Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 26
Текст из файла (страница 26)
бонье соипиегс!а1!18аье Ън!Еегь соисатн АТР. ЪЧЬеп ияи8 ьнсЬ ЪнЕЕегь, сЬе адйс!ои оЕАТР со йе !18а6оп геассюп Ь по 1оп8ег теин!гед. Саид!с)опь сЬас Еачог сЬе Еоггпаиоп оЕ пюпогпепс стгс!еь днпп8 !т8асюп аге ъче!! нидегьсоод ш сЬеогу ЕСо11ьпь апг1 Сьте!ьяпап 1984) Ъъп аге д!Ебсн!с со асмече ти ргас6се. ТЬе пю1аг сопсенсга6оп оЕ ЕЗЪСА еидь пшьс оЬчюы1у Ье 1оъч ш огдег со Еачог сЬе Еоппасюп оЕ шсгагпо!есн1аг огс!еь очег соисасеиасеь. Ноъчечег, и Ь д!ЕЕъсн!с то са1сн!асе ап арргорпасе сопсеисгабоп ъчЬеп сЬе Етт4А пъо1еси!еь тп сЬе роро)асюп дЬТег ъи ыае аид итЬеп йе ргорогбои оЕ дапъа8ед сепшш Ь ии)ъпоъчи.
Упдег йеье стгсшпьсапсеь, и Ь Ьеьс со ьес нр а ьепеь оЕ !!8асюи геас6онь ъч)сЬ ЕтЪСА сопсеисгастоиь гап8!п8 !гонь ! со !О Н8)ш! аид со саггу сЬе ргоднсп оЕ сЬеье геассюиь йгон8Ь сЬе ялЬьеъ)иенс ьсерь оЕ йе ргососо1. Ехсгасс сЬе 1)яасед РХА ъч)сЬ рЬепоЬсЫогоЕопп, апд сЬеп ндсЬ сЫого)опп а!опе. Ргесър!саге сЬе РЛЕА ъч)сЬ 0.1 чо1шпе оЕ 3 м ьодшгп асесасе апд 2.5 чо1шпеь оЕ есЬапо1. тъесочег йе ргессртСатег1 РХА Ьу септпЕи8атюп апг1 д)ььо!че Ь сп 10 тпМ Тг!ь (рН 7.6) ог Н 0 ас а сопсепсга6оп оЕ 100 )сп)ш1.
1п а ьтеп!е 0.5-тп! СЫп-ъча!1ед агпр1тЕсаСюп СиЬе, агЫ апг) пих тп йе Ео1!оъчш8 огг1ег: !Ох ашр1!Еса6ои Ьн)уег 5 н! 20 гпМ ьо!ибоп оЕ Еоиг дЪСТРь 1РН 8.0) 1 и! 20 им о!г8оинс!еодде ргЬпег 1 2.5 01 20 им о118опнс!еос)де рпгпег 2 2.5 н! ! — 5 ни!сь)ть1 сЬепиояаЫе 1314А ро1ушегаье С.О 01 Н,О 28 — 33 н! !18атед Сагир!аСе 13ЛСА 5 — 1О н! Тога! чо1нше 5О и! Ртогосо! 14: Епчетье РСЯ 8.85 ТЬе еЕВс!еису оЕ шчегзе РСР, Ь ьотег(гпез (тргоче6 Ьу аизрЕВсагюп оЕ 1!иеаг, гагЬег ЕЬап с!гси1аг, Ез)4А сегир1асез. 12иеаисасюп оЕ йе гегир!аге сап Ье асЫече6 Ьу йсеяшс сЬе с!гси!аг!хед то!еси!еь зч!ЕЬ а геьгпссюп еихугие сЬаг Ыеачеь ш гЬе тес!оп оЕ)сиозчи (35)А, Ьеичееп йе 5' гегпип! оЕ йе ссчо рпгиегь.
!Ееа11у, йе еисугие зЬои16 пос с!еаче ЕЬе ии)спозчп ье9иепсеь. АЬегпа6че!у, йе сгси1аг шо!еси1еь сап Ье Виеапаей а!Ьеи !ея еЕЕс(епг!у, Ьу Ьеаг!пЕ ЕЬе загар!еь го 100'С Еог 15 пииигез ЬеЕоге ьегг!пЕ ир гЬе атирЬВсабоп геасгюиь (Тг!Е!!а ес а!. ! 98В; ОсЬтап ег а1. !993). Еес цр сччо сои!го) геассюпь, 1п опе геассюп, шс)цс1е а!1 оЕ йе аЬоче геа8еись, ехсерс йе сегир1асе Е)ХА.
