Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Роо1а оЕ ЫКЬ1у децепегасе рптега !ечеп сЬоае сопяадпц оЕ а пихсиге оЕ 60 ог тоге ййегепс о!!цопис1еос!деа) ъчог1с ъчеП !и РСК (Ягц!а ес а1. !988; КпосЬ ес а1. 1988; 1.ее ес а1. 1988). !п сЬе яапдагд МОРАС ргоседиге, йе агпспо-сегинпа1 апд сагЬоху-септнпа! аеъ!иепсеа оЕ а рерСЫе аге цаед Со ссеяцп Съчо гедипдапС ЕатРдеь оЕ о11цоиис!еоСЫеъ епсойпц йе анино- апд сагЬоху-сегпипа1 аес!цепсеа оЕ сЬе рерсЫе (Еее ес а1.
1988). ТЬе ргстега аге цаед еЬЬег со аспр!1- Еу а аецтепс оЕ сР)ъ)Л ргерагед Ьу КТ-РСК !гоги а ссяше )споъчп со ехргеаа сЬе ргосесп ог со атр11Еу а ьецтепс оЕ РХА Егот ап еасаЫ)аЬед цепопцс ог сР)ъ)А 1сЬгагу. Весацае сЬе!епцй оЕ сЬе рерсЫе са )ъиоъчп, сЬе яхе оЕ сЬе ехрессед 1'СК ргодисс сап Ье ргейссед ехасс1у. Айег це! е!ессгорЬогеа!а со геао1че йе атр166садоп ргодцсся РХАа оЕ йе соггесс ыхе аге 1ао1асед, с!опес1, апд ьеъ!иепсед. Ас 1еая вите оЕ йе с!опек аЬои)д сопсаш а Р)ъсА аецтепс оЕ йе соггесс 1епцсЬ йас арес)Есеа сЬе ъесрлепсе оЕ йе асагдпц рерсЫе.
Опсе Ыеп66ед, йе епдге с!опеъ1 аецтепс ог йе ишъ!це аессцепсе 1ушц Ьесъчееп йе пчо о1сцопис1еосЫе ргстега са цаед аа а ргоЬе со асгееп а сРХА 1сЪгагу. ъгапасюпх оп сЬ)а цепега! ргососо1 1пчо1че: ° 17х!пц децепегаге о!!цопис1еог!де рптегх Нег!чед Егот пчо ьератаге рерг!де ьег1иепсеь, еасЬ ас 1еаас 6-7 анино ас)да ш 1епцй, со агпр11Еу йе аецгпепс оЕ РХА йас содеь Еог сЬе сгасс оЕ апцпо асЫа 1осасес1 Ъесъчееп йе съчо рерсЫея %псе 1и тану сааея сЬе ге1асие опепсадоп оЕ йе рерсЫеа 1п йе ргосесп ъч61 Ъе ип1споъчп, роо1а оЕ децепегасе о11цопис1еосЫеа с1епчес1 Егоги Ъой ягапсЬ оЕ сЬе Р)ъ)А тиас Ъе ьупсЬеяхес1 апс1 цаед сп ЙЕЕегепс сотЪспасюпя ТЬе 1епцй оЕ йе агпшо асЫ аеъ!иепсе 1успц Ьесъчееи йе съчо рерсЫеа тау а1ао Ъе ип)споъчп, ъчЬ!сЬ е1нпшасеа йе роаяЬс16у оЕ рипЕуспц а РСК ргос1исс оЕ йе соггесс 1епцй рпог со с1ошпц.
° Есх!пц оа1у опе децепетаге рг!тег т сотЬтапоа ъч!ЕЬ а ипщае рптег сЬас Ьспда со йап1с1пц ееъ!иепсеа ис йе с1опспц чессог ог со а ъупйедс Ьогпоро1угпегк са11 апасЬед со 6гязсгаид сРХА. ТЬе сЬ!еЕ ргоЫет ъчссЬ сЬ)а арргоасЬ 1а сЬе ЬсцЬ Ьас1сцгоипд оЕ с!опеь сЬас геаи1са Егот ияпц а ргцпег йас гесоцпсхеь ечегу с1оие ш а 1сЬгагу. 1Е ъийксепс апнпо асЫ аеъ!пенсе са ача11аЫе, а аесоиъ1 аес оЕ о11цопцс1еосЫеа сап Ье цьед со ргнпе а пеасед РСК ияпц РХА сетр1асеа цепегасед Ьу сЬе опц)па1 оисег ргцпег расг. ТЬе сгис)а1 асер 1и МОРЛС 1а сЬе деяцп оЕ децепегасе роо1а оЕ о11цопис1еосЫея А1йоицЬ по ги1еа ех)ас йас циагапсее ае1есдоп оЕ йе соггесс содоп ас а роядоп оЕ агпЬсцшсу, йе сЬапсе оЕ ацссеъа сап Ъе 1псгеааед Ъу Ео!1оъчспц сЬеье анпр!е ги1ея ° 17хе г!ге гец!оп оЕ йе ача!1а1л!е атто ас!д зедиепсе сЬас Ьаа сЬе!еаас децепегасу.
