойЮу аЬои!8 Ье ге!еаает) т)игсо8 йа шеоеегПв8 0-9'С где ш сешреташге. ТЬе сешреташге ас тчЬссЬ 50% о! сЬе гаттсоасссч!ту Ьаа е!осот! !тот сЬе птетпЬгапеа соптаспса8 йе саг8ес аеттиепсеа ь тте8тпетт аа йе Т, о! йе ЬуЬгЫ Ъесъчееп йе ргоЬе апт) тса саг8ет аециепсе. ГОА2 Оларгет 10: $4тотГстч ъч|й БуигЬег(с 011доиис!еогиГе РтоЬев ОЕ!СО)ъ(1)СЕЕОТ!ОЕ ЯЧЧТНЕь1ь ()п61 йе еаг!у 1980в, сЬе сЬеписа! вупсЬея(я оЕ |$е6пе|$ яесрлепсея оГ РНА |чая ивъ)егса)сеп ш япеПу 1аЬогасопея Ьу 1аг8е сеапь оГ |пчея68асогв.
А||6 и иая а Ег|ьсгабп8!у в1оъч ап6 ъчеагьоп|е Ьияпевя ТЬе ъчог1| Еог ъчЫсЬ Н. СЬоЬЫ|1 КЬогапа ъчая аъчагс$ес) йе )ъ(оЬе! рите (и 1968 — яупсЬеяя оГ а Гипс|(опа) сКЕ4А деве — соо(с яечега) усата ап6 ъчав риЫьЬес) |п яепа! Гопп |и пюге сЬап 50 рарегя. Ая!асе ая 1977, йе пасе оГ сЬе агс ъчав вшпп|аг|хе6 Ьу АтпагпасЬ ап|1 Вгоотп: "СЬеииса) тесЬося Еог йе яупсЬея(я оЕ оП8опис!ео|Ыев Ьаче ип|$ег8опе |$гатпаск ииргочетепс |п |Ье!авс съчо |$еса|$ев, Ьис висЬ 8оа1в ав |Ье яуп|Ьеяь оЕ а сП)ъ(А п|о1еси!е ог сЬе Еас|1е ргерагаьче яупсЬеяв оЕ Р)4А Вепея в|61 вЫпипег |п йе йвсапсе....
Свге Ьаче а 1ов8 ъчау со Воу Е1е8апс ргояе, Ьис яЬогсяВЫе|1, япсе )ия 1 уеаг 1асег, а вупсЬеск сР)ъ(А епсойп8 сЬе шяи1ш А ап|$ В сЬашя ъчав агьетЫе6 Ггот втпаП вупсЬебс оП8опис!ео|Ыея, с1опей ап|1 ехргеяед ш Е. соП (С'ое|Ые1 ес а!. 1979). ТЬе 1|еу ясер ш сЬе сЬеписа! яупсЬевь оГ Р)ъ)А )я сЬе Го|8(п8 оГ рЬоярЬойеяег Ьопбя Ьесъчееп врес|Г- к пис!ео|Ыев, Весаияе сЬе ш8аг пю(есу о( |1еохупис1еоск$ев свита(пя съчо Ьудгоху! 8гоирв (ас йе 3' апс)5' рояьопя оГ сЬе деохупЬояе пп8), опе пшя Ье ргосессес) ъчЬПе сЬе о|Ьег ь 1ш)се|$ со сЬе пехс |$еохуп'- Ьопис!соя)бе ишс.