1п сЬе осЬег геас6оп, гер1асе (Ье сегир!асе зч((Ь а р!аяиЫ оЕ)споччи ыке, соигаш(ид (Ье Е))з(А спьегс Егогп зчЫсЬ (Ье 0118оицс1ео(Ые рпшегь счеге желчей ТЬе Вгьс сои(го! еиьцгеь йас аиу ргобцсс чиша1тхес1 )ь иос с1це со (Ье ргеьеисе оЕ ехсгаиеоць Т)ХА. ТЬе ьесоп6 сеьгь СЬе 66е!Ку оЕ йе РСК геаВеиья Саггу еасЬ соп1го1 геас6оп СЬгоцВЬ а!1 ьцЪьес)цеиг ьгерь оЕ 1Ье ргогосо1. 6. 1Е йе (Ьегша! сус!ег (ь иос Виеб чч((Ь а Ьеасе6 1Ы, очег1ау йе геас6ои пнхшгеь чл(Ь 1 с1гор (-50 р1) оЕ 118Ь( пциега1 о(1.
ТЬЬ ргечеись ечарогагюи оЕ ЕЬе ьагир!еь с(цг(п8 гереа(ед сус1еь оЕ Ьеа(108 ап6 соо1ш8. А11егиа6че1у, р!асе а Ьеаб оЕ зчах шсо ЕЬе шЬе (Е цяи8 Ьос яагс РСК. Р1асе йе сцЬеь ог ЕЬе ппсгойег р!асе (и ЕЬе ЕЬегша! сус!ег. АшрИу ЕЬе ицс!ек ас(6ь ць(иВ (Ье деиасцга6ои, аипеа1168, апд ро1ушепха6ои йиеь апс) сегпрегасцгеь 11ьсес1 (и йе !аЫе.
ТЬезе 6изеь аге ьшгаЫе Еог 50-и! геасцопь аззетЫе6 (и ЕЫп-чга1!ес( 05-т! шЬез аи6 !псиЬасе6 ги ЕЬеипа1 сус1егь зисЬ аз ЕЬе Рег!Вп-Е!гиег 9600 ог 9700, Маьсег Сус!ег (Еррепбог(), апс( РТС ! 00 (М) КезеагсЬ). Тииеь апд сетрегашгеь гиау пеев го Ье абарсед со ьшг ойег !урез о( е9и!Ртеиг аи6 геасиоп чо1шпеь. Моя сЬеппа1 сус1егь Ьаче ап еи6 гои6пе гп счЬ!сЬ йе акр!!Егеб загар!ез аге !исиЬасед аг 4'С ии61 гЬеу аге гегиоче6 Егопг ЕЬе пгасЬ!ие, 5агир1ез саи Ье !еус очеса!аЬЕ ас йгз сегирегагиге, Ьш зЬои!6 Ье ьгоге6 ЕЬегеа(гег аг — 20 С. ТЬе ехасс аипеа1!пс геизрегагиге зЬон!6 Ье еьсаЫ!ьЬе6 еизр!пса!1у Еог йе ригиег рапз иеей ги а Е(чеп агпр168са6оп геассюп.
Ап ехсеи6е6 ро!угиепхабои 6гие (ир со ! 0 пипигеь рег сус!е) ьЬои!6 Ье сг!ед !Е йе сагхес ЕЕЬ(А Ь !оиЕ (>4 ЕЬ). АИегиа6че1у ЕЬе иье о( пшгаиг ЕЬегтоьсаЫе ЕЗДА ро!угиегаьез ЕЬаг !ас!с ехопис1еазе асгпбгу (е.Е., Иеисзо! еихугие, АВ РергЫеь, 5с. 1.ошз, Миьоии) аи6(ог ЕЬас сои за(и а )осч)ече! оЕ 3 сехоии с(еаье ас6лгу (еЕ., Р(и, )теис, иг Веер сепг еихутеь Егоиз Ягагасепе аи6 Ь)езч Еис!ап6 Вю!аЬз, геьрес6че!у) гиау ргобисе !оихег сепгр!агез. АЬо, р!сазе ьее ЕЬе позе оп !опЕ РСЕ ш Ргогосо! 13, Яер 2. 7.
