Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 83
Текст из файла (страница 83)
1 рарег. ЗсеггПае сЬе ао!н6оп Ьу раыаве сЬгоиВЬ а шпосеПи1оае 61сег (0.45-иш роге а!се). Меашге сЬе ге6 асбче спс1ех о( сЬе ао1исюп, апг) са!си!асе йе ргесЬе сопсепсга6оп оГ сЬе с)насегпагу аПсу1апипошшп аа!и Ггош йе ег)иас!ош С = (и — 1.331))0.018, гчЬеге С Ь сЬе гпо!аг сопеепсгасюп оГ с)иасегпагу аПгу1апппопшш аа1ь апг) п Ь сЬе ге(ганиче Гпг)ех. 5гоге СЬе СПСеге6 ао!ииоп сп г(аг)с ЬоСС!еа аС гоош Сешрегагиге. ТМАС/ счавЬ бо!и0ол 3.0 м ТМАС! 50 шМ Тпа-С! (рН 8.0) 0.2 гпм ЕРТА (РН 7.б) 1 ш8(ш! 505 1)ае йса счааЬ ю1шюп Гог ргоЬеа 14 — 50 пнс1еос(деа ш!епвй. 11 Ь еыеп6а! со счагш ап а!п)нос оЕ йе ао1ибоп со сЬе г)еа!гес( сегпрегасиге ЬеЕоге ые (р!еаае аее Зсера б апс( 7). Ргогосо///: НуЬги//гаггоп оГ 0115опис/еог/с/е РгоЬея сп Ас/иеоия 5о1ипопя !0.37 Ь/ос!е!с Асп15 апс! О1фооос!ео1141е5 /с//сгосе//и/ояе ог и у/оп Я/сегя ог тетЬгапея спаса/п/пд йе /ттоЬ///гес/ /агнес пис/ек асЫя оЕ !псегеяс Ге.у., 5оийегп ог попЬегп Ь/ося, /уяес/ Ьассепа/ со/опсея Ягегя, ог Ьассег/орЬаде р/ас/иея/ РгоЬе5 Кас//о/аЬе/ес/ и//Копие/еог/с/е ргоЬе <1> Ргерагесс ая с/еясг!Ъес/ ш Ргососо!2 ог 7.
Сие гесопипепсс сЬас РЬоярЬогу1асесс ргоЬея Ье риг!Пес/ Ьу ргессрссабоп мчсЬ СРЕ ая с1еяспЬес1 ш Ргососо! 4 Ъе/оге ые ш ЬуЬпсПгапоп. ТЬся гпесЬос1 оЕ рипбсабоп гешочея ишпсогрогасесс !'гр!АТР апс1 сшя ссосчп оп сЬе пшпЬег оЕ шсепяе сайоаспче яроь Греррег яраса/ оп йе ашогайоцгарЬя сЬас сап Ье шииассеп Еог роябче ЬуЪгЫггабоп я!Епа!я. 5рес1а! ЕЕ! о! ргпео1. НуЬпйгабоп с/ен/се Р!саяе яее 5сер 1. 5Ьайпц /псиЬасог, снасег Ьай, ог ЬуЬпс//гас/оп аррагасия ргеяег со 37 С Г5/еря / апс/ 3) апс/ /агег Со а Сетрега/иге арргоргсаге Еог исаяЬ/пд Г51ер 7/ МЕТНО0 1.
РгеЬуЬпйге сЬе 61сегя ог шешЬгапея Еог 4-16 Ьоигя ш 01!аопис1еосЫе ргеЬуЬпйгасюп ю106оп ас 37'С. РгеЬуЬпйгабоп, ЬуЪпйгабоп, апс/ паяЫпц оЕ сиса!аг Е!сел аге Ьея саге!ес/ ош ш 5еагя 5еа1-АМеа! ЪаЕя ог р1аяс!с Ьохея сч!сЬ с!аЬс-Ессс!пЕ 1Ыя Рог 5оийегп апсс погйегп Ыося, а ЬуЬгЫггаиоп с/еч!се ес/и!Ррес/ сч!сЬ яеа1аЫе 51ая сиЬея сои!д Ье мей 2. 13!ясагс/ сЬе ргеЬуЬпйгабоп ю1ибоп апс/ гер1асе К ъчсЬ о!!Вопис1еосЫе ЬуЬгЫггасюп ю10- 6оп сои!а!п!пВ а гайо1аЬе!ес/ 01!аопис1еоСЫе ргоЬе аС а сопсепСгаСюп оЕ 180 РМ.
