Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 55
Текст из файла (страница 55)
ТЬе с(опед чегяоп оЕ гечегге сгапьсг!рсасе епсодед Ьу сЬе Мо-МЕ)г епгупсе Ь сЬе епгуспе оЕ сЬоке сп сйь ргососо). Мигали оЕ йе егауюе йас !ас)с КЫасе Н асдч!су (е.8., 5сгасабсг!Рс Егоги епгаса8епе ог 5ирегспрс 11 (гого Е!Ее ТесЬпо1огдес) Ьаче югое адчапса8ес очес йе чд!д-суре епгупсе япсе сЬеу (1) ргос!исе Ь48Ь- ег усе!<Ь оЕ Еи11-1еп81Ь ехсепяоп ргог1исс апд (2) счог)г еоиа1!у арче!! аг Ъос1с 47'С апд 37'С (Оегагд апс1 Р'А!етого 1993). 70х Кечегае сгалгслр(аае ЬиЕЕег (х)ос!е1с АС11415 апе! О11копос1еобе1е5 дА)ТР ао)идол (сотр)есе) солса(л)лц Еоиг дМТР5, еасИ ас 5 тм дА(ТР ао)идол солса!л(лц ВСТР, дСТР, алс( дТТР, еасИ ас 5 тм А 1МРОКТАЫТ Огп!С йе дАТР Егот дп5 ао!и(юп. Гог адч!се ои гоагдп8 апд ьсог!п8 сю!идою оЕ дНТРА р1еасе сее сЬе !пЕоппаиоп рапе! оп РКЕРАКАТ1ОЫ ОГ 5ТОСК 5ОЕОТ1ОЫ5 ОГ дХТР5 АКР ддЫТР5 ГОК РМА 5ЕЕ)!)ЕЫС(ЫС ю СЬаргег 12. О1!Ко(ду) „ю РшсЬасе апд ймоЪе о1с8о(ЙТ)п,с аг ! гп8)ги1 ю ТЕ (РН 7.6).
5гоге аг — 20"С. Калдот деохулис!ел!где рптеть ык от ьечел Ьаьеь тл !ел8(Ь Весасье оЕ сЬесг ип)(огш 1еп8й апс( 1ас)с оЕ ьес)иепсе Ьсаь, ьупйебс о118опис1еос(с(еь о( таис(ош ьеоиепсе аге сЬе рппсегь оЕ сЬотсе. 01!Волос!еовдеь оЕ орсвпа1 1еп8сЬ (Ьехашегь апт) Ьерсапсегь; 5ОВапиша апт) бирса 1995) сап Ье ритсЬаьей Егош а сопипегсса1 ьоигсе (е.8., РЬаппасса апт) ВоеЬпп8ег МаввЬеитс) ог ьупсЬеяхет) 1оса1!у оп ап аисошасес( 7)ХА ьупсЬеьсхег.
5соге йе ьо1ибоп о( рптпегь ас 0.125 НВ)Н1 )п ТЕ (РН 7.6) ас — 20'С тп ыпа1! а1)виось. Тетр!асе К)ч)Аеи Тио-раьь ро!у(А)е-елтп Ьет! тК)с)А ртератес! Етот се!1ь от 1(ььие (Ьас ехртеььеь (Ье тКНА(ь) оЕ ттетеь( Тсчо-раьь ро!у(А)а-еллсЬед тКА)А ртератед Етот се!!ь от дтьие СЬат доеь лос ехртеьь (Ье тКА)А(ь) ОЕ !лсетеьс Рог спКХА ргерагасюп апс( о!18о(с(Т) сЬгошасо8гарЬу, р!еаье ьее СЬарсег 7. Вой КХАь ьЬОО1с) Ье йььо1чет) ш Н О ас а сопсепсгас!оп оŠ— ! шнтш!. Кае!!оас1!!сее Соспроопе!5 (а-ьхР)дАТР (70 тСт)т), ьр. асс.
>3000 С!)тто!е) (1> (а-ьхР)дСТР (70 тС!)т(, ьр. асс, 800 — 3000 С!)ттло1е) (1> То пишгпие ргоЫешь саиьет) Ьу гайо1уыь оЕ сЬе ргесигьог апт( сЬе ргоЬе, сс )ь Ьеьс, ьчЬепечег роьяЫе, со ргераге гайо1аЬе!еВ ргоЬеь оп сЬе Вау сЬе [ьср)с)ХТР аптчсь сп сЬе 1аЬогасогу. АЙЙ1!!ооа! Кеадео15 51ерь 8 алд 9 оЕ Я!ь ртотосо! тес)и(те теакелсь !!Ыед тл Ртотосо! 8 оЕ СЬть сИартет. МЕТНОЮ А 1мроктАхт АсЫ 1Ье гечетье сгапьспрсаье !аьс. Кечегье сгапьспрсаье ьирр!(еа Ьу ййегепс птапиЕассигегь чалеь ш )ь асстчьу рег иптс. СьсЬеп иып8 а пеьч ЬассЬ оЕ епхугпе, ьес ир а ьепеь оЕ ехсепяоп геассюпь солса)птп8 ециа( апсоипсь оЕ ро1у(А)' КХА апт( о1!Вопит!сот)с[с рпгпег, апс( сВЕ(егепс агпоипь оЕ епхуше. 11 роьяЫе, сЬе рптпег ьЬоиЫ Ье ьрес(Есс Еог а шКХА ргеьепс ас шот(стасе аЬипт(апсе ш йе ргерагасюп оЕ ро!у(А)+ КХА.
