Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Я) ММАКУ ТЬе Воа! оЕ РР-РСК )а го 6(ьр!ау а!1 оЕ гЬе тКХАа оЕ а се!1. !и агЫКюп го гЬе сИВси1г!еа 6)зсияед е!аенчЬеге гп гЬ!а ргогосо1, гЬеге аге 6оиЪь аЬош йе роннег апд зресг6сау оЕ йе ргппег ра)гк. Рп61 йе ргоЫета гЬас ргеаепг!у Ьаипг 6(йегепг(а! 6!ар!ау аге ьо!чес1, гЬе Еигиге оЕ йе тегЬо6 ъч!11 гегпаш ипсеггаш. роггипаге!у, пан гесЬпо1о81ек аге сопип8 !пго иае гЬаг оЕЕег а1гегпабне гнауа Го !гасе йе раиегпа оЕ Вепе ехргеяюп 1п се!1з. РЫА аггауь, Еог ехатр1е, тау Ье аЫе го Ъурая гпапу оЕ гЬе 6!ЕВси16еа йаг Ьаче Ье!6 ир рго8гея !п гЬ)а агеа Еог ао 1оп8.
Р(ЕЕегепг!а! 6!ар!ау (а а гесЬпир~е ъчКЬ ЫВЬ гЬеогег)са! ргот(ье апс1 тапу ргасгка1 ргоЬ1епы. ТЬе пашне ап6 61гпепяопь оЕ гЬеье ргоЫета аге я11! пог Еи11у бейпей Хечегйе!еаа, питегоиа ипргочегпепя го гЬе ог18!па) гесЬпю)ие Ьаче Ьееп герогге6 очег гЬе уеага йаг Ьане шсгеаьед гЬе еЕЕ)с!епсу нбгЬ ннЫсЬ 61ЕЕегепг)а1!у ехргеяе6 8епек сап Ье Ыеп66ес1 ап6 Ьаче бесгеаае6 ГЬе атоипГ оЕ ъног)с гег)и)ге6 Го Ыеп6Еу ГЬеье Вепез (е.8., р!еаве аее 5отраугас еГ а1. 1995; ХЬао ег а1. 1995; 1.!ап8 апд Рагдее 1997). ТЬ!а ргогосо1, иЫсЬ !псогрогасеа аогпе оЕ гЬезе ипргочетепгь, ашная ргочЫе6 Ьу СЬаг!ек Р.
Вапг1пип (Уп!нега!гу оЕ Техас 5оигЬнчезгегп Меб!са! Сепгег, Ра1!аа). Ргососо! 16: Е)фегелпа! О(зр!ау-РСЯ 8.101 МАТЕВ!АЕ5 А 1МРОКТА(з(Т То гес(осе 1Ье сЬапсе оЕ соп(апипабоп гйй ехоеепоих О!чАх, ргераге апс$ иае а срес(а( ае( о( геаееп(с апс$ гю(изюпх Еог РСК оп(у. Ва1се аП д(аххъчаге Еог б Ьоигх аз 750 С апс! аи1ос(аче аП р(асбсзчаге. Гог пзоге (п(огпзазюп, р!еаае хее йе рапе! оп СО(з(ТАМПз(АТ1Ой 1(з( РСК зп йе сЬарзег (пзгоз)ис((оп.