!Е ротЫе, сЬооае а гецсоп сЬас 1а псЬ си Мес апд Тгр, еасЬ оЕ ъчЬ)сЬ Ьаа опе содоп. Суя Аар, б!и, РЬе, Нся Еуя б1п, апд Туг аге а1ао деягаЫе апнпо ас!да Ъесацае йеу еасЬ Ьаче оп1у съчо содопя АчоЫ гец!опа псЬ сп Ееи, Лгц, апд цег (еасЬ арес!Есед Ьу ях сидона). ° Рех!цп йе 1опцехг рптетх рохх!1л1е ъчнЬоис а!1оъчспц йе пшпЬег оЕ о!!цопис1еоссдеь ш йе децепегасе роо1 со ехсеед 64. ТЬе ьресгбсду оЕ ргцпега геъ1исеа таг)сеъ1!у ъчЬеи йесг 1епцсЬ 1а (17 пис1еосЫея Вой йе ецбссепсу апд арес)Есс!су оЕ рпинпц Ъу децепегасе роо1ь оЕ о!сцопис1еосЫеа десгеаае аа а 6лпссюп оЕ йе!г согпр1ехну.
° Сопли!1 гаИех оЕсодоа ихаце ('ъъгада ес а1. 1992; р!еаье аее Аррепйх 7). Рог анино асЫа аресг6ед Ъу сЬгее ог тоге содопя цае йе съчо сидона йас аге тиас ргеча!епс !и цепеа оЕ сЬе огцашяп ипс1ег асцду. 8.68 СБаргег 8: Еи 'ч(гго Атр1фсапоп о( ВХА Ьу РСЙ ° !Лтеп песеззагу, !гт)г гЬе гуецепегасу о( ргттетз Ьу пяп8 а пп)чегза1 ппс!еогЫе зпсЬ аз шояпе, ъчЬозе пешга1 Ьазе, ЬурохапгЫпе, Еогшз яаЫе Ьазе ра!гз ъч(гЬ сусояпе, йупппе, апс1 аъ!епше (р1еазе зее йе (п(оппаНоп рапе1 оп йе Ъ35Е ОГ !ХО5!ХЕ!Х ОЕОЕХЕКАТЕ РООЕ5 ОГ ОПСОХГЗО.ЕОТ!ОЕ5 $35ЕО РОК РСК).
° Ъйиегечег роззтЫе, епгг гЬе о!ъдогтс1еогЫез аг а Мег ог Тгр геяг(ие. ТЫз зггагецу Вцагапгеез гЬаг гЬе йгее ппс1еогЫез аг гЬе 3' епг)з оЕ аП оЕ йе о!г8оппс1еогЫез ъп йе йе8епегаге роо1 ъч(11 Еопп ап ехасг шагсЬ ъчЬЬ гЬе !агапе! зеппепсе ргес!зе1у. А1гегпаВче!у, епъ( йе о!18опис1еогЫез аг йе зесопь! РояНоп оЕ а содоп зрес(Еу(п8 Суз, Азр, О1п, РЬе, Н(з, 1.уз, С1п, ог Туг. ТЬ!з зъгаъе8у Кпагапъеез йаГ йе Гъчо Ьазез аъ йе 3' епъ(з оЕ а11 оЕ йе о1!Вопис1еоГЫез ъч(11 гпагсЬ йе гаг8ег зе~)пепсе. Еъо пог пзе (пояпе аг йе 3' епг) оЕ йе г)е8епегаге о1!цоппс1еогЫез (5опнпег апг( Тапгг !989). Аз ъч(гЬ ойег !урез оЕ РСК, гЬе 5' епг! оЕ йе де8епегаге о118оппс1еогЫез шау Ье г)еыцпед го саггу геяпсгюп ягез апг( огЬег пзе(п! Ееагпгез.
