Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 59
Текст из файла (страница 59)
Гог ип(споип геааогь, о(|копис1еот(деа ъч(1Ь а с)аоа!пе геа|т$ие а1 1Ье|г 5' теггп!п! аге 1аЬе1ет| ! (оиг(о!т| 1еаа ей!оепбу тйап о11допис(еот|деа Ьек(пп(пк ъиб! А ог Т, апт$ ых|о!д |еда е(й!с(еп(1у (Ьап о(|копи-, с1еобдеа Ьеьпп|пд ъи(Ь С (чап Ноитеп ет а!. 1998).
5огпе 0 МА 1егп р|атед, твсЬ аа ауптйебс о(|копие(еот|деа, с$о пот Ьаче 1о Ье тгеатет| иа(Ь а рЬоарЬатаае епхугпе Ье|оге (т|пау|пВ О(|копие(еот(деа аге а(гпоат |пчапаЫу ауптЬеа|хед ипб! а (гее 5 -Ьут$гоху! к!пир. Весаиае 1Ье рЬоарЬогу1абоп геасбоп ь гечега|Ые, Т4 ро(упис(сот|де Ыпаае и46 сета|ухе дерЬоарЬогу|абоп о( 5 ' теггп|п| |и тйе ргеаепсе о( а пю! аг ехсегь о( а лис!еотЫе !6рЬоарЬате ассертог, аисЬ аа АОР (чап де 5апде ет а$. 1973).
ТЬе аесопд гпетЬод от 13Ье(|пе йЬе ехсЬапке геастюп) иаеа Ьо(Ь 1Ье тогъчагс| апд гечегае геасбопа сата!ухед Ьу тйе епхугпе. ° 1л Изе ехсйалде геаобол (Рготосо| 16), 1Ье ип$аЬе$ед рЬоарЬате геа|диеа аге тгапдеггед (гогп 1Ье 5' теггп|п| о! 0 МА то АОР ТЬе пеъч| у сгеатед 5 '-Ьудгоху$ гед(6иеа аге 1Ьеп герЬоарЬогу1атед аа т$еаспЬед аЬоче !и 1Ье (опчагд геасбоп. Весаиае Т4 ро|угвс|еотк1е Ыпаае ип!! и ог1т, а!Ье|1 !пей)с|епбу, |и геатбсбоп Ьийега, 1Ье ехсЬапде геасбоп сап Ье сагдед оит а1 тйе аагпе Ьгпе аа геатпстюп о( 0МА и $1Ь епхутпеа бтат делегате рготгид|па 5' тепп|п|. ТЬе геди(бпк 0МА сап Ье тьет| 35 гад|о(аЬе!ед Ыхе гпадсега (ог ее( е(естгорЬогеа|5 (Оогпгпеп ет а|. 1990).
5'РСргарС 3' гогиаг ехссапде геастюп тгеа! О а!Кадо !псоЬате и!ЕЬ Ьастепорпаде Т4 ро!упса!ест!Ое Ь пасе апи АОР 5'онСРОрС..... 3' !пссЬате чаю Ьастегюроаде Т4 ро!упса!еотье Впаае апи |.Г згР|АТР !аЬе! иаа Ьас!епорпаде Т4 ро!упос!еоаие Ыпаае апе |Т-лр|дАТР АОР +*рСРОРС 3' АОР а 5' *РСРДРС 3' Г1С()КЕ 9-4 Еогъчагд апд ЕхсЬап е Кеас1|опа о! Вас1едо Ьа е Т4 Ро| пис1ео1|де тъ(паде Тъчо д(йегепт геасбопа сата(ухед Ьу Ьастег|орЬаде Т4 ро|упис|еотйе Ыпаае сап Ье иаед 1о |аЬе| 1Ье 5' теггп!п! о! 0МА пю|есЫеа. ТЬе 1огъчагд геасбоп 'ь 5Ьоъчп |и 1Ье |ей аггп о( тйе йтйиге, апд 1Ье ехсЬапде геастюп 'ь 5Ьои и !и (Ье г(ВЬ1 агп!. Еог де!а|!5, р!еаае аее техт. 9.6В СЬарсег 9| Ргерага6оп о)" Яа|Е)о!аде!егЕ Е)ИА ап|Е ЯИА РгоЬея МАТЕК!АЕ5 САЕ)Т1ОЫс Р!еаье ьее Аррепг!1х 72 Еог арргорпасе Ьапс!1!па оЕ п|асепа)ь таг!сес! илсЬ <1> Воггег5 апе! 5о!66оп5 Р1еаье ьее Аррепс))х 7 Еог соп|ропепСь оЕ ьсос)с ьо)06опь, Ьийегь, апс) геааепСь.