Рог ап а(зегпабче арргоасЬ!о геадепЬП р!еахе хее1Ье ране( оп $3$ГГЕКЕ(з(Т!АЕ О15РЕАЧ К1Т5, СА()Т1О(з(: Р1еасе аее Аррепг$1х ! 2 Гог арргорг(а1е Ьапс$11пд оЕ пза1ела15 пзаг(сес$ КЫ1Ь <1>. Вийес5 апс! 501и6оп5 Р1еаае аее Аррепспх 1 Еог сопзропеп15 оГ 3!ос(с со!и1сопа, Ьийега, апс$ генея(я 01!01е а!ос(с со!01!ила Го ЕЬе арргориа1е сопсеп(гаиопя 70х Аглр66!саиол ЬОЕГег 5х ОГ)-РСК гечегхе Ггалсег(рсахе ЬОГЕег 250 гпМ ТляС! (РН 831 375 шм КС( 15 шм МПС1, Аизос!аче йе 5х Ьи((ег Еог $0 пипи!ее аз 15 ря (1.05 1с8!сшз) оп!н(и(з( сус1е, $3зчЫе йе згел!е Ьибег (пзо аПциогя 5зоге ЕЬе а!нрюь аз -20*С. Р(1ЬзоЕЬге(со! (Г)ТТ) (700 тм) гЕ(ЧТР хоlибол (20 тМ) солса(л(лд аИ Еоиг сЕА(ТРх (рН 6.0) РЕаселса! КХахе тЫЬггог (20 ил(75)т!) Р(сазе зее зЬе зпгоппабоп рапе! оп Пз(Н!В!ТОК5 ОГ КЬ(А585 зп СЬарзег 7.
5х 5есЕиелс!лК це(-!оасЕглц ЬиЕЕег Еп2уп$е5 апс! Вийес5 Кечегхе Ггалхсг(рГахе (К(з(А-сЕерелс(елс РНА ро!утегахе) Р!еазе зее ЕЬе рапе1 оп КЕЧЕК5Е ТКА(з(5СК1РТА5Е5 ()5ЕО Пз( КТ-РСК ш Ргозосо1 8. Гог ТзЕз-РСК, а гечегзе сгапзслрзазе зЬас Ь г(еузс(епз ш КЬ(азе Н Ь гез(и(гег( (е.8., 5ирегзслрг Егопз !ПЕе ТееЬпо!о8(ез ог 5згаза5сг(рг Егопз 5згаза8епе). ТЬегтох1аЫе 070А ро!утегахе Таг( ЕзЬ)А ро1ушегазе Ь йе ззапг(агз$ апз$ арргорлаге епсугпе Гог зЬе апзр1збсабоп зза8е оЕ пзозз Еогпь оЕ ЕзР-РСК.
(х(ис!е1с Асс(15 ап(1 О11копис1ео6(1е5 АлсЬогзлд 3' оЕзцолис(ео!КЕе рлтегз (300 (зК)т!) (л 70 тм Тгь-С! (рН 7.6), 0.7 тм ЕРТА ТЬе апсЬог(п8 3' о68опис1еогЫез аге а Еапи1у оГ 12 рг(гпегз зч(гЬ зЬе Пепега! зггисгиге 5'-4Т) иЪ $зЗ-3', зчЬеге Чы езйег С, А, ог С, апг$ зхг Ь С, Т, А, ог С. Гог ехапзР1е, опе Ргипег ш ЕЬе зепез ь 5'-з$(Т)з СС- 3', гЬе пехз ы 5'-4Т) з СТ-3', есс. Рип(у еасЬ о1з8опис!еозЫе ргипег Ьу сЬгогпасо8гарЬу оп сопипегс(аПу ачааа!Пе геяпз (е.8., Ь(ЕЬ(5ОКП, ХЕ(з(ЕПЕе 5сзеисе Ргог(исзз) ог Ьу з$епазиг(п8 ро!уасгу!апзЫе 8е! е!есзгорЬогеыз, аз г(езсг(Ьес((п СЬарзег 1О, Ргогосо! 1.