ТЬе сгапяепс ргосесс!п8 Вгоир пшяс |Ьеп Ье тетвоче6 Егогп |Ье ви8аг со аПоъч ЕпгсЬег ехсепвюп оГ сЬе о68опис1еосЫе сЬаш. ТЬе Ьаяев оГ Пеохупис1еоя)с$ея а! во сопса|п геасс|че Вгоирв (е.8„|Ье ехосус1к апипо 8гоиря оЕ абеп)пе, сусояпе, ап6 8иатпе) йас геъ)и(ге ргосес6оп |ЬгоиКЬоис |Ье еп6ге вупсЬеьс ргосеь (р1еаяе ъее 168иге 10-3). ТЬеяе "рета)ясепс" ргосес6че Вгоиря пшяс а1яо Ье гегиоче|$ ас сЬе еп|1 оГ сЬаш аметпЫу, КЬогапа'в ъчог1с |чав сагпе|1 оис ъч(сЬоис йе ЬП! Ъепейс оЕ рЬоярЬасе-ргосес6п8 Вгоирв, апс$ ехсепвюп оГ сЬе 8гочпп8 сЬаш ъчав рояяЫе оп!у Ьесатье рЬоярЬос$(евсеев Ьеса|пе сеп|рогап1у сопчегсе6 со яиЬяс)сисе|1 ругорЬоярЬасеь ъ)иг)п8 йе соирПп8 геассюп, сЬегеЬу аПоъч)п8 сЬе яи8аг Ьу|(гоху1 со раг6с|расе ш сЬе геассюп.
Ноъчечег, й|я рЬоярЬойевсег |пе|Ьо|$ ъчав ясгап8и!асе|$ Ьу сЬе |пеГВс|епсу оЕ еасЬ ро1угпепха6ов геас6оп ап6 сЬе рго8гевяче! огь оГ яе1есьлсу дипп8 ехсепяоп оГ сЬе сЬа|п. 5)псе сЬе п|Ы 1980в, ч|гсиаПу аП о68опис1еосЫе ъуп|Ьеяя Ьав ивет) а со|пЬ|пабоп о( ргосессп е 8гоирв ап|1 яо1Ы-рЬаве яупсЬея)я Ъаве|$ оп рЬоврЬогаиийСе сЬет(яссу (Веаиса8е ап|1 Сагийеп 1981; МсВпде апс$ СагисЬегя !983; 5)пЬа ес а1. 1984; Гог гелеъл, р!еаве вее АсЫпвоп ап|$5пи|Ь 1984; Саь 1984; Веаьсе ес а1. 1988; Сагийегя 1991; Сагийегв ес а!. 1992; 5опчеаих 1994; Ров ес а1. 1996). А сопчепсюпа1 яупсЬеск сус1е шчо1чев |ье оЕ а яо!Ы-рЬаяе ялррогс (ивиаПу сопсгоПед-роге 81аь,!еы Гге|)иеп|1у ро!уъсугепе).
ТЬе оП8опис!ео|Ые ь сгеасес$ опе Ьаяе ас а типе Ьу еясеп(ут8 сЬе 3'-рЬоярЬасе 8гоир оГ ап арргорпасе!у ргосессе|$ рЬоврЬогаиийсе пис! еоя|$е со |Ье 5'-Ьу|1гоху! оГ сЬе сегвипа1 гевк$ие, ъчЬ|сЬ ся ассасЬе|$ со сЬе во!Ы рЬаяе шррогс Ьу а 1ш$|ег. ТЬе о68опис!еосЫе сЬегесоге 8гоъчя ш а 3' — |5' йгес6оп, йе орроя|е оГ епхугпаСкаПу саса1угес$ геасСюпв. А гоип|$ оГ соир1ш8 |пчо1чев Гоиг Сурев оГ геассюпя пи16 аП|а!ше Ьут)го1уя)я, пи!д асЫ Ьуйо1уяв, пис1еорЫ!к йвр)асетпепся ап6 гедох а!сегасюпв. Рпгеассес1 сЬеписа1в аге яп|р1у ъчавье|1 аъчау айат еасЬ яса8е оЕ сЬе соир1ш8 геассюп.