01101е ьСос!с ьо1и6опь со !Ье арргорпасе сопсепсга6опь. Агптоп|игп асесаСе 170 М) Орсюпа1, р!саве вее 5сер 3. ЕОТА 10.5 М, рН В.О) ЕЕЬапо1 Епкугпе5 апе! Войег5 ВассегсорЬаВе Т4 ро)упис!ео!1г)е Ыпаье )4|)Ы-суре ро1уппс1ео|Ые Ыпаяе Ь а 5'-РЬоярЬосгапяЕегаяе апс) а 3'-РЬоярЬасаве ЕЕ|ереяг апг) Соггагеа| 1974; 5)госЫп ес а1. 1978). Нояеечег, пшсапс Еоппв оЕ йе епсугпе (Са|пегоп ес а1. 1978) аге со|п|пегс)а11у а| аааЪ)е Ее.8,, ВоеЬпп8ег МаппЬепп) сЬас!ас1| |Ье РЬоврЬасаяе асс)ч)су Ьш гесаш а Еп!1у ЕопсВопа1 РЬоярЬосгапвЕегаве.
ЪЧе гесо|пп|еп|1 |Ьас сЬе пппапс Еопп оЕ йе епкуше Ъе пьес) Еог 5' 1аЪе1|п8 яеЬепехег рояв)Ыес 10 — 20 пшп оЕ |Ье епгуше аге гес)шгес) со саса!уге йе РЬоярЬогу1асюп оЕ 10 — 50 рпю!ев оЕ с)ерЬоврЬогу!асяс) 5'-ргосгойп8 сеппш|. 70х ВасСег)орПаце Т4 ро)упис)еос)с)е )с1паье ЬиЕЕег Вас!!оас6че Сопсроопе!5 17-всР)АТР 170 гпС|)т1, ьр. асс. 3000-7000 С1)тто1е) <1) То пппппае ргоЫешв сапяес) Ъу гасао1уав оЕ |Ье ргесигюг апс) |Ье ргоЬе, Ь Ь Ъеяс, сеЬепечег рош|Ые, со ргераге гас))о)аЪе!ег) ргоЪея оп йе |)ау йе ! "Р)|)ХТР агпчея ш йе )аЪогасог у.
Бресса! Ее!шргпеМ ЕЕдшгЕ ьстВВапоп ьрессготесег, сараЬ)е оЕ диапс)ЕуспВ в|Р Ьу Сегеп)сон гаопапоп ВерЬаг)ех С-50 ьрип со!итп, еди111ЬгаСес) |л ТЕ ЕрН 7.6) ог 5ерЬаг)ех С-50 со)итп 17 т)), едш1|Ьгасег1 |и ТЕ ЕрН 7.6) ВосЬ орсюпа1, р!саяе яее 5сер 3. МЕТНОО 1. !и а т)сгоЕиае сиЬе, ппх сЬе Ео!!осе)па геацепеп г)ерЬоврЬогу1агес) Е|74А 1Ох ЪассегюрЬа8е Т4 ро1уппс!ео|Ые Ыпаве ЪпЕЕег 10 гпСВп|! !у-||Р)АТР !яр. асс. 3000-7000 Српппо1е) ЪассегюрЬа8е Т4 ро!уппс!еосЫе Ыпаяе Н,О 10 — 50 рпю!ея 5 С|1 50 рпю1ев 10 пп)св Со 50)с! Мос!е!с Асн!5 апе! О!коппс!ео1!е!е5 Е))Я)А 170 — 50 рп|о)еь) ТЬе ОНА яЬоп)о Ъе г)ерЬоьрЬогу)асес) ав с)евспЪес) ш Ргососо! 13 ог вупсЬеяае|1 ся)сЬ а 5'-Ьу|)гогу! гпо|есу. Р!еаяе яее СЬе рапе! оп САЕСС)ЕАТ)ЫС ТНЕ АМОЕ)ХТ ОГ 5' ЕЧП5 1Ы А О)Я)А 5АМРЕЕ ш РгоСосо! 13.
Рго1осо~ 15 РЬоьрЬогу!а6юп ог УМА Мо!есЫеь млй ОерЬоьрЬогу!а1ес! и!ип1 ЕпсЬ ог Кесеььес! 5 Тегт!и! а мА 5иввтвлте5 сч!Тн вгслсчт есчО5, весе55еО 5 ' тевм!ч, ог гпгегпа1 п)с)са аге )аЪе)ед !еаа еЕйсгепг1у гп йе Еогсчагд геасбоп сага!умед Ьу Т4 ро1упис!еоГЫе Рдпаье йап аге ргосгисйп8 5' Гегпиш оЕ доиЫе-аггапдед РХА.