АгЬз(гагу 5 ' о!(Кос(еохулис!ео7!сЕе рг(тегх Г50 РК(т!) зл 70 тм Тг(5-С! (РН 7. 6), О. 7 лъй ЕРТА 5гхзееп агЬигагу 5' о68опис!еозЫе рлпзегз аге гергей еаеЬ зеп пие!еогЫез ш 1еп8$Ь. ТЬе зез(иепсе о( еасЬ рг(пнт ы сЬозеп аз гапг$опз, Ьиг 1$ зЬои16 солса(п арргохипазе!у егрза! пигпЬегз оГ зЬе Еоиг Ьазез, зч(гЬ а Ьа!апсег$ йззг(Ъигюп оЕ С апз$ С гезЫиея апс( а 1озч ргорепвиу зо Еопп згаЫе зесопаагу ззпкззиез. РилЕу еасЬ о1з8опис!еозЫе ргипег Ьу сЬгогпазо8гарЬу оп сопипегсзаау ачаз1а(Пе геяпз (е.8., ЖЕГ(5ОИЗ, Ь(ЕЬ( Е((е 5сзепсе Ргог(исзз) ог Ьу з$епазиг(п8 ро!уасгу!апзЫе Пе1 е!есзгорЬогеяз, аз г1езелЬег$(п СЬарзег 1О, Ргососо1 1. ТоГа! К(з(А Г700 РК)т1) Тога! К(з(А ехзгассег( Егопз сеаз зчПЬ сЬаосгорк а8епь Ь ПепегаПу ЕЬе зеизр!азе о( сЬоке Еог Езсз-РСК.
КЬ(Аз зо Ье «озпрагег( Ъу Ез(з-РСК зЬои16 Ъе ргерагег( зп ап Ыепз(са! Еаз$6оп. Ро!у(А$з К(з(А и поз Ыеа1 аз а зегпр(азе зп ййегеииа1 йзр1ау Ьесазье гЬе изезЬозЬ изег$ Еог ьо!агюп оГ Ро!у(А)+ Кзх(А ойеп сопзапипазе зЬе ргерагагюп нз(гЬ я8избсапг апзоипь о( о68о(г(Т) гЬаз сап ргипе Ез(з(А зупгЬезь ас чабогь рошь а!оп8 зЬе ро1у(А) саз1, геси16п8 ш япеапп8 оЕЬапгЬ оп зЬе Пе! (Ыап8 ез а1. 1995!. Ргососо! 1б| 13Яегепс!а! 13!ар!ау-РСК 8.103 СЬоозе опе ог тоге ргппегз Егот йе со!1еспоп оЕ апсЬогед 3' о116опис1еопдез ап|1 зес ир а зепез оЕ аппеа!!пц геаспопз сЬас сопса!и д!ЕЕегепс атоипгз оЕ 06!псед КХА сеспр!асез: сешр1асе И !А 8.0 р! апсЬоге|1 3' о!(8опис!еог(де ргипег 2.0 р! 1псиЪасе йе геассюпз Еог 10 ппписез ас 65'С апд сЬеп р!асс йегп |и а 37'С счасег ЬасЬ.
ТЬе соса1 а|паин| оЕ ВХА ш йе аппеа!ш8 геассюпз зЬои1д чагу Ьепчееп 8 п8 апд 800 п8. 1псиЬасе сЬе сиЬез ас 37'С Еог 1 Ьоиг. А гечегзе сгапзспрсазе Йас Ь дебс|епс |п КХазе Н ь гег(н!гед Еог РР-РСК (е.8., 5ирегзспрс Ьош 1(Ее ТесЬпо!орез ог 5сгаса8сг(рс сгош 5сгаса8епе). То сезс Еог сопсапнпадп8 8епош(с РХА, зес нр опе ог гпоге сон|го! геассюпз Йас сопса|п по гечегзе сгапзспрсазе епкуп|е апд саггу йезе сЬгон8Ь 8сер 10 о! сЬе ргососо1.
