Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 76
Текст из файла (страница 76)
РегЬарк сЬе пюкс сг!с!са! ксер ш йе ике оЕ 8иекяпегк ь |Ье сЬоке оЕ сопл]!с!опк Еог ЬуЬг!6!гас!оп. ТЬе сегпрегасиге кЬои!6 Ье Ь|8Ь епоц8Ь со кирргекк ЬуЬгЫ|хасюп оЕ сЬе ргоЪе со !псоггесс кел)цепсек Ът пиьс пос Ъе ко Ь!8Ь ак со ргечепс ЬуЬг!6!гас!оп со йе соггесс келрлепсе, ечеп сЬоц8Ь ~с |пау Ье т!ктассЬес1.
ВеЕоге ияп8 ап о!!8опис1еос!6е со ксгееп а 1|Ьгагу, регЕопп а кепек оЕ спа1 ехрегцпепып лчЬ!сЬ а кепек оЕ пог|Ьегп ог Вепот!с 5оийегп ЬуЬ|Ы!гас!опк аге сагпе6 оцС побег 6!йегепС бе8геек оЕ кСпп8епсу !Апл]егкоп ап6 К!п8кгоп !983; ЪЧоол] еС а1. 1985). Ьа|Ье !!985) ргекепь а кес оЕ сЬеогеска! еигчек ге!а6п8 йе сегпрегатге оЕ сЬе ъчакЬ!п8 ко1и6оп со |Ье !еп8|Ь апс! Ьопю1о8у оЕ йе ргоЬе. 13ып8 йеке еигчек ак а Вц!6е, |1есегпбпе йе орсцпа! соп6!с!опк Еог бесесс!оп оЕ кел!иепсек сотр1етепсагу со сЬе ргоЬе Ьу ЬуЬгЫЬбп8 йе о1!8опис1еос!6е со а кепек оЕ пьгосе1!и!оке ог пу!оп |петЬгапек ас л!!ЕЕегепс сетрегасигек.
ТЬе тетЬгапек аге лчакЬес! ехсепяче1у !п бх 55С ас гоот сетрегасиге ап6 |Ьеп Ьпейу (5 — !О пцптек ш бх 58С) ас сЬе сегпрегасиге оке|1 !ог ЬуЪг!6!хас!оп. ТЬ!к тесЬо6, !п ъчЬ!сЬ ЬосЬ ЬуЬг!6!гасюп апл! лчак)бп8 аге сагПед оис ипл]ег йе кате сопл!!с!опк оЕ сеп|регасиге апд юпк ксгеп8й, арреагк со Ье гпоге 6!кег!т!пас!п8 йап сЬе тоге соттоп1у икел! ргосел!иге оЕ ЬуЬгЫ|хш8 ипл!ег сопл]!с!опк оЕ 1олчег ксПп8епсу ап|1 лчакЬ|п8 ипдег сопл]!с!опк оЕ 168Ьег ксг!п8епсу. 1Е спа1 ехрегцпепск аге пос рокк!Ые, ек6гпасе йе гпе!с|п8 сегпрегасиге (Т ) ак Ео!!олчк: 1.
Са1еи1асе йе пцпцпшп СЕС сопсепс оЕ сЬе о1!8опцс1еос!Ве, акялпцп8 |Ьас А ог Т ь ргекепс ас а11 роясюпк оЕ агпЪ|8шсу. 2. !)ке СЬе Ео!1олч!п8 Еогпш!а Со са1еи!асе йе Т оЕ а доиЫе-клгапбед ЕЛ)к)А лч!СЬ СЬе са!еи1аге6 С'*+С сопсепс; Т = 8!.5'С+ 1б.б !!о8ь!Ха~]) + 0.4!(9о]С+С]) — !500!и) лчЬеге и Ь |Ье пшпЬег оЕ пис!еосЫек. ТЬе сепп 500|и ь депче6 Егот а сотр]1ас!оп ]НаП ес а1. 1980) оЕ теакцгетепск, Егот кечега1 !аЬогасопек, оЕ сЬе еЕЕесс оЕ дцр!ех !еп8й оп те1|ш8 сеп|регасиге. ТЬ!к Еогпш1а оп1у лчог]гк Еог Ма| сопсепсгас!опк оЕ 1.0 м ог 1екы 3. Са1ги!асе |Ье тахипшп апюипс оЕ рокк!Ые т!ктассЬек аккцт!п8 йас а!1 сЬокек оЕ |!е8епегасе собопк аге !псоггесс. 5иЬ|гасс 1 С Сго|п йе са!си]алел! Т Еог еасЬ 198 оЕппыпассЬ.