Рог ехапгр)е, йе 1псогрогабоп оЕ РЬоарЬаге геяс1иеа аг шгегпа1 пк)са )п РХА гв 30-Ео1д !еаа еЕЕгс)епг йап ггапаЕег го 5' гегпиш (111!еЬаи8 ег а1. 1976; Вег)спег апд Ро!)с 1977). Ноъчечег, гЬе сйй)си)гу оЕ )аЬе11п8 аисЬ аиЪаггагеа сап Ье очегсогпе Ъу (1) 1псгеаяп8 йе сопсепи атюп оЕ АТР Го аатгопописа) )ече!а ()100 РМ) (161еЬаи8 апс1 К1ерре 1975а) ог (2) спс1исйп8 ро!уапнпеа ог ро!уеГЬу!епе 8!усо1 8000 (РЕО 8000) гп ГЬе геас6оп (ЬВ1еЬаи8 апд К)ерре 1975Ъ; Нагпаоп апд У)шшеппап 1986а). 1п гЬе ргеаепсе оЕ РЕ6 апд ша8пеяшп, РХА со1!араеа 1пто а Ь~ВЫу сопдепаед Яасе (1еппап 1971). ТЬе шсгеааес1 ейксепсу оЕ йе аиЪаес)иепГ РЬоарЬогу1а6оп геас6оп Еа гЬои8ЬЕ го Ъе а сопаес)иепсе оЕ йе геаи!6п8 пгасгопю1еси1аг сготчдш8 (Нагг)аоп апд Улпипеппап 1986Ь; Еог геч)етч, р1еаае аее Улпипеппап апс1 Мгпгоп 1993).
ТЬе апюипс оЕ аг!ши!аг)оп !а сгисса11у дерепс)епг оп йе сопсепггабоп оЕ РЕО. 11 шау йегеЕоге Ъе иаеЕи! го гея гЬе ейк)епсу оЕ йе геасгюп !п сопсепггагюпа оЕ РЕС гап81п8 Ьегъчееп 496 апс1 10%>. ТЬе Ъепейс)а) ейесь оЕ РЕО оп1у Ьесогпе аррагепг ъчЬеп ияп8 РХАа )оп8ег ГЬап 300 Ьр. 5гпа11ег Ега8шепта оЕ Р)с)А аге ргоЪаЫу соо п8Ы го со1!арае гпго а сопс1епаед агате. Рог асЫг6опа1 шЕоппабоп оп )аЬе1ш8 РХА сч)ГЬ Т4 ро)упис1еоГЫе Удпаае, р1еаае атее йе рапе) оп ЕАВЕЕ- 1!с!О тне 5 тевм1н1 ОГ О!с!А чтс1тн ВАстеиОРнАОе т4 РОетхОсееОт10е к1нА5е )п гЬе шггос)ис6оп го Ргососо) 14. Рог а яигипагу оЕ гпегЬосЬ паем го 1аЬе1 йе гегпиш оЕ РХА, р1еаае атее ТаЫе 9-2 сп Ргогосо1 10.
1п гЬ)а ргогосо1, РЕО )а спс1идей а1оп8 сч)гЫщЬ сопсепггаг)опа оЕАТР апд ро1упис1еогЫе Ыпаае, го епЬапсе гЬе 1аЬе!сп8 оЕ РЯА Ега8шепга сч)гЬ Ъ)ипг-епдед ог 5'-гесеааес1 гепгип). МАТЕК1АЬЬ САРТ)О!с): Р1еаае атее Аррепд!х 12 Еог арргорпаге Ьапд11п8 оЕ шагег)а)а шагЕед сч)й <! >. ВггЕЕег5 апг! Ьо!гг11огг5 Р1еаае аее Аррепд1х т Еог сотропепта оЕ атос)с ао)итюпя Ьийегь, апд геайептя Р11ите атос)с ао1ит)опт 1о йе арргорг)ате сопсепгга6опя Агпгпопсит асесате 110 М) Ордопа!, р1еаье атее 5гер 5. 9. 70 Ргогосо! 15: РЬогрЬогу!апоп о1 Р11А Мо1еси(ег сий ЕуерЬогрЬогу!асег( В!ипсВпгЬ ог Кесехгег( 5' Тегт(пг 9.71 ЕВТА (0.5 м, рН В.О) Ейапо! 70х !т!с(ако!е ЬОЕЕег 500 пгм ипЫахо!е С! (РН Ех4) 180 шм МВС!, 50 гпм с1ЬЬюсЬгепо! 1 шм арепп!66пе НС! 1 шм ЕРТА (РН 8.0) Ро!уеСИуlепе ц!усо! (24% и А РЕС ВООО) т НгО Епхуспе5 апс! Вссйег5 ВасгепорЬаце Т4 ро!упис!еог!с(е Ес(пахе СН(!йсуре ро1уппс!еосгае раиаае са а 5'-РЬоарЬосгапа(егаае апс( а 3'-РЬоарЬасаае (Верею апс) Сохгаге61 1974; 5(го!Лап ес а1.