Аььау йе ргос1ись оЕ еасЬ геассюп Ьу Ве! е!ессгорЬогеяь аь с[еьсг)Ьес( ш сЬЬ ргососо!. ()ье йе пишша1 апсоипс о! епхупсе гет)и)тес) со ргот(исе сЬе пихипиш у1е!с( оЕ ехсепяоп ргот)исс. ТЬе ипть пьес( (п сЬЬ ргососо! ьчодс ьче11 ьч)сЬ шоьс ЬассЬеь оЕ Всгасабсгсрс апб 5ирегьспрс В. М[х СЬе сошропепь Ьу кепс!у сарр[пи сЬе яс1е оЕ сЬе сиЬе. Со11есс сЬе геассшп пихсите ш йе Ъоссош оЕ йе сиЬе Ьу Ъпеу сев!с[Евра![оп ш а ш[сгоуиае.
1псиЬасе йе геасс[оп (ог 1 Ьоиг ас 45"С. [а-ьср)с(СТР В пьес) аь а сгасег со шеаьиге сЬе ьупсЛеяь оЕ йе Вгьс ьсгапс) о( сРХА. 9.48 СЬартет 9т Ртератадоп ОТ Кад(о!абе!ед О)с)А алд ЯЬТА Ртобеь прес!а! Е(!о!росеп1 берЬадех С-50 ьрил со!итл, ес)и!!!Ьтасед т ТЕ (рН у.б) 5!!!сол!кед т!стоуиее сиЬеь (7.5 лс0 Пасет Ьа(Ьь ртеьес Ео 45 С, 60'С, алд б8'С 1. То ьупсЬеяхе усть! ягапд с[3ХА, пих сЬе ЕО11оит(па шегед[епь Сегпр!аее КХА (1 тп8)ш!) О118О(с(Т)сс сь (1 тп8)тп1) 5 псм с)ХТР ьо!исюп (сотпр1есе) 50 птм ййюйгеьо! 10х течетье сгапьспрсаье ЬОЕ(ег 10 шСВш1 [и-ьср) с(СТР (ьр. асс. 800 ог 3000 СУпипо!е) р1асепса1 КХаье шЫЪссог КХаье-Егее НсО гечегье сгапьспрсаье (-800 ип(ь) ас 4'С сп а яеп1е ш[стоЕиае сиЪе: 10 н! 10 н! 10 н! 1 Н! 5 н1 5 н! 25 ип1ь Со 46 Н! 4 н1 Ргоросо1 9: Яас)(о!аЬе1(иц оЕ 5иЬГгасресЕ сРАЕА РгоЬеь Ьу ЯаисЕоги 01(роиис!еор(с(е Ехреияои 9а49 2.
Меаюге ЕЬе ргорог6оп оЕ гасбо1аЪе1ес1 с)ХТРь ЕЬаг е!йег аге шсогрогасес1 !пго шагеПа! ргес!р!Еагес) Ьу ТСА ог ас(Ьеге го а $36-81 61$ег (р!еаье ьее Аррепйх 8). Са1си!аге ЕЬе у(е16 оЕ с(3МА ияп8 ЕЬе ециа6оп Ье!очч. )п а геасгюп сопса)п)п8 50 пшо!еь оЕ еасЬ с)МТР; ори ососрогасод х 200 пшо1еь с)ХТР х 330 п8)ппю)е = п8 оЕ сРМА ьупйеяхес) соса! сря 3. 5гор йе геас6оп Ъу ас)йп8: 0.5 М ЕРТА (РН 8.0) 2 и) 20чо (сч)ч) 5Р5 2 р! М(х ЕЬе геа8епгь !и ЕЬе гиЪе сошр1еге1у.
ТЬе яп8!е-ьиапдей гас8о!аЪе!ед сРМА Ь 9и)ге ьск)су апс$ ас)Ьегоь попьрессйса))у со 8!ая, 8)гога, апс$ юпзе р!аьпсь. Рог ЙЬ геаюп, и Ь нпроггапс го гпашса)п а ппшипнп оЕ 0.05оа (счЕч) 5Р5 ш 5гер 3 оЕ йо ргососо!, апс)0. $-$.0оао 505 сп ЬуЬгЫгхасюп Ьи((егь. 4. АсЫ 5 р1 оЕ 3 М МаОН го гЬе геас6оп $0Ье.