ТЬе !3ХА гешр1асе Еог МОРАС геасВопз сап сопз(зг оЕ с(3ХА ргерагед Егош а зоцгсе гЬаг ехргеззез йе Гаг8еъ ргоъеш, цепопис 13ХА, ог Го!а! ЕЗХА Егош а с)3ХА ог Вепопнс 11Ьгагу (гергезепВп8 аг 1еазг 10з со 10 с1опез) йаг гз йопВЫ го сопса)п йе с!3ХА ог Вепе оЕ )пгегезг. 1Е йеге (з ппсеггашгу ге8агсВп8 йе г)ззпе зрес(Еъс)гу оЕ а рагВсп1аг шКХА, згагг ъч(гЬ с(3ХА ргерагег( Егош а г(ззпе ъч)гЬ а Ь(8Ь сопър1ехТу оЕ сгапзсг!Ъеъ! Вепез, зисЬ аз йе шапппа1(ап Ьгаш (5иъс11ЕЕе 1988) ог !гош а зопгсе оЕ Вепп се11з (е.8., шапнпа!гап Гезъез; 5ГгаГЬшапп еъ а!.
1989). 1п ГЬе сазе оЕ сЕЪХЛ 11ЬгаПез с1опес( 1п ЬасъеПорЬа8е ). чесъогз, ап а1к)пог оЕ ГЬе ЬасъепорЬа8е ргерагагюп (гзе!Е сап зогпеВгпез Ье агпр!(Еъеь! ъч(гЬопг рпПйсагюп оЕ гЬе Е)ХА. Ноъчечег, 1п Вепега1, гЬе с1еапег гЬе шрпг гешр!аге, йе гпоге еЕЕгс)епг гЬе МОРАС геасгюп.
1г (з еззепг)а! го гепюче апу ргнпегз пзег) го Вепегаге гЬе с(3ХА гегпр1аге Ьу сепгг(Еп8аг)оп гЬгопВЬ Сепггкоп- 100 шкгосопсепГгагогз (Ргогосо1 3) Ье(оге саггу!п8 опг йе МОРАС геасг)оп. Рша11у, роо1з оЕ Ь!ВЫу ъ(е8епегаге ргппегз сап Ъе пзеь! !ог ршрозез огЬег гЬап го с1опе Вепез !гого Ега8шепгагу ргогеш зеъ!пепсез, шс1пг!1п8 !зо1агюп оЕ шешЪегз оЕ пш1г18епе Еаш!1!ез Егош а рагпсп1аг зрес(ез (е.8., р1еазе зее ВпсК апг( Ахе1 1991) апъ( 1зо1аг(оп оЕ йе Ьошо1о8опз Вепез Егош ъ(!чегзе зрес(ез (р!еазе зее гЬе зесбоп Ье1оъч, 5сгееп!п8 оЕ ЫЬгаПез Еог Ке!агег( бепез 11яп8 МОРАС; Еог геч(еъчз, р1еазе зее Ргезгоп 1993; Ресегзоп апъ( Трап 1993). Н!ВЫу с(е8епегаге ргппегз гпау а1зо Ье пзед Еог гарЫ апър116сагюп оЕ с(3ХЛ епъ!з (5'- апъ) 3'-КАСЕ) (р1еазе зее Ргогосо1з 9 апс( 10) (РгоЬшап ег а1. 1988).
йСКЕЕ)ЧПЧС ОЕ Ь1ВКАК!ЕЬ РОК КЕ1АТЕ0 СЕ)ЧЕБ 1)БИЧС МОРАС 'ъгаг)аг!опз оп йе МОРАС йеше сап Ье пзеъ1 го (зо1асе шешЬегз оЕ а шп1г(8епе Еапп1у (е.8., р!еазе зее Впс1с апъ) Ахе1 1991), Ьогпо1о8з Егогп ечо1пВопаП!у ъ!(зъапГ зрес(ез (е.8., р!еазе зее 1еъч!з апг( Ре! Ьаъп 1990), ог сзоаугпез (е.8., р!еазе зее 5ъгаГЬшапп еъ а!. 1989). Рог зисЬ ригрозез, о118оппс1еогЫез гергезепВп8 апппо асЫ зес(иепсез сопзегчеъ1 Ъегъчееп шегпЪегз оЕ ргоге!и Еагш1гез аге пзеь! аз рпгпегз го зсгееп с(3ХА ог Вепогпк 1ъЪгаПез. ТЬе ехасг яхе оЕ гЬе йеягег( ргог(пег саппог Ье ргег)1ссеъ) ъчКЬ сопЕЫепсе Ъесапзе шзеггюпз апъ( г)е!ег)опз гпау Ьаче оссиггеъ( ъ(пг)п8 ечо!пгюп оЕ гЬе гаг8ег Вепе. Ноъчечег, ашр11Еъег) ргос(псгз йаг Еа!1 ъч(гЫп а сЬозеп яхе гап8е сап Ъе (зо1асег( апъ! апа!ухей 1п гЬе г)ея8п оЕ йе о)!Коппс!еогЫе рпшегз апъ! гЬе сЬоке оЕ згагбп8 гешр1аге, геазопаЫе аззпшргюпз сап Ье гпас1е сопсегп)п8 йе роягюпз оЕ шггопз 1Е а Вепе зггисгпге оЕ а Еапп1у гпешЬег ог Ьопю!о8 1з (споъчп.
