Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 58
Текст из файла (страница 58)
МАТЕК!АЬ> СА()Т!О!х(: Р!еаье атее АррепеПх 12 гог арргорпаге ЬапдПпе о! гпа!епа1х гпаг(гег) гч!гЬ <! >. Вггйега апг[ >о!обоп5 Р!еаье атее АррепсПх ! гог согпропепга о! а!ос!г ьо!и6опя Ьиггегь, апг) геапепгя ОПиге ь!ос(г ьо1пГ!опх го йе арргорна!е сопсепгга6опя СП!огогогт <! > ЕРТА (0,5 м, рН В.О) ог ЕСТА (0.5 м, рН 6.0), )Е ияле С!Р Ейало! РПела1;сП!огогогт (7гЬ ч(4 <!> ЯЭ5 (! 0;4 гч)ч), (Е иялд СгР 9.62 Ргогосо!13: Рерйоьрйогу!аг(оп о(Г)]ч(А ргаКтелгь иг((Л А!)са!]пе РЛоьрйагаье 9.63 5ос((ит асегаге (3 м, рН 7.0 ЛГ игдир С1Р( алд рН 5.2) ТЬе 3 м ьойиип асесасе ьо1шюп ас РН 7.0 Ь ыес1 Ьесаиье ЕРТА ргес!Р)сасеь 1гопс сю1шюп ас асса РН.
ТЕ (рН 7.6) Тль-С( (7 м, рН В.5) Епкуспеь апд Выбегь Са(1 тгеьг(ла1 а(йа(те рЛоьрЛагаье (С(Р) ог 5Ллгир а((са!(ле рЛоьрЛагаье (5АР) (Е)5 ВюсЛет(са(ь, ВоеЛг(лВег (ч(аллЛе(т, ог Мог(Лспо(оп В(осЛет(са(ь) 70х С(Р дерЛоьрЛогу(аВол ЬиЕЕег ог 70х 5АР дерЛоьрЛогу1апол ЬиНег Ргогеглаье К Кеьп(сйол елкуте(ь) М]с!с!есс АснЬ апд О!коппс]еобде5 0Е(А ьатр)е (0.7 — 70 А (7-700 ргло(еьВ Рерйоьрйогу!ас!он геассюпь аге иьиа11у сагпей оис ш а чо1шне оЕ 25 — 50 и1 сопсашш8 1 — 100 рпю)еь оГ 5'-РЬоьрЬогу!асей сегпиш оЕ РМА. Ьресса! Ецосрп)епТ Яагег Ьа(Ль ог ЛеапиВ Ь(ос(сь ргеье( (о 56'С, 65'С, ог 75'С (С(Р) ог 70'С (5АР) САЕСБЕАТ1МС ТНЕ АМОРМТ ОЕ 5' ЕМ05 1М А 0МА 5АМРЕЕ Сье йе Ы!очч!па Гоггпи]аь со са1си!асе йе иигпЬег о1 рпю!еь оГ 5 епсЬ ргеьепс сп а а!чеп РМА ьагпр!е.
Рог доиЫе-Мгапдед РМА Ашоип( о1 5' епсЬ (сп ргио]еь) = (Х)(У х 660 аппо!е(Ьаье ра!г)] х 7 0сс рпю!еЫпо!е х 2 епдепю!еси!е Ч(Ьеге Х Н йе гпаьь о1 РМА йаегиеп( )и егать апс! У Ь йе !епаСЬ о1 0МА йаупепС !п Ьаье расгь. Рог ехапср(е, 7 ие о1 1)пеапгед 3-]сЬ р!аьш(д 0МА = 1 ргио!е 5 ' епдь, апд 1 ие о1 а 7-1сЬ доиЫе-ь(гапдед 0МА Егаешепг = 3 ргпо(еь 5' епдь. Еог ь(пе1е-ь(гапдед РМА рпю!е 5' еидь = (Х((ух 330 В)гпо!еспис!спиде)] х 70'ь ргио!еь)пю!е УУЬеге Х !ь йе гпаьь о1 0МА йаагпепс !и агагиь апд У Ь йе !епа(Ь оГ 0МА Егаагпепс !и иис]еойдеь. Гог ехагп- ~ р!е, 7 иа (-0.03 О0,) оГа 25-гпег о!)аодеохупис!еос!де )ь 720 ргпо!еь 5' епдь. МЕТНО0 1.