1псиЬаге ЕЬе пихгиге Еог 30 пипигеь а$68оС го Ьус)го!ухе ЕЬе КХА. 5. Соо1 ЕЬе пихгиге со гоош сешрегагиге. )х)еигга!(ге йе ьо!и6оп Ьу асЫш8 10 р! оЕ 1 м ТпьС1 (РН 7.4), ш!х!п8 чче!1, апс$ ЕЬеп асЫш8 5 р! оЕ 2.5 М НС1. СЬес1с йе РН оЕ $Ье ю106оп Ъу ьро$6п8 <! р! оп РН рарег. 6.
Рипуу йе с)3ХА Ьу ехггас6оп чч!ЕЬ РЬепоЬсЫогоуопп (р)еаье ьее Аррепс(!х 8). 7. 5ерагаге йе гас!!01аЪе1ес) ргоЬе Егош $Ье ип!псогрогасес) с()х(ТРь Ьу сЬгошасо8гарЬу йгои8Ь а хрип со1шпп оЕ 5ерЬас)ех О-50 (Аррепйх 8). ,4х $84РО$$ТАМТ Рег(опп ЕЬ(ь ьгер апс) а)$ ьиЬьес)иепг ьгерь оягЬ ь)$)соп)хес$ $0Ьеь (р!еаье ьее Аррепс))х 8). В. Саггу оиГ Гччо гоипс(ь оЕ ьиЪГгас6че ЬуЬг!Йхаг!оп аь с)еьсг!Ъес) ш Ргогосо1 8, 5$ерь 9 — 19. 9. Сопсепггаге ЕЬе 6па! ргерага6оп оЕ с)3ХА Ьу ьес!иеп6а! ехггасгюпь чч!ЕЬ !ьоЬигапо1, апс1 гешоче ьа1$8 Ьу сЬгогпасо8гарЬу оп 5ерЬас1ех О-50 аь с$еьсПЬес1 !п Ргососо! 8, Мерь 16 апс$ 17. 10. Кесочег гЬе с)3ХА Ьу ьгапс)агс$ ргес!РЬа6оп чг!ЕЬ егЬапо! (р1еаье ьее Аррепсбх 8). $3!ььо1че ЕЬе с)3МА ш Н О аг а сопсепгга6оп оЕ15 п8/)с1.
я $МРОКТАМТ Оо пог аиеспрс го ргес)р)гаге йе СОМА оя(ЕЬ ейапо) Ье(оге гегпоип8 йе рЬоьрЬаге Ыпь Ьу хрип-со)оспа сЬготаго8гарЬу. ТЬе ргеьеосе оЕ рЬоьрЬаге Ыпь )псегрегеь сч)ГЬ ВМА ргес(риагюп. ТЬе ялЬсгассес$ с)3ХА ргорагос) ЕЬгои8Ь 5сер $0 оЕ ЕЬсь ргососо1 сап Ье сопчеггес$ пио с$оиЫеьсгапс)ос) $3МА (р!еаье ьео СЬаргег $ $, Ргососо! $ [5га8е 21) апс) с!опес$ шсо а Ьассег)орЬа8е ог р)аяпЫ чессог со ргос)исе а ьиЬггассе8 сРМА !сЬгагу (е.8., р)еаье ьее 5аг8епг апс) Раач(8 $983; Рачы 1986; ВЬупог ег а). $986; Раг8по)$ ег а!. $990).
11. То гасбо1аЪе! ЕЬе ьиЪсгассес$ с)3МА со Ы8Ь ьресг6с ас6чЬу, пих йе Ео!!осч(08 ш а 0.5-ш! писгоуи8е гиЪе: яа(игасге8 сРХА 5 р1 гапс)ош 8еохупис!ео68е рпгпегь (125 08йп)) 5 )с) 12. Неаг ЕЬе пихгиге го 60'С Еог 5 пипигеь, апс) $Ьеп соо1 Ь го 4'С. 1псиЪаСе йе геасг(оп гог 4 — 6 Ьоига аг гоогп Сегпрегагиге. 10 — ! 5 ипсь о( сЬе Кдепочч (га8псепс аге ге0шгед тп еасЬ гапдогп рппип8 геасс!оп.