'чНЬеп ЬуЬпйлпц часЬ яечес а! оПаопис!еосЫея япш!сапеоия1у, еасЬ ргоЬе яЬои10 Ье ргеяепс ас а сопсешгабоп оЕ ! 80 рм апсс сЬе ярессбс асссшсу оЕ сЬе гас/!01аЪе!ес/ ргоЬе яЬои14 Ье 5 х 10я со !5 х 10Я срш/ргпосе. 3. 1псиЬасе сЬе 61сегя Еог 12 — 16 Ьоигя ас 37 С. 4. !3!ясагс/ йе гас!!01аЬе1ес/ ЬуЬпйгабоп ю1исюп спсо ап арргорпасе с/!ярояаЫе сои!а!пег.
К!иге йе 6Иегя йгее сппея ас 4"С мс!ЕЬ !се-со!6 бх %С ог бх %РЕ со гегпоне спояс оЕ йе с1ехсгап яи1/асе. 5. Ч/аяЬ йе 6!сегя пн!се 1ог 30 пиписея ас 4'С ш ке-со!6 бх %С ог бх %РЕ. б. Кспяе СЬе 66егя ас 37'С ш ссно сЬапПея оЕ йе '!'МАС! ог '!'ЕАС1 исаяЬ яо!шюп. ТЬе а!ш оЕ сЬЬ яер Ь со гер!асе йе 55РЕ апс1 55С гасЬ сЬе яо1исюп оЕ чиасегпагу аПсу1апппошшп яа!ся. С/п!еяя сЬЬ ясер ь саге!есс оис ЕП!Еепс!у, сЬе ЕиП Ьепебп оЕ ия!пц ТЕАС! ог ТМАС! члП пос Ье геа1ггей 7. чсгаяЬ йе 6Иегя пч!се Еог 20 гпшисея еасЬ си ТМАС! ог ТЕАС1 ячаяЬ ю!ибоп ас а сешрегасиге йас !я 2 — 4"С Ье!осч сЬе Т !пйсасес/ !и Буше 10-2. Мосе сЬас сЬе Т оЕа ЬуЬгЫ Ь 55'С 1осчег ш а ЬиЕЕег сопса!п!па ТЕАС1 йап ш а Ъи//ег сопсаш!па ТМАС!.
Массе гиге йас сЬе Ъи//егя аге ргечсагшес/ со сЬе с/ея!гесс сешрегашге апсс сЬас Писсиабопя ш сепсрегасше аге !еяя сЬеп а!'С. 8. Кегпоче сЬе 61сегя 6опс йе ъаяЬбпц ю106оп. В!01 сЬегп с/гу ас гоогп сегпрегасиге апс! аисогайоигарЬ сЬеш ая с!еяспЬес/ ш Аррепйх 9. Етр~пса! Меаыгегпеп1 о1 Ме! 1~пц Тел регаШге т нг т ог лы опсоносиотюк нчвк!о!Его то л тАаскт 58оогнсг сап Ье са!си1асед аа деаспЬес1 ш йе шггодисбоп со й!а сЬарсег (р1еаае аее Ме1(!08 Тешрегагиге апс1 НуЬпйха6оп Тешрегашге ш (Ье !пггодисг!оп ог гЫа сЬаргег), ог йе Т шау Ье с1егепгппед ешр(г!са)!у Ьу шеааиг!08 йе гешрегагиге (Т,.) аг счЫсЬ д!ааос!аг!оп ог" гЬе доиЪ|е-ягапдед 1)ХА Ьесошеа гггечегяЫе. ТЬе ехрегипепс !а сагпед оиг ипдег попес)ш!!Ъпшп сопй6опа йаг до пог Уачог геЬуЬпйкаг!оп оу (Ье ге1еааед ргоЬе го йе гагаег.