])ье сЬе геьспспоп епаугпе оГ сЬоссе со д!ееьс со согпр!едоп 1 — 10 ра (10 — 100 ргпо!еь) оГ йе 0]х]А со Ъе дерЬоьрЬогу]асей. Ройосч сЬе геьспсдоп епгупсе псапиЕассшег'ь гесопипенйассопь Гог шсиЬаиоп сине апй сегирегашге. ТЬе рго8гея оГ йе й8еьс сап Ье апа)усей Ъу айагоье 8е! е1ессгорЬогеьа, С1Р апй 5АР чд11 йерЬоьрЬогу1асе РЬ(А ас а ь!18Ьс1у гейисей е(йс)енсу сп гегапсдоп ЬиЕЕегь сЬас Ьаче Ьееп ай)иьсес( со РН 8.5 ъчсй 10х С1Р ог 10х 5АР ЬиЫег, аь Ь йопе пс йе пехс ьсер. 1Е й|ь ы ипассерсаЫе, йе геипссей РМА псау Ъе рипйей Ъу ехсгассюп чий рЬенойсУйогоЕопп апй ьсапс(агй ргессрйасюп сч(сЬ есЬаио! анй сЬеи йгаойес( сп а липина! чо!ише оГ!О гпм Тпь-С) (РН 8.5).
9.64 СЬарсег 9с Ргерагаг|оп оу лсаг(|о1аЬе!егЕ РИА аис( ЯМА РшЬел 2. РерЬохрЬогу!аге йе 5' епсЬ оЕ СЬе геагг|сгес) РХА ччгЬ е|гЬег С1Р ог 5АР. ТО ОернО5рнОкугАте РыА г)5!ыс с1Р а. АсЫ гогЬе РХА: |Ох С1Р ОерЬохрЬогу1а6оп Ьи(уег Н,О 5 р! Со 48 и| Ь. АсЫ гЬе арргорпаге агпоипг оЕ С1Р. | итс оЕ С1Р сх(11 с(ерЬоьрЬогу1асе -| ргпо!е оЕ 5хрЬохрЬогу1атд сегпип| (5'-гесесаесг ог Ыипс-епс(есг РНА) ог -50 рто|ев оЕ 5'-ргосгийп8 сегтшс. ТЬехе атоипсл тау чагух1|8Ьс!у Егот опе спапиуасыгег со йе пехс. с.
1псиЪасе йе геасг!оп Еог 30 пнписех аг 37'С, асЫ а ьесопс( а!надю! оЕ С1Р, апс( сопЬпие |псиЬасюп Еог а 6лггЬег 30 пнписея д. То шасНчасе С!Р ас сЬе епс) оЕ сЬе |псиЬабоп репос1, асЫ 5Р5 апс1 ЕРТА (РН 8.0) со (|па! сопсепггаНопх оЕ 0.598 апс) 5 гпм, гехресг|че!у. М|х гЬе геа5епгх схе11, апс) асЫ ргогеспаье К го а (|па! сопсепггаЬоп оЕ 100 )су)ш!. 1псиЬаге Еог 30 ш|пигех ас 56"С. е. Соо! йе геасйоп го гоосп сешрегагиге апс( рипуу сЬе Р)х)А Ьу ехсгасггп5 и си|се ъх|гЬ РЬепоЬсЫогоуопп апс) опсе ччгЬ сЫогоуопп а!опе. Ргосе|пасе К апс| 5Е|5 мед со |пассгхасе апс| й8ехс С1Р спас Ъе сопср!осе!у гетозе6 Ьу ехсгасс|оп ъчсЬ РЬепоЬсЫогоЕопп рпог со ялЬлесрлепс епхупсаис сгеасгпепь (РЬоьрЬогу!асюп Ьу ро!упис1еосЫе )с|паке, 1с8асюп, есс.).