15. 5ерагасе сЬе гад101аЬе1ед с(3Ь(А стого сЬе птдпсогрогасед д!х(ТР8 Ьу арап-со1шпп сЬго гпа(опгарЬу сЬгоиаЬ 5ерЬадех С-50 (р1еаае аее Аррепйх 8). ТЬе гайо!аЬе!ед с!3ЫА ьЬоиЫ Ье депасигед Ьу Ьеапп8 со !00'С гог 5 папесса Ьегоге сс Ь ияед Сог ЬуЬпйгадоп. 13ае 5 х 10' дрпс ог гайо!аЬе!ес1 сЛМА гог еасЬ 138-пип 6!Сег апд 5 х 10" Со 1 х 10т дртп Сот еасЬ 82-тшп 61Сег. Опсе гайо!аЬе!ед, иае йе ргоЬе иппсейаСе1у Со ачотд датпа8е Ьу гайосЬеписа! десау. 9.50 СБаргет 9: Ртератаг!оп оу рсай!и!аБе!ег( РИА апд РсМА РтоЬез 13.
То йе рг!псег:с1)ХА сегпр1асе ппхсиге, асЫ: 5х гапдогп рпгпег ЪигТег 5 псм дЬСТР ао!ис!оп оу дСТР, дар, апд дТТР 10 псС!йп! (и-пр(дАТР (ар. асс. >3000 С!1спспо!е1 К!епочч (ганпсепг (12.5 иппа! 14. 5сор сЬе геасс(оп Ъу адд(пд: 05 м ес3тА (рн 8.01 ! н1 2058 (чд(ч! 5135 2.5 н! 10 н! 5 н1 25 н! 2.5 н! Со 50 Н! 9.52 СЬарсет 9: Ргерагасюп оГЯадто1аЬе!ед РИА апд ЯХА РгоЬез ГАВЕЕ!]ъ]С ВЕСЕЮЕО АМ0 ВШ[ь]Т-Е[ъ]ОЕ0 3 ТЕКМ!]Ч! ТЫз ргососо! гет!и[сел сЬас сЬе РХА со Ъе епд-!аЪе1ед сопса[п а зес)иепсе гесогшгед апд с!еачед Ьу а геяпссюп епдопис)еазе йас аепегасез 3'-гесеззед епдз.
ТЬе сЬоке оГ ъчЬкЬ [а-злр]дсъ)ТРз со иле Сот йе геасссоп дерепдз оп йе зеъ!иепсе оГ йе ргосгийпг 5' сепгип1 ас сЬе епдз оГ сЬе Р)ъ)А апд оп сЬе оЪ)есдче оЕ йе ехрептепс. Рог ехалпр!е, епдз сгеасес1 Ьу с!еачаге оЕ Р)ъ)А ъчссЬ Есор! сап Ье 1аЬе1ес1 ъчиЬ [а-з~р]дАТР: С* Т '6. * ААттс-. з'-бАА оиз + зч ААТТС-з '-СТТАА" '-сзн» ! '-С'ТАА" ' ~~6- [а-злр с1АТР ТЬе съчо ргохипа1 5'-ргосгийпг пис1еосЫез аге ЪосЬ сЬугпЫше геясЬлея апд йе К!епоъч епгупле сап сЬегеГоге ]пзегс съчо адешпе гезЫиез. ТЬе гехи!с!пг Егагтепс ъч]сЬ пчо Ыепдса! гайо1аЬе1ес1 пис!еосЫез пкогрогасес1 1псо [сз 3' сегт[пиз ъчои!д пос Ье зшсаЫе Гог Махат-б1!Ъегс зес)иепсспг, Ьесаизе а доиЫес раиегп ъчои1д Ье оЬсашед оп йе зес)иепсшг аисогайоагат.
Рог осЬег ригрозез, Ьоъчечег, зисЬ аз гайо!аЬе!шг оЕ Р)ъ)Аз со Ье изед аз яге зсапдагдз ог гепегас[пг ргоЪея йе спсогрогассоп оГ съчо Ыепссса! гайо!аЪе!ед деохупис1еосЫез ъчоиЫ пос сотргоппзе сЬе геял!ся Тегппш сгеасед Ьу с1еачаце оГ РХА ъч]сЬ ВаозН! сап Ъе 1аЬе)ес1 ъчиЬ [и-злр] дбТР. К!епоъч епгуте -6 . САТСС- -66 САТСС- з -ССТАб тз з но б-з зл Т.-ССТАб тз з но бб-з [ -"Р]дбтр Хосе йас оп!у опе гайо!аЬе!ед пис!еосЫе сап Ье лпсогрогасед рег епд ш а геассюп ий !1гспг [а-злР] дбТР аз сЬе гайо]аЪе!ед зиЪзсгасе. Ноъчечег, 1Е ип1аЪе]ед дбТР, дАТР, апд дТТР ъчеге шс!идес1 ш сЬе ро1угпепгасюп геассюп, йеп сЬе РХА Ггагтепс сои1д Ье гайо1аЪе!ед ъч)сЬ [и-"Р]дСТР.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