Сопсапипасюп счссЬ 8епопис РХА Ь пос нана!1у а ргоЫегп ип!ем йе КХА Ьаз Ьееп ргерагед 6оп| се!1з сЬас аге ипдег8о|па арорсояз ог Егогп 6яие Йас Ь песгос(с. !Е песемагу, Йе КХА ргерагасюп сап Ье сгеасед и|(сЬ КХазе-Егее РХазе ! еиЬег аз а зерагасе |сер дшш8 рип6садоп ог |и Йе загпе геасс(оп сиЬе сЬас и|6! 1асег Ъе ыед со зупсЬеыге сРХА (061|чогй апд !ч!ссаггеу !992; Ниап8 ес а!. ! 996; р1еазе зее |Ье епсгу оп РХазе 1 (п Лррепсбх 4). 1паспчасе сЬе гечегзе сгапзспрсазе Ьу !псиЬас!08 сЬе геаспоп ппхсигез Еог 1О тшисез ас 94'С. 5серз 3 апд 4 сап Ье сагпед онс ш а сЬеппа! сус!ег рго8гапппед чдсЬ а яп81е сус1е оЕ 37'С Еог ! Ьоиг!94 С Еог 10 пиписез, Ео1!о|чад Ьу а 4 С Ьоас Ор6гп!лоан сс!ЧА СопсепЕгабоп8: Ргерагаг!оп апе! Ап3р!ЕЕсса6оп оЕ 0ооЫе-51гапдед с0МА8 5ес ир ссчо зепез оЕ е(КЬс 05-т! атр1|6сапоп сиЬез.
ЕасЬ спЬе зЬои!д сопсаш: !Ох ашр!(6сас(оп Ьипег 2 р1 апсЬогед 3' о!(8опис!еос(де ргипег 2 р1 20 шм зо1исюп оЕ Еоиг дХТРз (РН 8.0) ! р! (а-||Р!дЛГР ог !а-||5]дАТР (3000 С((шпю!е) ! р1 НО 9 р1 5 ип!сз(р! сЬегпюзсаЫе РХА ро!успегазе ! ипи То еасЬ СиЬе, адд 2 р1 оЕ а д!ЕЕегепг агЪКгагу 5' ргппег.
М(х йе сопгепгз Ьу Сарр(п8 йе ядез оЕ сЬе шЬез. Сх|Ьегечег розяЫе, изе сЬе !Ох а|пр!|6садоп Ьийег зиррбед Ьу Йе гпапиЕассшег оЕ сЬе Тац РХА ро1ушегазе. 1псо опе зепез оЕ е!КЬс сиЪез, д!зрепзе -3-р1 а!!с!иосз оЕ йе гечегзе сгапзспрсазе геассюп сопса!и!п8 сЬе сезс КХА.
1псо йе ойег зепез оЕ е!6Ьс сиЬез д!зрепзе -З-р1 а1!с(иосз оЕ сЬе гечегзе сгапзспрсазе геас6оп сопса!и!08 йе ргерагапоп оЕ сопсго! КХА. С1озе йе сиЬез ап|1 ппх сЬе сопсепсз реп(1у. 11 сЬе йеппа! сус!ег !3 пос 6пед ичсЬ а Ьеасед 1!д, очег!ау йе геас6оп ппхсигез чч!(Ь ! |1гор (-50 р1) оЕ 118Ьс пппега1 о|1. Р1асе йе сиЪез |и йе йеппа! сус1ег. А|Ы йе 1011оиппд со йе аппеа!!пц геаспопз: 5х РР-РСК гечеле сгапзспрсазе Ьибег !00 гпм |КйюсЬгеао! 200 рМ зо1иС!оп оЕ Еонг дХТРз -25 ншь!р! р1асепса! КХазе !пЬ|Ь|сог 200 ип!Сз(р! гечегзе Сгапзспр|азе Н,О 4 р1 2 р1 2 р1 0.25 р1 0.25 р! со 20 р1 8.104 СЬаргег 8| 1п 110 о Атр!фсаг(оп о)РИА Ьу РСК АтрНу сЬе пис!ек асЫз ияпц сЬе ссепасигас!оп, аппеа!шц, апс( ро1у|пепгасюп сипез ап|1 се|прегасигез 1!асей !и сЬе саЫе.