ХЕ(Ьдгачч а ьашр1е (5 — 10 ф) Егогп (Ье сея геассюиь аи6 (Ье сопсго1 геассюпь аис1 аиа1ухе йеш Ъу е1ессгорЬогеяь (ЬгоцКЬ ап аВагоье ог ро1уасгу!агиЫе ие!. Ве ьцге со Епс!цде 13)х)А гпаг1сегь оЕ аи арргорг(аге яхе. 5(аш (Ье де! зл(Ь ейЫшгп ЬгогиЫе ог 5'х'ВК бо1й А зиссеыЕи! агар!гКса6оп геасиоп зЬои)6 у(е!6 а геатВ!у ляЫе Г)ХА. ТЬе 16еис(су оЕ сЬе Ьаиц саи Ье сопйпиед Ьу РХА ье9иеис!иЕ (р!сазе зее СЬаргег ! 2, Ргогосо1 0), аи6(ог гезгпс6ои тарр!иа аи6)ог 5оийеги ЬуЬпйга6оп из!иа ртЬеь Ьопго1оЕоы со ЕЬе )спозчп РЫА ье9иепсе (Р!еаье зее СЬаргег 6, Ргогосо! 1О). !Е 1осч у(е1сЬ аге а ргоЫегп ьгаЬ (р!еаье ьее йе рапе рпгпегь 1 ап6 2. Н попьрео!Йс апзрИс ! Еса(са(6 е( а!. 1992).
Рго1осо! 15 Циап61абче РСК р СК СЛМ ВЕ 05ЕО то Е5т!Млте тнЕ СО!чСЕмтхлт!Ой о! а раг6си!аг гагре! !3Ь)А ог КЬ)А ге!абче го а ьгапдагд (гог геч(еччв, р1еаае аее Регге ! 992; Ро1еу ег а1. 1993; Каеутае)сего 1993, 1995; баме апд Адаточкх !994; Сгоаа 1995; Ке(асЫ апд КосЬапоиъЫ 1995; Ргеегпап ег а!. 1999; НаИогс1 !999) (р1еаае аее гЬе рапе1 оп КЕА!. Т!а4Е РСК аг гЬе епг1 ог' гЬ(х ргогосо!). Ногчечег, оиапг(га6че РСК, пюге йап апу ойег гогт ог" РСК, !а 1Пгегед гч!гЬ ЪооЬу !гара апс1 (а по! гог йе гесЬтса1- 1у сЬаПепдед. Ману ог йе д!гПси!г)ев яет 1гогп йе па!иге ог РСК 1гае)В Весаиае РСК ь ап ехропепба1 ргосея, япаП д(ггегепсеа !п еП)с(енсу аг еасЬ сус1е ог" гЬе геас6оп сап 1еас1 го !агре д!г'- гегепсеь ш йе уге1д ог йе агпр1Жед ргодисг. Лпуг)дпц йаг сап а(уесг ехропепба! атрППсаг(оп сап сотргот)хе циапг)га6оп ог" гагВег ьециепсея Рог ехагпр1е, йе ргеьепсе ог'д1(уегепг атоипга ог" шЬ(Ь(гога гп а аепеь ог" ьагпр1еь сопгашшц йе аате атоипс ог гегпр!аге 13!чА соиЫ 1еад го д1!Тегепсеа (п йе Впа! у!е!д ог" агпрППед ргодисг, аз сои!д япаП д)ггегепсеа ш ег()с(енсу Ъегччееп ргнпег ра(гь мед со атрПгу агапдагд апд !агнес аег)непсея 5о аепа!г!че аге РСКа го пнпог д(г"- гегепсеь гп сопд)гюпа йаг гЬе снег(к(епг ог'чапаЬг!ну ог'у(еЫ ог" атрПВег1 ргодисг (а гуркаПу 10 — 20% !п гер1каГе аатр1ех (е.д., р!еаае аее чгг)еьпег еГ а!.