1978). Ноюечег, пшсапс Еоппь оЕ сЬе епхугпе (Сагпегоп ес а1. !978) аге сопииегсса1!у ачаг!аЫе (е.ц., ВоеЬппцег МаппЬеип) йас 1ассс сЬе РЬоарЬасаае асбчгсу Ьис гаса)и а Еи!1у 6лпсВопа1 РЬоарЬосгапа(егаае, суе гесопсшепс) йас сЬе пшсапс Еопп оЕ сЬе епхуше Ье иаес) Еог 5' 1аЬе1гпц юЬепечег розяЫе. Ь]ос!е!с Ас]еЬ апе! О!коппс!еоЕЫе5 Е)(с)А (70 — 50 рто1еь т а но!ите оЕ <77 р0 РерЬоарЬогу!асс сЬе ВЬСА аа Вессс!Ьес) гп Ргососо! ! 3 ог аупйеяхе члсЬ а 5'-Ьуг)гогу! пюсесу, Р!еаае аее сЬе раис! оп САЕСВЕАТ!ЬСС ТНЕ АМО()ЫТ ОЕ 5 ' Е)г(В5 !)г( А ВС4А 5АМРЕЕ ш Ргососос 13. Кайоас1ссге Сопсросспс!5 !у-~~Р!АТР (70 тСг(т1, хр.
асг. 3000 Сс)тто!е) < ! > То псшипые ргоЫеига саиаес) Ъу гаепо1уяа о! сЬе ргесигаог апс) сЬе ргоЬе, Ь ь Ьеас, юЛе пене г роаяЫе, со ргераге гайо!аЬе1ег( ргоЪеа ои йе Вау сЬе [гср]г(14ТР агггчеа си сЬе 1аЬогасогу. орессаl Ее]сс]рпсеп$ Е(ди(с( ас!пс!!!ас!оп ьрессгогпегег, сараЫе оЕ диапсгуу!пц ~гР Ьу Сегеп)сон гасбаВоп 5ерЬаг)ех С-50 хрип со!итп, еди(ВЬгагес) гп ТЕ (рН 7.б) ог 5ерЬаг(ех С-50 со!итп (7 пс!), едиЕ!(Ьгагес( т ТЕ!рН 7.б) ВосЬ орбопа1, р!еаае аее 5сер 5. МЕТНО0 1.
1п а ппсгоупце сиЬе, ппх гп сЬе огг(ег цгиепг с(ерЬохрЬогу!асес) В)4А 10-50 рпю!еа 1ох ипгааго!е Ьийег 4 Сс) Н,О Со 15 р) 24аА (ю(ч) РЕС 10 а! 2. АсЫ 40 рто1ек оЕ [у-"Р]АТР (10 тС1(т!1 ар. ас1. 3000 Сйпспо!е) со йе сиЪе апс! Ьппц йе Впа1 но!пте оЕ йе геассюп со 40 р1 сн!ЕЬ Н О. Иеа!1у, АТР аЬои18 Ье ш а Есче(о!8 пю1аг ехсеы очег Ру(А 5' епсЬ, апс) сЬе сопсепсгасюп оЕ В)4А сегииш аЬои16 Ье >0.4 им. ТЬе сопсепсгабоп о! АТР ш йе геасбоп аЬои!8 сЬегеЕоге Ье >2 Ссм, Ьис сЬЬ Ь гаге!у асЬгечаЫе ш ргас6се. То шсгеаае йе арес!6с асбчгсу оЕ сЬе гас(со!аЪе!ег) ВЕСА рпк1исс, шсгеаае сЬе агпоппс оЕ [уАгр!АТР иаег1 ш йе РЬоарЬогу1асюп геасс1оп.
Ресгеаае сЬе чо1игпе о! Н О со шашсаш а геассюи чо1ише о! 40 81. 3. АсЫ 40 ишп оЕ ЪассепорЬаце Т4 ро!упис1еосЫе Ыпаае со йе геассюп. М(х йе геацепса цепс1у Ьу сарршц йе сбс!е оЕ сиЪе, апс] ]псиЬасе йе геас6оп Еог 30 пппспеа ас 37'С. Рпоьрпогу!а6юп о1 0МА Мо! ест! еь ъий Рго1гис~~пд 5 Тегт~п~ Ьу Йе Ехсйапце Кеас6юп не ехснлнсе келст)Он слтлгчгео вч влетев)орнлсе Т4 ро1утшс1еосЫе )с!пахе (чаи с!е Вапс)е ес с а1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