А !МРОКТА(9Т А х(пц(е ехггасс!оп сМ|Ь сЫого(опп а1опе (х (пхи(Е(с!епс со гес)исе йе сопсепггасюп о( 505 го йе ро|пг схЬеге Ь по (опеег и40 |пЫЫ| ро1упис!еосЫе Ыпахе. Кипеп ес а|. (! 997) хи55ехг йас ир го Еоиг ехсгас0опх сМй сЫого(опп псау Ье гес)и(гесг. С!усо8еп ог 1шеаг ро|уасгу!атЫе (Са!!!ага апс( 5сгаия |990) сап Ье асгс(ед ас а сагпег Ъе(ого РЬепоЬсЫого(опп ехсгас6оп сЕ япа1! атоипсх оЕ ОНА (<! 00 п8) счеге илес( сп сЬе геасс|оп. )ло пос асЫ сагпег пис!есс асЫ (сагсА, ха1гпоп хрепп ЕлгсА, есс.), ах Ь ю|!1 сопсресе юпЬ йе дерЬохрЬогу!асес1 Ел!(А Еог сЬе гас!|о!аЬе!ед АТР дипп8 сЬе Ыпаяп8 геасиоп. А!сегпас|че!у, С! Р сап Ье |пасс|часеа Ьу Ьеа6п8 со 65'С Еог ЗО пиписел (ог 75'С Еог 10 пиписех) ш йе ргекепсе оЕ |О спм ЕСТА (РН 8.0) Е !МРОКТАЫТ г)хе ЕСТА поС ЕОТА.
ТО ОернО5рнОйугАте ВША г)5!ыс 5АР а. АсЫ го сЬе РХАс 10х 5АР ОерЬолрЬогу|асюп Ьиг(ег 5 и! НО со 48 р! Ь. АгЫ йе арргорпасе апсоипс оЕ 5АР. | ипи оЕ 5АР сс|!! сгерЬохрЬогу!асе -| рпю!е оЕ 5'-РЬохрЬогу!асеа сегпип| (3хгесеыеа ог 5'- гассиев) ог -0.2 рто1е оЕ Ыипс-епсгесг В|!А. ТЬесе атоипыпау часу х1|8Ьс1у Егот опе епхуте тапи(ассигег со сЬе пехс.
с. !псиЬасе сЬе геасНоп Еог 1 Ьоиг ас 37"С. д. То шасбчаге 5АР, ггапхуег сЬе геасНоп со 70 С, лпсиЬасе Еог 20 ш|пигеь, апс) соо1 со гоош гешрегаыге. 3. Тгапхуег йе асрлеоиа РЬахе со а с1еап пнсго6лКе сиЬе, апс) гесочег сЬе Р)х)А Ьу хгапс(агс( есЬапо! Ргес|рйаНоп |и йе ргехепсе оЕ 0.1 чо!шпе оЕ 3 ЬЕ хойшп асесасе (РН 5.2) !Е 5АР схах илес) ог 0.1 чо!ише оЕ 3 М аос!|шп асегаге (РН 7.0) |Е С1Р соаа овес).
Ргогосо! !3: Т3ер!гоар!гогу!аг!оп о! ОА7А Ргаетепгг ан!ТЬ А!!са!!пе РЬоар!гагоае 9.65 4. АПонн 1Ье ргес1р11аге го с1гу ас гоогп гегпрегагиге Ье1оге Йаао1н1пк 1г 1и ТЕ !РН 7.6) аг а УХА сопсепСга11оп оЕ >2 ппго1еа!гп1. То гепюне 5' РЬоарЬагеа Ггогп КЪ1А, иье 0.01 ипй о1 С1Р!Ргпо1е оТ 5' гепшш.!псиЪаге Тог 15 пипшеа аг 37"С, !о!1охе6 Ъу 30 ш1пигеа аг 55'С. А1гегпа6не1у, иае 0.01 — 0.1 ишг о! 5АР/ргпо1е о! 5' еаза го дерЪоьрЪогу1аге КЪ!А ш а 1-Ьоиг шсиЪа1юп аг 37"С. гег! ОГ4А 'ь со Ье пав аа а аиЬаггаге !ог ро!упис!еобде Ыпаае, 6 гпиаг Ье паогоиа!у игпп сЬгогпагоегарЬу, ее! е!есггорЬогеяа, с1епягу кга6!еп1 сеп1пТика6оп, ог сЬгоигппа о! 5ерЬагоае С$:4В со Фее 6 !гого !огн-гпо!еси!аг-юе!аЬ1 пис!ек аскЬ.