!992; НгП еГ а!. !996; На!гогд ег а1. 1999). Рог гЬ(х геааоп, тегЬода йаг ягпр!у цианом(у гЬе апюшн ог агпрППег1 !3Ь)Л гЬаг ассити!агеа очег гЬе сомье ог а РСК (ао-саПед епд-ро!пг тегЬода) аге ВепегаПу гецагдед аа ипге1гаЫе.!п гесепг уеагя тоге аорЫагкагед тегЬода Ьаче Ьееп дече!оред 1п ы)дсЬ агпрППед РХА га оиапг!Вед диппВ гЬе ехропеп6а1 РЬаае ог" гЬе РСК.
ТЬеае тейодь, гюте ог" и ЫсЬ Ьаче Ьееп ашотагед (р!еаае хее йе рапе1 оп КЕА!. Т!МЕ РСК), Ьаче е1ппшасед пюсЬ ог" гЬе чапагюп аааосгагед чч!гЬ епс1-рогпг теахигетепг. Ап еаг1у гпейод ог" г)иапг(га6че РСК гпчо)чед сотраг(па йе апюипг ог" арес!Вс ргодисг Вепегагед !п д(ггегепс ьатр1еа Егот а рагбси!аг гаг8ег ьег)иепсе. 1п гЬ)а гесЬп!г!ие, йе атошна ог атр!Жед ргодисг ччеге гпеааигед аг аечега! 6гпе рошь дида гЬе ехропепба! рЬаае ог" йе геас6оп апс1 ~чеге гЬеп апа1угед Ъу Ппеаг геВгеаяоп ( чч(еапег ег а!.
!992; СП(уогд ес а1. 1994). 'ччЬеп гчогЫпа аг Ьа Ьеаг, гЬга тегЬод сои!д Ье иаед го дегесг ргсогпо!аг сопсепгга6опа ог' !агнес вес(пенсе апд ччаа ассигаге епоиВЬ со д)аг(пди(ьЬ гччого!д д(ггегепсеа гп сопсепгга6оп ог !агнес ьеонепсе (п д((уегепг аатр!ея Ноччечег, йе гпегЬод ойеп геП ргеу го гиЪе-го-гиЬе чапаЬг1ггу апд, Гог гЬ)а геааоп, (а по 1опцег (п сопнпоп ме. '1ъчо гуреа ог' сопгго1з с1еьспЬед Ье1очч сап Ье иаед го пюпКог гиЬе-го-гиЬе чапаЬПЬу: епдоВепоих агапдагда апд ехгегпаПу аддед гегегепсея ° Епдодепоиз хгапдагда аге сон!го! аес)пепси (миаПу Ьоиае)сеертц депеша ог йегг тКХАь) гЬаг аге ргеаепг (п гЬе аате ргерагабоп ог" РХА ог КХА аа йе сагцег аес)иепсея Яиап66саг(оп !а асЬгечед Ъу сопграпп8 гЬе апгоипг ог" акр!Бед ргос1исс Вепегагед Ъу гЬе 8.8б Рготосо! 152 Егиапт(тат(не РСК 8.87 епс1оцепоиа яапс)агс1 апс1 йе сагце1 оесртепсе (СЬе1!у ет а1.
)990). ТЬе тпейос1 ъног1с5 ъне!! !Е йе атпр!гбе6 ргобис15 аге шеаоиге6 диппц йе ехропеп6а! рЬа5е оЕ йе геастюп, !Е йе геЕ- егепсе ап6 тагцет оес)иепсе5 аге атпр1гбед ън!(Ь ес(иа! ейтстепсу, апд 1Е (Ьеу аге рге5епт тп тЬе Еатпр1е ат арргохтптате1у ес(иа! сопсептгатюп5. Ноънечег, 1Ье5е сопйтюпо аге гаге1у Еи!6!1ес1 Ъесаиое йе атпр1тбе6 ргобис(5 аге а!тпоот а1ъчауо 6!ЕЕегепт Егош йе епбоцепои5 геЕегепсе ти яге, оес!иепсе, ап6 аЪипбапсе. ТЬеое ипЬа!апсе5 Ьетънееп геЕегепсе апд тагцет Ьесоше тпаш- ЕеЯ ао оуьеша6с 6!ЕЕегепсе5 ш атпр116са6оп ейк(епсу Ъетъчееп (Ье тъно пис!ек ас(65.