ТЬе геки!6п8 пшпЬег кЬои!6 Ъе |Ье Т оЕ а гпахнпа11у пиктассЬед ЬуЬгЫ Еогтел] Ьеслчееп йе ргоЬе ап|! !ь саг8ес УХА кес!иепсе. А1п|окс сегса!п1у, йе ассиа1 Т лч!11 Ье Ь|8Ьег |Ьап |Ьас рге6!ссе6 Ьу й|к лчогкс-саке са!еи!а6оп. !Е йе Ьакек |ье6 ас роясюпк оЕ а|пЬл8шсу лчеге сЬокеп ас гапг]огп, опе оис оЕ Еоиг кЬои!д Ъе соггеес, апг) арргохцпасе!у Ьа!Е оЕ сЬеке лчои!й Ье ехрессел] со Ъе б ог С. ТЬе оЬкегче6 Т кЬои16 |ЬегеЕоге Ъе к!8п!Елсапс!у Ь!8Ьег йап йас експпасей Ноъчечег, со т!и!т!хе сЬе г!к]г оЕ пцкяп8 сЬе с!опе оЕ шсегекс, и ь Ъеы со ЬуЪг!6!хе ап|1 ъчакЬ ас 5 — 10'С Ъе1о|ч сЬе Т ексцпасе|1 ак декспЬед аЬоче. 1Е, цпдег йеке соп6!с!опк, йе ргоЬе ЬуЪг!6!хек !п6!ксг!т!пасе!у, гереас сЬе ЬуЪг!6!гас!оп ас а Ь!8Ьег сетрегасиге ог лчакЬ ипйег соп6!с!опк оЕ Ь|8Ьег кспп8епсу.
Сиекяпегк геасЬе6 йе!г Ье!8Ь| оЕ роро!апсу ш сЬе тЫ 1980к, а 6|пе ччЬеп йе Е)еф1!п8 гесотЬ!папС Р!к)А сотрап!ек |чеге л]екрегале!у Сгуш8 Со с!опе 8епек оЕ соттегс!а] ча1ие. сРХА ап6 Вепот!с с!опек оЕ п|апу ике6л! Вепек лчеге оЬса!пел] |!ипп8 йь рег!ос1.!п гесепс уеагк, Ьолч- Епг одисгйи 10.9 ечег, Виеяяшегя Ьаче Ъееп ес1!Ряег( Ъу ргоЬея Вепегагед (п РСВя ия(п8 яегя оЕ гедипдапг рпшегя. ТЬь !я с)6ейу Ъесаияе РС)(-Ьаяеб шегЬог)я гел)и)ге Еаг яЬоггег !гас!я оЕ ипагпЪл8иоия анино асЫ яециепсе. Ь)ечеггЬе!еяя, лчЬеп ап апнпо асЫ яег)иепсе оЕ яийк(епл 1еп8гЬ (я ача(1аЫе, 8иеяяшегя гегпаш йе ргоЪея оЕ сЬоке. ТЬеу Ьаче а яггоп8 !гас)с гесог6 оЕ яиссеяя апд аге Егее оЕ гЬе аг6- Еасгя гЬал РСВ сап ч(я!г ироп ечеп лЬе Ъеяг оЕ шчея68агогя. !ЗМУЕКЬАЬ ВАБЕ$ !3шчегяа1 Ьаяея Ьаче гебисе6 Ьубго8еп-Ьопг((п8 ярес!Еле)гу ап6 сап йегеЕоге "ралг" чч)гЬ пагига1 Ъаяея аг роя!6опя оЕ ашЬ~Ви!гу чч)гЬоиг г))ягирг!п8 гЬе РЫА л!ир1ех.