Ргогосо( !!г М(хег( 01(еолис!ео((г(е-рг(тег(Атр17(гсас(оп о)г сРИА 8.б9 МАТЕКЕАЕЬ йг 1МРОКТАХТ То гес(исе йе сЬапсе о( соп1ат!пабло гМГЬ ехобепоиь 0ХАь, ргераге апг( иье а ьрес)а! ьес о( геаПеп(ь апг! ьо1игюпь Гог РСК оп!у. Ва(се аП 61аььгчаге Гог 6 Ьоигь а! 750'С апс1 аи(ос1аче аП р)аьбсччаге. Еог слоге !п(оггпаиоп, р)еаье ьее ГЬе рапе) оп СОХТАМ1ХАТ!ОХ !Х РСК (п йе сЬар1ег !л(гос!исбоп. СА()Т!ОХ: Р!еаье ьее Аррепг!1х 72 Еог арргорпа(е Ьапг111пе оЕ гпа(еПа1ь тагЬег! чч11Ь <! >. ВпЕЕеу5 ап(Е Ьо!06оп5 Р!еаье ьее Аррепс!!х 7 Еог согпропеп!ь оЕ ь1ос!г ьо1иоопь, Ьипегь, апгЕ геадеп(ь. 011и1е ь1ос(г ьо1иПопь 1о !Ье арргорпа1е сопсеп1га1гоп.
уох АтрИса((ол Ьи((ег сГХТР ьо(ипол (20 тм) сол(ат(лд а8 Гоиг с(ХТРь (рН 8.0) ВНЕЕеу5 ТЬегтоь(аЬ(е 0ХА роlутегаье Таг( ОХА ро1угпегаье и йе агапе(агг) апг( арргорпаге епгуте Еог ГЬе агпр!г6сабоп ьгаце о( пюьг (ость о( КТ-РСК. Ноччечег, иЬеге е1опцапоп Ьопг 3'-т!ьгпагсЬег( рптегь Ь ьиьресгей, а ГЬеппоьгаЫе ОХА ро1угпегаье гч!гЬ 3' — г5' ргоо6еагпп5 асгпПгу тау Ье рге(еггег( (СЬ1ап5 ег а1. 1993). Епкуепе5 ап(Е Се!5 Ро(уасгу!алис(е Пе( < ! > Р!еаье ьее 5гер 4. )х(пс!еьс АСЕГЬ ап(Е О!коппс!еоЕЫе5 Г)ХА Гетрlа(е (700 р8/т)) (СОХА, шепот!с 0ХА, ог СОХА 1(Ьгагу) (л ТЕ (рН 8.
О) Апу ОХА йаг солса(пь йе саг5ег ьег)иепсе(ь) сап Ье ыеа аь а гепгр(асе гп МОРАС геасиопь. Оепот(с ОХА, ипс!опт ргерагагюпь о( СОХА, ог сОХАь ехггасгег( Ггогп еьгаЫЬЬед 1гЬгапеь Ьаче аП Ьееп гиеа ьиссега(иПу. Ногчечег, гЬе сЬапсе оЕ ьиссеы гпсгеаьеь аь а Еипсгюп оЕ гЬе сопсепсгапоп оГ гагВег ьег)иепсеь гп ГЬе ргерагаг!оп.
ТЬия сРХАь ргерагед Ьопг пгКХАь гЬаг сопгагп ГЬе гагВег ьециепсе т аЪипгГапсе аге пгоге !Еее1у го госсет йап ГЬе соггеьропгппц Вепопгк ОХАь. Аь гп аП Еоппь о( РСК, ГЬе с1еапег гЬе гегпр1аге ОХА, гЬе пюге ейккпг йе апгр66сабоп. ХечеггЬе(еьь, гп гЬе саье о( сРХА 1гЬгапеь с!олег! т Ьассег)орЬа5е 'ь чесгогь, ап а1и!иог оГ йе ЬассегюрЬаВе ргерагагюп Гие!Е сап ьопгеПгпеь Ье иьег( аь а гепгр!аге ирои! ЕгигЬег рипбсаиоп оГ ГЬе РХА. Ве(оге саггу!пВ оиг ГЬе МОРАС, Ь и егаепба1 го гегпоче апу рбтеи (ьисЬ аь оПВо (гЕТ! ) йаг иеге пьем го ргппе ьупгЬеяь оЕ СОХА !егор!агеь (Еог гЕегааь, р!еаье ьее Ргогосо) 3).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