агп!пап!а тау гпа!се ир оп!у а ата!! !гас6оп о! 1Ье нне!еЬ1 о! 1Ье пис!е!с ас16 !и 1Ье пгп Ьиге а пшсЬ 1агеег ргорог6оп о! 1Ье 5 ' геггги и 1. Ып!еаа ьгера аге га!сеп 1о гегпоне !осн-гпо!еси!аг-ъне!6Ь1 !3!4А апд й!4А шо!оси!еа сап Ье 1Ье ргес1опмпап1 крас!ее о! е !аЬе1ес! !и геас6опа сага!уле6 Ьу ЬасГепорЬаее Т4 ро!упис!еогк1е Ыпаае. пшгп !опа аге аггопе 1пЫЬ11ога о! Ьасгег!орЬаее Т4 ро1упис!ео6с1е Ыпаае, дерЬоа- оиЫ пог Ье гйагю!нес! !и, ог ргеарйа1ег1 !гогп, Ьийега сои!а!и!пе атпюпюгп аа!га !1Ь ро!упис!ео6де Ыпаае.
Рго1осо! 14 Рпоьрпогу!аиоп о1 РМА Мо!ест!еь ъи'й Рго1пл~~пд 5 -Нудгоху! Тегт~п~ т не аемочяг ог 5' Рноьиняте5 гаом набеге!с ясий гч!гЬ РЬоьрЬагааеа апс! гЬе)г геадг)1гюи ш гаг)!о1аЪе1ег) Еопи Ьу ЪасгегюрЬаае Т4 ро1уппс1еог)г!е )с!паае 1а а ччн)е1у наеб гесЬи)оне Еог цепегаГ)па ЯР-1аЪе1ег! РгоЪез !Р!еаье аее ГЬе рапе1 оп ЕАВЕЕ!МС ТНЕ 5' ТЕВМ!М ОГ ОНА ИЧТН ВАСТЕЯЕОРНАСЕ Т4 РОсгМЕ1СЕЕОТ!ОЕ К!МА5Е) гЯЪеп гЬе геасг)оп Ра сагг)ег! онг ейк)епг1у, 40-50чо оЕ йе ргоггпйпВ 5' гегпиш )и гЬе геасг!оп Ьесошеь гас)1о!аЬе!ед 1Вег)снег апй Ро!!с 1977). Нохечег, 1Ье арес!Е1с асг)ч)гу оЕ ГЬе геан!г)пВ ргоЬеа Ра пог аь ЫВЬ ах йас оЬгашес1 Ьу ойег гаг!!о1аЬе1)пВ шегЬосЬ япсе оп1у опе гайоасг)че агош га шсгойкед рег Е1ХА ию1есн1е.