Рог ьечега1 уеагя, йе "ип)- чегяа1" Ъаяе оЕ сЬоке Ьая Ьееп йе риппе пис!еояЫе (поя(пе, лчЬояе пешга1 Ьаяе, ЬурохапгЬ(пе, Еоппя ягаЫе Ьаяе ралгь чч(гЬ сугоя!пе, йупппе, ап6 а6епше. Весаияе оЕ йе аЬяепсе оЕ а 2-апппо 8гоир, Ьаяе ра(пп8 Ьеглчееп (поя(пе ап6 сугоя!пе шчо!чея гччо Ьуг)го8еп Ьопйя (ая ш А:Т Ъаяе ралгя) (пягеал! оЕ гЬе гЬгее гЬаг оссиг ш С:б Ьаяе ра!гя (Согйе!6 ег а!. 1987; Хиап апл! ЪЧеЪег 1992). 1п шояГ оГЬег геяресля, Ьолчечег, шоя(пе ЪеЬачея 11)се Виапоя(пе: ° 1пояпе оссигя пагига1!у ш гЬе Вгяг (лчоЪЫе) роябоп оЕ яогпе гКНАя, лчЬеге и ралгя чч!гЬ айепоя(пе лп алЫЬюп го суг!6(пе апг) иг!6(пе, гЬе пис1еояЫея йаг поггпа!!у ра!г лч!гЬ Виапояпе ш гЬаг роябоп (Спс1с 1966).
° 1пояпе (я аЬ(е го оссиру гЬе шнЫ!е роябоп оЕ йе апг!собоп лчЬеге и а8а!и ра(гя чч!гЬ абепояпе (Е)ач(я ег а1. 1973). Нолчечег, лп !поя(пе:абепоя!пе ра(гя !п В-1)ЫА дир1ехея, )поя!пе аг1оргя а йаия (ап6) опепгагюп лч(гЬ геяресл го йе Еигапояе гполегу, лчЬегеая адепоя!пе (я ш йе яуп соп68игалюп (Согйе16 ел а1. 1987). ТЫя )я я!пп1аг Го ГЬе аггап8егпепг йаГ )я Еогшеб ччЬеп Виапоя)пе пняра(гя лч(ГЬ ал(епоя(пе (Вголчп ел а1. 1986).
° Ро!у(г!) ап6 ро!у(61) Еопп Ье!кея лчЬЬ ро!у(гС) ап6 ро1у(ЙС) гЬаг аге ягаЫе епоиВЬ го яегче ая Сешр1алея и61гае6 Ьу чаг(оия Рс)(А ап6 ЕЛЫА ро!угпегаяея. ТЬе епхугпея сап шсогрогаяе сусоя)пе !пго гЬе ро!угпепхагюп ргодисгя (Еог геч!еъч, р1еаяе яее Ре!яепЕе!6 ап6 М1!ея 1967; На!1 ег а!. 1985). Роо!я оЕяупйе6с о1!Вопис1ео66ея апс) Виеяяшегя сопла(п!п8 (пояпе Ьаче Ьееп пьем ехгепя(че1у ая ЬуЪгЫ!хаг!оп ргоЬея го ясгееп сРЫА ог Вепогпк!!Ъгаг(ея Еог Вепея епсосВп8 ргогелпя лчЬояе анино асЫ яел)иепсе (я оп!у рагг1у (илолчп. Нолчечег, а1йоиВЬ (поя(пе )я аЫе го Еогш Ьуг)го8еп Ъопбя чч!гЬ гЬе гЬгее огЬег пис!еогЫея, лЬе геял16п8 Ъаяе ралгя аге 1еяя ягаЫе йап йе еци)ча!епг 8иапоя!пе-сопса(п(п8 Ьаяе ра(гя (Маг6п ег а!.