ТЬе спсу1 8гоирв, ъчЬ|сЬ аге ге1еаяе6 Пипп8 еасЬ топит( оГ вуп|Ьеяя, аге сЬготпорЬогея йас аЬвогЬ ас 498 пт, ап6 |Ьеу сап Ье сьед со гпошсог сЬе еЕВс|епсу оГ вуп|Ьеяя айег ечету гоппер оГ соирПп8, ТЬе сегпипа) йп|е|Ьохуспсу! 8гоир, Ьеш8 асЫ-!аЬ|!е, ь |Ьеп гепюче|$ ш сгкЫогоасеск асЫ (ТСА) со Вепегасе а сотроип|$ ъл|Ь а Егее Ьу|$гоху! 8гоир, ъчЬюсЬ ь сЬе оп1у геас6че пис!еорЬ|1е |п йе 8гочбп8 оП8опис1еосЫе (р1еаве вее р(Вите !0-4). АЕсег сЬе йеЫосЫп8 во!исюп Ьая Ьееп соспр1есе1у гегвоче6 Гго|п |Ье со!шпп апс( гер!асс|1 ъчПЬ асесопьп!е, йе со1итип ь риг8ес) чбй ап спет| Вав (аг8оп ог Ье!шгп) со геточе йе асесопьп1е ап|$ апу сгасев оГ ъчасег. А гпо1аг ехсегь оЕ йе арргорпасе рЬоврЬогатп|йсе пюпогиег ь йеп геассе|$ ъч(сЬ |Ье |1есгьу!асе|$ сотпроип|$ ш йе ргевепсе оГ ап ехсея оЕ ас6часог (Н-сесгато1е) со 8(че сЬе рЬоврЫсе спевсег |псеппейасе (БВиге 10-5).
!п сЬ(в геас6оп, |Ье пиго8еп оЕ |Ье рЬоврЬогапийсе Ьесо|пев ргосопасе|$, 8епегаьп8 а Воо|1 1еачш8 8гоир сЬас ь вивсер6Ые со ассас1| Ьу сЬе Егее 5'-Ьус(тоху! 8гоир оЕ сЬе Вгоълп8 оП8опис1еоьс1е сЬа|п. ТЬе пеъч Ьоп|$ Ьесъчееп пис!еосЫев (я итьсаЫе |п Ьой ас)йс ап|1 Ьаяс ъо1исюпв Ьис сап Ъе тели(отсе|1 Ъу охЫасюп оЕ йе спча1епс рЬоярЬогив со репсача1епс рЬоярЬоггь Ьу а рагьаПу а|рлеогь во1иьоп оЕ юйпе (р(8иге 10-6). Ас еасЬ сус1е ш |Ье вуп|Ьеяв, а яиаП Сгас6оп (-1-296) оГ сЬе со!шип-Ьоип|$ пис1еовЫев |1о пос соидепяе ч6|Ь йе |псо|пш8 асс)чатем рЬоврЬогапийсе. ТЬеяе попргобис6че 5' евбя пшяс Ье сарре6 со ргечепс йет геассш8 ъч(сЬ сЬе пехс рЬоярЬогапийсе апд Ьепсе Вепегаьп8 ап о68опис!евое сЬас 1ас)ся а Ьаяе.
Саррш8 ь ас$иече6 Ьу асесу!асш8 сЬе 5'-Ьу|$гоху! 8гоир ъл|Ь асебс апЬубгЫе ш сЬе ргевепсе оГ сЬе саса1увс Х-гпесЬу1ипЫато1е (Е4М!) (р(Вите 10-7). ъъЪеп вупйеяя ь согпр!есе|1, йе оП8опис!ео|Ые гетпашв ассасЬес) со сЬе во1Ы-рЬаяе ялррогс ч|а а виссшасе еясег, апс1 |Ье ехосусПс Вгоирв оГ сЬе Ьаяев в6П саггу 1гг)отта!гоп Рапе)з 10.43 Зде ог Ргогесдпд Сгоир Зггисгиге оу Ргогесбпд Огоир )не!иге ое Ртгесгепд Огоир Соттеп!