Ь)ечеггЬе1еы, йе ача1!аЬ111гу оЕ !у-яр]АТР МгЬ арес)Е1с асг)ч)г)еа )п гЬе 3000 — 7000 С)/пппо1е ганне а!1оюь гЬе аупгЬеяь оЕ ргоЬеа ан!гаЫе Еог гиапу рнгроаея 1пс1иг!!пав: ° аь ЬуЪг)йхагюп ргоЬеь го г)егегш!пе йе а!гас!иге апй сору пшпЬег оЕ шрсХАа ° аа рг)шега 1и рг)шег-ехсепяоп ехрегнпепга го гпар йе 5' епг!а оЕ шКЕ4Аь ° аь анЬаггасеа 1и йе апа!уаь оЕ й)4А а!гас!иге Ьу пис!еаье 51 ог шпиц Ьеап пнс!еаае ° аа ргоЬез 1и Е1паегрг)пг)па апй Еоосрг)пг)па ехрег)шеи!а ° аа ргнпегь ш РЬ)А аецнепс)пд ° аа ргоЬеь ш е1есггорЬогег)с шоЬ)1Ьу аЬ)Ег аааауа ТЬ)ь ргососо! г!егсг1Ьеь а шегЬой го 1аЬе1 г!ерЬохрЬогу!агес) ргоггпйпа 5' сегинш.
Рог а анпппагу оЕ шегЬосЬ паей со 1аЪе! ЕЬе гегпиш оЕ Е7Ь)А, р1еаве аее ТаЫе 9-2 ш Ргососо1 1О. 9.бб Рготосо1 14: Рйоурйогу1адол оу" 0ХА Мо1еси1еу !чтей Рготгидтлд 5'-Нуг(соху! Теслу(л(9.67 ЕАВЕЕ|МС ТНЕ 5' ТЕРМ1М! ОГ 0МА ЪЧ!ТН ВАСТЕК1ОРНАСЕ Т4 РОЕУМЫСЕЕОТ10Е тъ!МА5Е ТЬе епхугпе о1 сЬо|се 1о сата|ухе тйе 13Ье(|па о! 5' 1епп|п| о1 пис|е|с ас(да |5 Ьастег|орЬаке Т4 ро|угвс|ео Ыпаае, и ЫсЬ (ас|1 |(атее !гала(ег о( Т р|юарЬа1е геа| ей!ее (гоп! $)33Р|АТР то ТЬе 5 '-Ьус| тоху| теггп|п! о! т1ер рЬогу|атед 5|пк1е- апд доиЫе-~гапдед 0МА5 апт1 кМА. 1и адд(!|оп, 1Ье епхугпе ъч16, ъи1Ь гписЬ !оъчег е(Е! с|епсу, гедтоге рЬоарЬа1е геа|диеа то 5'-Ьут|гоху1 егоира!оса!ее| а1 п(с(45 |и доиЫе-5(гапдед 0МА.
Т4 ро!упис(еот|де Ыпаае 'ь а тетгагпепс рготе|п о1 М, — 142,000 согпроаед о( буиг |депбса| твЬип|15 епсодед Ьу тйе атптстига| целе раеТ от Ьастег|орЬаке Т4 ((ог геиеи 5, р!еаае дее йсЬагдаоп 1971; Маипдега 1993). Тгапа(ег о1 гаР то 1Ье 5' 1епткпиа о( 0МА сата|ухед Ьу Ьастег(орЬаке Т4 ро!упис|еобде Ыпаае сап Ье сагпед оит !и Ьчо ъчауа (р(еаае аее Е|киге 9-4): ° !л тйе тоги агд геасбол, 5(па(е- ог дои Ые-51гапдед 0 МА ь й !51 тгеа1ед ъч|(Ь а рЬоарЬатаее (С| Р ог 5АР) то гепюче рЬоарЬате геякЫее !гогп тйе 5 ' тегпкп! (Рготосо! 13).
ТЬе геди!бпц 5'-Ьудгоху( теггп|п! аге 1Ьеп гер|юарЬогу!а1ед Ьу !гала(егг|пд 1Ье Т-рЬоарЬате (гогп [у-ОР]АТР $п а геасбоп сата|угед Ьу ро|упис|ео(Ые Ыпаае ВЫ5 рготосо1 апс$ Рготосо! 15). ТЬе е(Е!с|епсу о! гад|о(аЬе(|пк т$ерепда оп 1Ье рингу о( тйе 0МА (дие 1о (!|паде !пЫЬйога ргеаепт Ы ап иприпйед 0МА 5о!ибоп) апд оп (Ье ает(иерее а1 1Ье 5' теггп|пть о1 | 1Ье 0МА.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