1п адй6оп, йеге Ь по циагаптее йат йе Ьоиое)сеер!пц цепе5 сЬооеп а5 епйоцепоио 5(апс)агс)5 аге шнапапт ш йетг!ене!5 оЕ ехрге5яоп Егош опе оашр!е то йе пехт. ТЬе )ече(8 оЕ ехргехаюп оЕ 1Ье5е цепе5 аге пот сопотапт Егош опе тпапппа1тап 655ие то апотЬег пот Еготп опе се11 1тпе то апотЬег (е.цо р1еаое Еее Мапоит ет а1. 1993; црапа1сЬ 1993; ВЬа6а ет а1.
1994). ВВ(Тегепсео ти (Ье апюипт оЕ ашр11Ете6 ргосЬлсс цепегатед Ьу йе геЕегепсе апс1 йе тагцет шау йегеЕоге геаиИ 6отп с1!ЕЕетепт!а! ашр116сабоп ог Егош сЬапце5 тп (Ье 1ече! оЕ тгапоспртюп оЕ тЬе тагцет цепе апдсог йе яапдагд цепе, ог Етош Ъой. ° .ЕхтегпаИу асЫесЕ геЕегепсе шо!еси! ео аге Е))ь)А5 ог тат )А5 йат аге асЫес1 !и 1споънп ашоипь то а оепео оЕатпр116са6оп геас6опо (ЪЧапц ет а1.
!989; С!!1!)апд ет а!. 1990). Весаиое тЬе геЕетепсе тетпр!атео апд тагцет оес(иепсео аге ргеоепт тп йе 5агпе атпр116са6оп геастюп ап6 иое йе Еатпе ргипего (р1еа5е оее Ье1оън), йе еЕЕест оЕ тЬе чат)аЫео шеи(!опед еаг!тег !5 пи166ей Циапт!Етсатюп и асцценед Ьу сотпраппц йе апюипт оЕ ашр!(Ете6 ргодисто цепегате6 Ъу йе теЕетепсе апд татцет оес!иепсе5. ТЬе ригроое оЕ йе ехрегипепт — то Его оит (Ье га6о оЕ геЕегепсе Еес)иепсео то тагцет оес)иепсео ш йе геастюп пихтиге ат сус1е гего — сап Ъе асЬ!енес тп тъно ънауо.
А оепео оЕ геасбоп5 сап Ье Еет ир соптатшпц йЕЕегепт гатю5 оЕ геЕегепсе ап6 тагцет ию1еси!е5. А сигне Ь сопоттистед 5Ьоън(пц тЬе ге1атюпЕЬ!р Ьетънееп тЬе аиюипт оЕ ашр1(Егер ргодист ап6 (Ье апюипт оЕ геЕегепсе а6606 то тЬе геастюп. ТЬе татцет оес)иепсе сап тЬеп Ье с!иап66ес1 Ъу шсегро1атюп (р!еа5е Еее Буше 8-8). ТЬи5, !и а геас6оп тЬат у!0165 есрта! атпоипь оЕ йе тъно атпр1гбе6 ргодис(5, йе гатю оЕ тагцет шо!еси1ео то геЕегепсе ию1еси1ео ат йе Ьец)пи!пц оЕ йе РСК и оа!6 1о Ье шиту.
Ноънечег, (Ь15 сопс1ияоп !5 ттие оп!у тЕ ашр!16сатюп еЕ6- степс!ео оЕ тагцет апд геЕегепсе шо1еси1е5 аге ес)иа! (ЬгоицЬоит (Ье соигое оЕ йе РСВ.. М 0 1 0.2 0 4 0.8 1.6 3.2 6.4 12.8 25.6 15 -1.5 -1.5 -1 0 -0.5 О 0 О 5 1.0 1.5 1.00 (ЬРЙР1), аоооъо1е* Г!С())ТЕ 8-8 Оиапт!(ат!оп оЕ птй)ь(А Ьу Агар!(Еу!пц Нату)пц Агпоип(6 о( а 5(апс)агс) Вчат!не) )3)ЧА Гга шеп( ъч!(Ь а Сопотап( Аптоипт о( Сопъ е6(ог 0)ъ)А !п (Ь)5 ехагпр(е, а (гацгпепт о( пат)че Ьочгпе ГР гесертог с(3)ОА (ЬРСГ1) Ь агпр((()ес( )п йе ргеоепсе о( а соптрейог (гацгпепт о( Ьоч1пе ГР гесертог (1)4А саггу)пц ап )птегпа! с!е(етюп о( 55 Ьр (ЬРСГ1ст55).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