в оснз О!гпеВоху1гду! (4,4исйгпеВохугпрпепу)гпеВу)-) ог гпопогпе1Ьохуггду! ОН)Г)П)н — сРС Ас1юа1еб Ьу 1е! гаво)е биппд соир))пд О!)воргору)агп)по- -Г Вирргеввев в)бе геас1юпв СуапоеВу! ог Мегпоху — Р— С вЂ” СН вЂ” СН вЂ” СН г г Ргогес1в пис)еордд))с гипс1юпв о! ехосус)!с апипо цюирв Г«5 о! Ве абеп)пе апб )Й4 о! Ве су!ов)пе Веплоу! ()Л; НН вЂ” С вЂ” Сй Рго1ес1в пис)еорп))!с 1ипсбопв о! ехосус!)с апнпо дгоирв )воЬи1угу! )н~ о! диап!пе СНС нс«Р~ 1Р-з~ гв!ис е с ифг$и««« ~~ « ' ксР 5 «« ТЬе 5СЬуг!гоху! гев)бие о! 1пе беохупЬове гев!бие о! 1пе агп!б!1е ТПе 1гюа)еп1 рповрпа1е апаспеб 1о Ве беохупЬове дгоир оп Ве !псопдпд рповрпогагп!б!1е пис)сов)бе ТЬе 1пна)епг рЬоврпа1е абаспеб 1о Ве беохупЬове цгоир оп Ве )псопнпд РЬоврЬогагп!сИ1е пис)еов!бе !51гис1игев гебганнп, нн)1Ь регт!вв)оп, 1гогп РЕ Арр)!еб Вювув1егпв.) ТЬе еВег гпо!е1у рго1ес1в Епе 5г-Ьус!гоху! гев)бие 1гогп геас1юп нг)!Ь Епе )псопипд рповрпогагпк!Ие пис)еов)бе :Г 10.44 СЬаргег )0: ЫогИпц нигЬ БупгЬегсе 01!Копие)еог!с)е РгоЬеь ОСН3 ОССН2СН2СМНСН2СН2СН2 Вг Сро !! !! О О ОСН, омт апаег тса ОСН3 О ОССН2СН2СМНСН2СН2СН2 В! СРО !! !! о о омт оааоп апаег ОСНа аооаггвгг 1 о гав га а а а ! а агг вег Вегас~ Р)еаае аее сЬе Сех! 1ог с)еса)!а о1 1Ь)а геасооп, (Кес)гаууп, ипсЬ реггп!Ва)оп, )гого РЕ Арр1гес) В!Оьуьсегпа.) М МН ! ! М=М омто г~ ге!гаса!е гРган — Р— ОСН2СН2СМ раовраогапг!Опе Вава 2 О омто г~ л ! М М вЂ” Р— ОСН2СН2СМ ! ! М=М !в!гасо!у! Раоараогапвбае Оф/5)с — СРО Е)Сс)КЕ 1О-Б Мер 2: Спор!!пд Кеасс)оп Ье1вуееп 1Ье РЬоарЬогагп1411е Мопогпег апд 1Ье Ресг)1 1асес) Кеаст)уе )Мос1еоа)с)е Р!еаае аее сЬе сехс 1ог с)еса)12 о1 сЬ)а геассюп.
1Кес)гассгп, нпсЬ реггп)авюп, Ггогп РЕ Арр!1ес) В!Оауасегпа.) О ! Р— ОСН2СН2СМ ! Ваве 1~ ! О Оафф)г СРО варрон-Ооопб пио!еоабе Вава 2 О омто г~ о ! гРган — Р— ОСН2СН2СМ ! н 1п)согтасгоп Рапе)з 10.45 Вава 2 о смтс г Ваве 2 О=Р— О ОзАА()) сро ОЗААА( сро спна1епг расправе репгана1еп1 рооврао1г1ев1ег пссвггввв!Ззоав ггв н н ! а Р(еазе зее СЬе СехС 1ог с(еСа((з о1 СЫВ геас0оп.