ТЬе оргипа1 гешрега(иге гог ЬуЬпд!гаг!оп ог йе о!!Еопис1еог!де !а гЬеп депчед антош Тг ТЬе ргоседиге гес(и!геа а с1опед гагцег аес)иепсе йа( !а сошр1егпепгагу (регсес(1у ог ипрегТес(1у, с1ерепд!па оп йе ехрепгпепг) го йе о!(попас!еог!де ргоЬе. 1Г а гагаег аес)иепсе Н пог ача(1- аЫе ггош "пагигаГ зоигсея 6 сап Ъе ауп(Ьеягед сЬеппса!1у ог, гп хоппе сааея деггчед Ьу РСгс. МАТЕИАЕЬ СА()т!О(Ч: Р1еаае аее Аррепйх 12 !ог арргорг!а(е Ьапд1!па о( ша1ег!а15 шаг!сед ис!!Ь <! >.
ВигТег8 апг! йо!ибоп5 Р1еаае аее Аррепйх 1 (ог сошропепга о( а!ос!с 50106опь, Ьи((егя апд геадеп60 661и1е а!ос(с 50106005 !о йе арргорпа!е сопсеп!га6опя Оепагигагсоп аоlидоп ((ог доиЫе-ьггапдед гаг8ег Р)с(А оп!у) !.5 М ГааС! 0.5 ГГ ГтаОН <1> )с)еигга)айаг(оп Ьийег ((ог доиЫе-ьггапдед гаг8ег !ЭХА оп)у) 0.5 м Тпа-С! (РН 7.4) 1.5 м )с)аС! О88описlеодде ргеЬуЬпйгадоп ао(идол 6х 55С (ог 6х 55РЕ) 0.01 м аойого рЬоарЬасе (рН 6.8) 1 гом Е!)ТА (рН 8.0) 5х ВаоЬагдга го!одоп (р!саге аее Лрреос(Ьс! ) 0.5аша (Мч) ЯЭ5 100 )с8)го! с!епагогей (га8гоеосес1 аа!гооп арегш !)Г(А (р!еаае асс СЬаргег 6, Ргогосо! 10) РЬепо!ссЫогогогт (1 с!, ч)ч) Ног г)оиЫе-ь(гапдед гаг8е( ОКА оп)у) < ! > 5ойит асегаге (3 м, рН 5.2) (гог с(оиЫе-аггапдед гаг8ег О)с)А оп!у) 2х 55С 10.38 10.40 С/ар!ее 10г У~от/гт8 ьч(т/с Бупйе6с 01!Копис1еотЫе Ргобек $с!к!ССЕ-5ТКАЬ!ЕтЕО ТАКСЕТ Р!к(А РОС/ВСЕ-5ТКАЬ!ОЕО ТАКСЕТ Р!к!А 5.
б. а. Арр!у -!00 п8 оЕ саг8ес Р!к(А ш а чо!ише оЕ 1 — 3 (г1 оЕ 2х 5$С со еасЬ оЕ сЬе тпаг1сег! тпетпЬгапек. Ь. Арр1у ап ес!иа! агпоипс оЕ чессог РХА (е.8., яп81е-ксгапг!ег( ЬассепорЬа8е М13 РХА кч(сЬоис шкет!) со йе испат)сег! гпегпЬгапек. с. АЕсег сЬе Е!иЫ Ьак дпед, ике Ыипс-епбег! Еогсерк (е.8., Мт1!!роге Еогсерк) со гетпоче сЬе скчо кеса оЕ шешЪгапек Етош йе Рага6!тп, апг! р1асе йеш Ьессчееп кЬееск оЕ сЬ!с(с Ыос6п8 рарег. й р(х сЬе РХАк со сЬе шегпЬгапек Ьу ЬаЫп8 Еог 1-2 Ьоитк ас 80'С ш а часишп очеп.