!985). ТЬе ше!6п8 сешрегагигея оЕ л!ир1ехея сопгашлп8 !поя(пе чагу ччЫе1у берепсВп8 оп гЬе Ьаяе го лчЬ|сЬ гЬе апа!о8 !я ра!ге6 апс1 оп гЬе яиггоип61п8 яег)иепсе. 1п гЬе лчогяг саяе, йе пле!6п8 гегпрегагиге оЕ яупгЬегк о1!Вопис1еогЫе г)ир!ехея синга!п(п8 (поя!пе оррояге апу Ьаяе шау Ье бергеяяе6 Ъу 15'С, ччЬ~сЬ согге- яропсЬ го а ЙЕЕегепсе ш Ъаяе ра!г ягаЪл16у оЕ 2 — 3 1сса1 пю!е (Магбп ег а1.
1985; Каччаяе ег а1. 1986). А!гЬои8Ь йля ягиагюп гя 1еяя гЬап Ыеа!, Ь Ьая яигрг!я!п8!у Еелч ргасгка! сопяег)иепсея: 1поя(пе-сопгашш8 о1!Вопис1еогЫея Ьаче Ъееп ияе6 яиссеяяЕи!1у со с1опе шапу Вепея Егош Веполпк ап6 с)3ЫА 1(Ъгапея оЕ Ь|8Ь согпр1ехЬу (е.8., р!еаяе яее !ауе ег а1. 1983; ОЬгяи(са ег а!. 1985; Та1саЬаяЬл ел а!.
1985; Вгау еГ а1. 1986; Ыа8ала ег а1. 1986). ТаЬ)е 10-1 соплалпя а !гял оЕ со6опя ГЬал аге гесошшепдед ччЬеп г(ея!Вп!п8 о118опис1ео6дея йаг аге со Ъе ияе6 го ясгееп ргнпасе ог шапнпа!(ап сРЫА 11Ьгапея апг) гЬас сопсаш !поя(пе ас роя(г(опя оЕ ашЬл8шгу. ТЬе гесопипепдаг!опя са)се шго ассоипг гЬе пагига1 ияа8е оЕ солоня (п Ьшпап Вепея апс1 гЬе Еасг йаг гЬе яел)иепсе Срб !я ипйеггергеяепсед ш Ьшпап РЫА. Рго1осо! 1 Рипйса6оп о1 5упйе6с О!~цопис!ео6с!еь Ьу Ро!уасгу!атйе Се! Е!ес1горйогеыь о сгятент лхс Рхе5кмт-олч лотомлтю Рйл 5чнтнс5!лх5 йас о1!Вопцс1еосЫех цр со -25 пцс!еос!без 1п 1еп8й 8епега1!у с!о пос сопса!и яйшйсапс с)цапссс!еа оЕ сгцпсасес) РЬСА Ега8тепса апсс Ьепсе с)о пог тес!и!ге рцпйсаСюп Ъу Ве! е!есСгорЬогеяя РцпйсаСюп ь а1ао цппесеааагу ччЬеп о1!Вопцс1еосЫеа >25 пцс!еосЫез сп 1еп8й аге паем аз ЬуЪгЫсхасюп ргоЬез ог !п осЬег с!гсшпхсасссез счЬеге ап о1!Вопцс1еосЫе оЕ ехасс!еп8й !а пос гес)ц!тес) !Р!еазе атее СЬарсеь 3, 6, апс1 14).