ТЬезе сапе| аге зш|аЫе (ог 20-и! геасс|опз аьзешЫе|( |п |Ь|п-зча!!е|С оеигп! |иЬез ап|( (пспЬасе|С си йеипа! сус!егз зисЬ аз |Ье Регпп-Е!ше| 9600 ог 9700, Маз|ег Сус!ег (Ерреп|(ог!), ап|) РТС )00 (М) КезеагсЬ). Топе| ап|! |е|прегашгез и|ау пес|! |о Ье а|!арсе|! |о зш| о|Ьег |урез ог еийршеп| ап|С геасиоп чо!шпез.
Мох| |Ьеипа! сус!егзЬаче ап еп|С гопипе ш |чЬ|сЬ сЬе ашр!!Ее|С зашр!ез аге (исиЬасе|( а| 4" С ип6! |Ьеу аге гешоче|( (гош |Ье шасЫпе. Вашр!ез сап Ье (ей очаги(аЬс а| |Ь|з |ешрега|ше, Ьп| зЬои(6 Ье зсоге|( |Ьегеабег а| — 20 С. Ас йе епс( ог сЬе ргоцгат, геточе йе сиЬез Сгот йе йепиа1 сус1ег апс! ас!д 5 Сс! ог" 5х зе|1иепс!иц це1-1оайпц Ьи(Уег Со еасЬ.
5ерагасе сЬе гайо!аЬе!ес1 ргос!исса ог" йе геассюпз Ъу е1ессгорЬогеяз сЬгоицЬ ап е1ессго(усе цгайепс ро1уасгу!атЫе це! ог сЬе суре изес! Гог Р)х(А зес)иепс!пц. ИессгорЬогеяз !з сагпес! ас сопзсапс е!есспса! розчег ипи1 йе ху!епе суапо1 сгасЫпц с(уе Ьаз т!цгасес( аЬош ичо- сЬ!гаса ог" сЬе 1епцсЬ ог' сЬе це1 (р1еазе зее СЬарсег 12, Ргососо1з !О апд 11). Ргу йе це1 ап|1 ехрозе Й со аисогайоцгарЬк 61т. 10. Ехаиипе йе раяегп ог Р)х)А Ьапс(з апяпц ггот геасСюпз сопгашшц Йггегепг сопсепСгасюпз ог" сопсго1 апс( сезс рс(х)Аз. А цоо|1 д!СУегепс!а! сйр1ау сопсашз Ьесзчееп 100 апс( 250 |че11-гезо!че|1 Ьапйп ТЬе орсипшп апюипс ог сегпр1асе й)х(А чапез Сгот ргерагапоп со ргерагапоп апд ггот опе ра|г ог" рпгпегз со апойег. це!есс йе сопсепсгасюп ог сезс апсс сои!го! рх)х(Аз сЬас |чог1| |че11 зч!сЬ сЬе !агцезс пшпЬег ог ргипег ра|гз.
Ргерага6оп о1 АгпрИ!ес! С0!ЧАВ аког О!йегеп6а! О!Вр!ау Вереас йе аппеа!шц, гечегзе сгапзспрсазе, ап|1 атр1!С)сас!оп геаспопз ияпц аП соп|Ь|па- сюпз ог ргипег ра|гз апд йе орппшгп апюипс ог КХА сеп|р1асез. цес ир сЬе геас6опз |и 96- |че11 писгопсег р1асез дез!цпе|1 гог изе |и а йеггпа1 сус1ег. 5ерагасе йе ргос(исса ог" сЬе атр1!(!сас(оп геассюпз Ъу е!ессгорЬогеяз сЬгоицЬ ро1уасгу1ат!де зес)иепс(пц це1з, аз (и цсерз 9 апс( 10. Еоа|( |Ье |еас||опз депе|асс|С |чпЬ еасЬ рп|пег ра)г |п а|С)асепс !апез оп |Ье це), |.е., )ох|С йе геасЬоп оЬса(па|С |чпЬ ргипег ра|г А + В (гош опе КХА ргерага|юп пех| |о йе |еасиоп ойаспе|! чай роше| расс А + В Ьо|п йе о|Ьег КС4А ргерага|!оп.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