АЬегпасп е!у, р!асе йе гпегпЬгапек оп а кЬеег о( Ыоггсп8 рарег апг( Вх йе ЕтткА Ьу сгоы!!пйп8 пяп8 СЛг !!ВЬг. а. !Е йе саг8ес РХА Ьак Ьееп с1опег1 !псо а р!аяпЫ, 1шеапхе Ьой йе гесогпЬ(папс р1ак- шЫ апд йе честит Ъу 618ек6оп сч(сЬ а геяпс6оп епхутпе йас г!оек пос с1еаче ъч!сЬ!и сЬе Саг8ет кег(иепсе. Ь. РипЕу йе геки16п8 с!оиЪ|е-ксгапйес) РХА ог йе РСК ргос1исс Ъу ехсгассюп тгчсЬ рЬепо1:сЫогоЕотш апг1 ксапбаЫ ргес!рКасюп ъч!сЬ есЬапо1. Рскко1че сЬе РХА ш 2х 85С ас а сопсепсгасюп оЕ 50-!00 п8/Ст1.
с. Арр!у йе ко!исюп оЕ саг8ес Р(к!А, ак ъче!1 ак а сопсго! Р!к!А, со йе шешЬгапек ргерагег( ак бекспЪег) аЬоче. (/ке Ыипс-епс$ег! Еогсерк со сгапкЕег йе шепсЪгапек со а йеес оЕ 6ис1с Ь!осс!п8 рарег касигасег) гч(сЬ бепашгасюп ко!и6оп. 1псиЬасе сЬе шетпЬгапек Еог 5-!О пипитек ат гоош Сешрегашге. с!.
ТгапкЕег йе птетпЬгапек со а ЕгекЬ кЬеес оЕ сЬЫ1с Ыосс!п8 рарег касигасе6 сч!сЬ пеисга1- гха6оп ЪиЕЕег.!псиЪасе сЬе тпетпЪгапек Еог !О тпшисек ас гоогп сешрегасиге. е. Тгапкуег йе гпетпЪгапек со а с(гу кЬеес оЕ сЬ(с!с Ь!оссш8 рарег, ап6!еаче йепт ас гоогп сешрегашге ип61 а(! оЕ йе йиЫ Ьак ечаротасег1. 1пипоЪт1(хе йе РХА со йе шептЬгапек етйег Ьу ЪаЫп8 Еог 1-2 Ьоигк ас 80 С !п а часишп очеп ог Ьу стока-1(пЫп8 ияп8 (Лг 1!8Ьс.
(/ке Ыипт-епг(ед Еогсерк Со СгапкЕег а!1 оЕ йе шетпЬгапек Со а ро1уейу1епе СиЪе сопташ!п8 2 ш1 оЕ о118опис!еосЫе ргеЬуЬт(6(га6оп ко!и6оп. 5еа! йе сиЬе ап6 шсиЬасе, тч)сЬ оссаяопа1 кЬаЫп8, ат а СешрегаСиге еЯипаСес1 Со Ъе 25'С Ъе1осч йе Т Еот йе ко!чепС Ье!п8 икег1. АЬЬопВЬ сЬе аЬоче ргососо! ыек кот!!опт ка!ск сп гЬе ЬуЬпсВгаиоп ко!пбоп, осЬег ко!шек кисЬ ак ТМАС! ог ТЕАС! сап Ье киЬкгКпсег! К гтексгегС со гтесегпнпе гЬе Т, го гЬеке ко!чепь. АЕсег 2 Ьоигк, агЫ сЬе гаг)!о1аЪе1е6 о!!Вопис1еосЫе со сЬе ргеЬуЬг!6(галоп ко!ис(оп.
ТЬе Етпа) сопсептга6оп оЕ о118опис1еоСЫе кЬои16 Ъе -! ршо1е/ш1. Соп6пие )псиЬат(п8 аС 25'С Ье!осч йе Т Еог а ЕигсЬег 2 — 4 Ьоигк, кч)сЬ оссаяопа1 кЬаЫп8. Кешоче йе шешЪгапек Етогп йе ЬуЬг(г!)хасюп ко!и6оп, апг1 пшпес!)асе1у иптпегке йетп !п 2х 85С ас гоотп сетпрегасиге. Арсасе йе Яи!с! сопс!пиоик1у. Кер1асе йе Е)и(6 ечегу 5 пнпшек ип61 йе ашоипс оЕ га6!пасс!ч!су оп сЬе птешЬгапек гетпашк сопксапс (ак тпеакигед тч!сЬ а ЬапйЬе16 пипипошсог). А6)икт йе СешрегаСиге оЕ а стгси1аСш8 счаСег ЪаСЬ Со 25"С Ъе!огч йе Т . Р(крепке 5 ш1 оЕ 2х 55С шсо еасЬ оЕ 20 81акк секс сиЪек (! 7 х 100 ппп).