ТЬе!оп8ег йе о118опцс1еосЫе, йе Вгеасег йе сЬапсе сЬас 6 ич1! Ье сопсапцпасес1 со а я8- и!6сапс ссе8гее чч!сЬ йе Ьу-ргодцссх оЕ тсогпр!есе аупйеях. Аз а гц1е оЕ сЬшпЬ, о68опцс1еосЫеа >25 пцс1еосЫеа! оп8 аЬоц16 Ъе рцг)Егер Ьу ро1уасгу!атЫе Ве! е1ессгорЬогеяя аз аЬоц16 о1!Вопцс!еосЫеа оЕ апу 1еп8сЬ сЬас у!е!д апогпа1оца гегш1ь сп ехрейгпепь ччЬеге сЬе ехасс 1еп8сЬ оЕ йе о!!Вопцс1еосЫе ь ипрогсапс, Еог ехагпр!е, !п ргппег ехсепяоп ехрегипепь со тар сЬе 5' сегпи'- п1 оЕ трчХАз !Р1еахе атее СЬарсег 7, Ргососо1 12), аа а хес!цепссп8 рптег !СЬарсег ! 2, Ргососо1я 3 — 6), со акр)!Еу ппсгоаасе11!се гпаг1сегз сп гпапппайап Вепотех !р!еахе хее СЬарсег 8), апсс аа а ргоЬе !п Ве! гесагс)айоп аааауа !СЬарсег 17, Ргососо1 2).
Айег е1ессгорЬогеяя йе о1!8опцс1еосЫе Ь е1цсес1 Егопс сЬе Ве1 апс! сопсепсгасес1 Ъу: ° Есйаио1 ргессрссас)осс. ТЬЬ ргоседцге ъчог1са еЕйс!епс1у ргочЫесс сЬе чо1шпе оЕ сЬе Ес!сегес) е!пасе (р1еазе хее 5сер ! 7 оЕ сЬЬ ргососо1) ь гейкед Ьу гереасес1 ехсгасс!опх ъч!сЬ и-Ьцсапо! апс) СЬе о1сйопцс!еоСЫе 1х 1оп8ег йап !8 пцс1еоСЫеа !Р1еаае аее Аррепрйх 8). ° ЯечегзегЕ-р)сахе с)гготасо8гар)гу оп 5ер-Ра)г Сь со1шппа !ссесайес1 !п сЬ!а ргососо1). ТЬезе со!шппа аге ача!!аЫе 1п ргерас)гесс Еопп апс1 аге еазу Со сье ъчЬеп йсССес1 Со йе епгс оЕ а аупп8е Ъагге1. 1сю!асюп оп 5ер-Ра1с Сь со1шппь са)сеа 1оп8ег сЬап ейапо1 ргессрйасюп, Ьцс сс счог!гх еЕ6с)епс1у чч)сЬ о1!Вопцс1еосЫеа оЕ а11 1еп8сЬа апс) усе)йа ргерагайопа оЕ ЬсВЬег рцпсу. ТЬе спейос) с)еса!!ес) сп сЬ!а ргососо1 ь сьев со рцпЕу стоите яупсЬессс о68опцс!еосЫез Ьу е!сссгорЬогеа!з сЬгоц8Ь 8спасцг!п8 ро!уасгу1атЫе 8е1я Ь Ь а пюс66сайоп оЕ а ргоседцге йече1- орес1 !и МкЬае! 5тссЬ'а !аЪогасогу !Ршчегясу оЕ ВПсЬЬ Со1цтЬса, чапсоцчег, Вг!с)хЬ Со1цтЪса) сЬас Ьах Ъееп сп цзе Еог тоге сЬап 20 уеагя ТЬе тесЬос) Еог гесочегу оЕ о!с8опцс!еосЫех Егогп ро1уасгу!атЫе Ве1а ъчах ргочЫесс Ьу )еЕЕгеу Согпиег !!)и!чегясу оЕ Техаа 5оцсЬсчехсегп Месйса! Сепсег, Ра11аа).