(Кес(ганга, ип(Ь реггп(зз(оп, 1гогп РЕ Арр((ес( Вюзуз(егпз.) О л !! х, Н НСНЗ СНЗС Н Н СНЗ О О СНЗСОССНЗ асебс апсубпбе всосу!аапр геааеп! О !! Ваве 1 СНЗСО ОЗАМР— сро Оу()(Ю(н — СРО гаг1ме вецоепсев сарреб 1аг1сге вецоепсев Р(СС)КЕ 10-7 5(ер 4: Сарр(ВК Кеас6оп; Асе(усайоп о1 СЬе 5' ОН Сгопр ил(Ь Асебс АВЬЬуг(гЫе Р(еазе зее СЬе Сех( 1ог с(е(а((з о1 СЬ(з геас(юп. (Кег(ганна, иг(СЬ реггпВяоп, Стоги РЕ Арр((ес( Вюзуз(егпз.) -т- О апмпопгспг Пубгохгбе О= Р ОН ОССНЗСНЗСННСНЗСНЗСНЗ 81ф(((((нСРО !! !! О О Е(СОКЕ 10-0 5(ер 5: Ке(еазе о1 СЬе О((допоссеоСЫе СЬагп 1гопв СЬе Сосшпп Ьу Апнпопшпз Нув(гохЫе Р(еазе зее СЬе Сех( 1ог г(ега((з о1 СЬгз геасСюп. (Кег(ганне, ип(СЬ реггп(зз(оп, 1гогп РЕ Арр((ег( ВюзузСегпз.) о ! Р— О о ! ! О ! О=Р О 1пЕогтайоп РапеЬ 10.47 МЕЕТ!]ч!х, ТЕМРЕ]хАТЕ)зхЕЯ Неа6пд а зо1и6оп оЕ с(оиЫе-зсгапс(е6 РЫА ипгаче!з |Ье 6ир!ехез Ъу йзгир6пд йе Ьудгодеп ЬогнЬ йас рш соде|Ьег сошр1ешепсагу Ьазе ра|гз.
1пйчЫиа! Ьус(годеп Ьоп|Ь аге ге! ас|че1у |чеа1| (-5 )сса[йпо!е|Ьос|6) апд |Ьиз аге еая1у 6!згирсег) Ъу Ьеас. Носчечег, сЬе дгеасег сЬе пшпЬег оЕ Ьус(годеп Ьоп|Ь Ьо1йпд апу ичо сои|р!егпепсагу зсгапсЬ оЕ РЫА содейег, |Ье ЫВЬег сЬе сешрегасиге песеззагу со саше а11 оЕ йозе Ьопг]з со Ъгеа1|, зерага6пд |Ье пис1ек асЫ |псо ьчо зсгапс)з. ТЬЬ сгапясюп Его|и с!оиЫе-зсгапс[ес( (Ье!|х) со яп81е-зсгапг[ес( (со[!) соп(оппа6опз аз а Еипссюп оЕ се|прегасиге сап Ье гпопЬогед аз ап шсгеазе ш аЬзогЬапсе апс( ыпаг)сег( Ьу а зЬагр шсгеазе |п йе ехбпссюп соеЕВс|епс ас сЬе сегпрегасиге счЬеге |Ье сопсоппабопа1 сгапясюп са1|ез р1асе.
ТЬе сегпрегасиге соггезропйпд со сЬе гпЫро!пс оЕ сЬе аЬюгЪапсе пзе Ь саПед йе |пе!6пд сегпрегасиге (Т„). 1п зсгиссига! сегшз, |Ье Т Ь йе сегпрегасиге ас |чЬ~сЬ 50ч оЕ |Ье Ъазе раиз !п а |1ир!ех Ьаче Ьееп |1епасигей ТЬЬ ге!а6опзЫр Ьеьчееп пис1ек асЫ ягиссше апс( сЬеппа! зсаЬ!1|су Ьаз Ьееп ехрепшепса!!у ехр!оЬед Еог !оиг с(есаг[ез. Маги|ы апс! Росу (1959, 1962) изес( сЬ|з ге1абопзЬ|р со езсаЫЬЬ |Ьас Еог а счЫе гапде оЕ РХА загпр1ез, сЬе Т Ь а!|пеаг Еипсг(оп оЕ|Ье загпр!ез Ьазе согпроябоп. ТЬе з!оре о(сЬе 1|пе Ь 0.41 С рег 198 |псгеазе ш |Ье (б С) сопсепс. Рог |Ьеппа! дева!огас(оп рго61ез оЕ РЬСА загпр1ез (ъчЬЬ а С+С сопсепс Ьеичееп 3096 апд 7596) гип |п 0.15 счс )4аС! апс! 15 гпМ Ыа сЬгасе, |Ье гпе16пд сеи|регасиге Ь: Т = 69.3'С + 0.41(з [(т~-С]) ТЬсз е|р|асюп и|а1|ез 1с розяЫе со езсипасе ассигасе!у сЬе Ьазе согпроясюп оЕ а РХА загпр1е ягпр!у Ьу гпеая|гшд сЬе Т оЕ сЬе зашр!е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