Мошсог йе сешрегасиге оЕ сЬе Е)иЫ !п Рготооо! 9: Етр!г!еа! Меатагетепг оТМе!т!ич Тетрегасиге 10.41 опе от" сЬе сиЪез ъчПЬ а йеппошесег. 1псиЪасе сЬе сиЪек ш йе ччасег Ъай ип6! йе сешрег- аспге от" йе 2х 55С ь 25'С Ъе1очч йе Т . 8. ТгапаЕег йе тпешЬгапеа 1пт!!нЫиаПу со гопг ептрсу 8!ать сиЬеа, апт) агЫ 1 ш1 от 2х 55С (Еготп опе оЕ йе сиЪеа ргерагед !п 5сер 7 ап6 ргетчагшет! со 25 С Ье1оъч йе Т ) со еасЬ гпешЬгапе. Р1асе йе сиЬея тп йе ччасег Ьай тот 5 п6писеа.
9. Кетпоче йе сиЬек сои!а!птп8 птешЪгапеа !готп йе Ьай, сгапагег сЬе!и!иЫ со асш6Паиоп ч!а!а, апт) ъчааЬ сЬе сиЪея апт1 шетпЬгапеа ъч!сЬ 1 ш1 от" 2х 55С ас гоош сешрегасиге. АтЫ сЬе тчаяЬ ао1ис!опа со сЬе арргорпате астпсП!ас!оп ч!а!х. ! О. 1псгеаае йе Сешрегатиге от' СЬе чтатег ЪаСЬ Ъу 3'С, апт! нчаи тот йе СешрегаСиге о)' йе 2х 85С тп йе сиЬеа ргерагет1 ш 5сер 7 со ет!иП!Ьгасе. 11. АтЫ 1 ш1 от" 2х 85С ас сЬе Ьт8Ьег сешрегашге со еасЬ оусЬе гоиг шЪеа сои!а!и!08 сЬе птешЪгапеа.
Р1асе йе сиЪеа ш тЬе тчасег Ьай тот 5 пшшсеа. 12. Кереас 5сера 9, 10, апт) 11 ас аигеегь!че1у Ы8Ьег сетпрегасигеа ипст1 а сешрегасиге от" 30 С аЬоче сЬе Т ь асЫечед. ! 3. Р!асе сЬе птептЪгапеа ш аерагасе 81ась сиЬеа (! 7 х !00 пип) сои!а!п)п8 1 ш! от' 2х 55С, апт) Ьеас сЬеш со Ьо!1)п8 !ог 5 пшшсеа со гетпоче апу гегпаштп8 гат)!пасс)ч)су. Соо! йе тю1ибопз ш ке, апт! сгапатег сЬетп со астп6Пас!оп гба1а. ЪЧааЬ йе гпешЬгапеа апт1 шЪеа сьев Гог ЬоП- !08 чч)сЬ 1 ш1 от'2х 58С, апт) атЫ йе ччааЬ!п8 ао1ис!опт со сЬе арргорпасе астп6Пасюп чта1з. 14.
С)ае а 1и)и!т) ас!псП1а6оп соипсег со гпеааиге йе гат!!пасс!ч)су )Ьу Сегеп)точ соип6п8, р!еаае аее АррепгПх 8) ш аП от" сЬе ч!аЬ. Са!си1асе йе ргорогсюп оК йе соса! гагПоасспбсу йас Ьая е1исет) ас еасЬ сегпрегасиге, ияп8 йе ГоПочч!08 ет!иабоп: соо с х. = ~~ и, —: ~п, '= т„,— тес ;= т,„— тес нчЬеге х !а йе Сгассюп от' соса1 гагПоас6чПу е!исе6 ас Т, и ь йе ашоипс ог гат!!пасс!ч!су ! / ! е1исет) ас ! = Т, апт) Т ь йе сегпрегасиге ипдег сопаЫегас!оп Еготп 25 С Ье1отч йе Т со т П1 30"С аЪоче сЬе Т .
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