Рог асЫсйопа! счауа оЕ рцг!Еу!п8 о1!Вопцс1еосЫея р1еаае аее йе ЕпЕоппагюп рапе1 оп МЕТНО05 05Е0 ТО РС18СГг' 5УНТНЕТСС ОС!СОЬПЗССЕОТ!0Е5. 10.11 10.12 СЬаргег 10: ИгогЕ!п5 и |)Ь Вуп(аепс О11цопис)еог(г(е РгоЬеь МАТЕК1АЕЬ САНТ!ОХс Р)еаъе ъее Аррепс))х 12 Еог арргорг1а1е Ьап|$11пе оЕ гпасепа!ъ таг1сес) и|11Ь <1> Войег5 апе! ао1011оп5 Р1еаье ъее Аррепс))х 1 Гог сои| ропепП оЕ 91ос)с ъо!и1юпь, Ьийегь, апс) геаеепсь. 011и1е ъсосЬ ъо)ипопь Со 1Ье арргорпа1е сопсеп1гасюпь. ТЬе иае оГ ъсеп1е, Е!11егес) Н О (М)В1-О ог ес)и)иа1еп() ь гесопипепс)ес).
Асесол!Гг!!е <1> ()ъе 10 т1 оЕ Ь(ВЬ-регЕогтапсе 1и!иЫ сЬ|отасоВгарЬу (НРЕС)-угас)е асесопьп(е Еог еасЬ 5ер-Ра1| со1- игип. Апипол!игп асесаге Г70 М) 1)ъе 2 |п) оЕ 10 тМ агпгпошшп асесасе ю1исюп Еог еасЬ Вер-Ра)с со1игип. и-Ви(апо! <! > Еогтат!г)е де1-!оас((пВ Ьиууег иг(ЕЬоис !гас(с!лВ с!уеъ <! > Се1-)оайпц Ъи((ег сопя|с| оГ ипй)исес) ЕоппатЫе иг(сЬоис сЬе июа1 сгасппц с)уеъ (ЬгопюрЬепо) Ыие апс)(ог ху1епе суапо) Ер). Е|о пос а|Ы сгасЫпВ г)уеъ со |Ье Ве1-)оайпц Ън((егс сЬе г)уеь ог сопсапнпапсь |п сЬегп |пау пиВгасе ас сЬе сасне гасе аъ сЬе о)15оиис1еосЫе апг) |псег(еге се(сЬ гь г)есесс)оп Ьу аЬюгрВоп оЕ 1)Сг 115Ь| (р1еаъе ъее 5сер 14 оЕ ргососо1). 1Е |)еягей 0.290 огапВе 6 сап Ье (пс1нг)ес) |п йе Ве1- 1оаг))пц ЪиЕЕег.
ТЬ|ъ |1уе т)Вгасеь и|1|Ь |Ье Ъи((ег Сгопс апг) |)ось пос |псегЕеге иисЬ г)есесс(оп оЕ сЬе о115опис1еосЫе. Еогтат!с(е-!гас)с(пе с!уе т)а(иге ТЬ|ъ ю1иВоп ь а 50:50 пихсиге оЕ Еоппа|пЫе апг) ап аг)иеоиъ ъо1шюп о( сгасЫпц |Еуеь (0.05% ху1еие суапо) ЕЕ апс) 0.0596 ЬгопюрЬепо) Ыие). 1| ь наес) аъ а яхе ъсапс)агг) ш сге1)ь аг))асепс со йоъе сон!а(шпВ йе о1(цопис!еос!ие ргерагаВоп. Ме(аало!|Н О ъо1иВоп <! > СогпЪ|пе 6 т) оЕ гпесЬапо1 иисЬ 4 гп) оЕ Ег!сег-ъсег)1)гег) М(!1(-О Н О. С)ъе 3 гп) оЕ тесЬапоЬН,О ъо1иВоп Сог еасЬ 5ер-Ра)г со1ип|п.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
