Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 16
Текст из файла (страница 16)
1994). Ро!у(А)+ Ь ргегеггеъ( ая а гепър1аге Гог аП Голля оЕ КТ-РСК ъчЬеп ъЬе гаг8еь гпКМА ы ехргеме0 аг 1оъч аЬипг)апсе. КМА яшгаЫе Еог сье ая а сагир!аге )п КТ-РСК ъпау Ье ргерагес) Ггот яиаП пшп!ъегя оЕ си!сигея) се16 ая ЕоПоъчя РеПеь йе сеПя (1Π— 100 сеПя) Ъу сепгпГн8агюп Еог 5 яесопъь ас 4'С ъп а пнсго(и8е. П. Кеиюче йе яирегпагапг Ьу аяръгаПоп. АгЫ 10 — 20 И! оЕ ап ке-соЫ 1уяя яо1шюп оЕ 05чуч МопЫег Р-40 (мр-40), 10 гим тггяс1 (рн 8.0), 10 гпм мас1, 3 гим )ч(8с! .
3гоггех гЬе шЬе чегу Вепг!у го гПярегяе йе сеПя йгонВЬоиг сЬе 1уяя яо1шюп. ш. 5гоге йе гиЬе Еог 5 пнпшея оп ке, апг) йеп сепъпри8е аъ таятит ярееъ) Еог 2 пипигея аг 4"С (и а иного(и8е. Уяе йе яърегпагапг сПгесс!у ая ъЬе гегпр1аге ъп а сРМА-с1лчеп РСК ая ъ)еясг)Ьеъ) Ъе1ош Мосе йаг гг тау Ье песеыагу го сапу оиг ргеПпнпагу ехрепгпепь го де!ест(пе йе орПипип сопсепъгаПоп о( МР-40 ш йе 1уяя Ьибег. ТЬе сопсепггагюп оЕ 0.59ч гесоттепе)ее) !и йе ргогосо! ъчог)ь ъчеП Гог !угпрЬосугея.
Н)ВЬег соисепггаг)опя тау Ъе гег)и)геъ) Еог ойег сурея о( тапнпа1ъап сеПя. Ргогосо! В: Атр317гсаг1ол оГсо37А Сепегагег3 Ьу Яечегье Тгапьсг1рг1огг оу" гпЛНА В.51 прес!а! Ес!и!ргпепГ Вагг3ег Брь Еог аиготапс тЕсгоргреггеь МЕсгоуиВе гиЬеь 30.5 т3, !ЬЕл-чча33ес3 Еог атр3сасабол) ог Мкгойег р3а!еь Роь313че-с3гьр3асетелг рЕреПе ТЬегта3 сус!ег ргоВгаттес3 и43Ь с3еь3гег3 атр316сапол рго!осо3 !Е ЕЬе гЬеппа! сус1ег ь пог егЕигррес3 гей а ЬеагегЕ!Ы, гье егйег пипега1 ог1 ог рагаГЕгп яах го ргегепг ечарогапоп оЕ!гашо !тоги йе геасиоп пихшге гЕиг1п8 РСК.
Яагег Ьайь ргеьег !о 75 С але! 95 С АЕЫЕГ!опа! КеацепГ5 53ер В оГ!ЬЕь ргоГосо3 гес3и3геь ГЬе геаделгь 33ьгег3 т СЬаргег 5, Ргогосо3 2, СЬаргег 72, Рго!осо3 6, ог СЬаргег 6, РгоГосо3 70. 5гер 70 оЕ йь ргогосо3 гег3иЕгеь !Ье геаделгь 33ьгес3 Ел Ргогосо3ь 3 алс3 4, 5, ог 6 оЕ йгь сЬаргег. МЕТНО0 1. ТгапьГег 1 ра 1о 100 пп оГро!у(А)' тй1ьА ог 10 ра !о 1 Нц оГ Сога1 Рс! ЕА го а ЬеьЬ писгоГипе 1иЬе. АЕГ1им йе чо1ите го 10 Н1 ъч11Ь Н О. Г7епагиге йе гс!хА Ъу Ьеаппц а! 75'С Гог 5 пипигеь, Го!!оччегЕ Ьу гар1гГ сЬ1!!1пВ оп ке.
2. То 1Ье с1епа!игес! К! ЕА агЕй 1псиЪаге йе геас1юп Гог 60 пшш1еь а1 37"С. М8С1 ы асЫед го гпеег ЕЬе пеег!ь оГ йе гечегье ггапьспргаье. ТЬе оргипшп гаГю оГ рппгег го гепгр!аге ьЬои!0 Ье ашегга1пеа епгргпса1!у Еог еасЬ ргерагагюп оГ КЬЕА. Аь а яагип8 рошг Гог оршп1хагюп, гче гесопнпепа аасВп8 чагуш8 апюипь оГ рпгпегь со 20-Н1 геасиопя ьупйеис оаоопис!еогЫе сошр1ешепгагу го ЕЬе гагоег КЬЕА: 5 — 20 ршо!еь оЬ8о!г!Т1„ ОА-О.5 Н8 гапгЕогп Ьехапис!еогЫеь: ! — 5 Н8 сРЬЗА ьупгЬеяь сап Ье шеаьпгеа Ьу гЕегеггпшш8 йе ргороггюп оЕ гаспоасичпу шсогрогагегЕ ш геасгюпь йаг Ьаче Ьееп ьпрр1егпепгед чай 10-20 НСг оЕ ! яр! г1СТР Еьр. асг. 3000 Супипо1е1.
ТЬе ь1хе оЕ йе Вгя-ягапо сРХА пю1еси1еь сап Ье еьгипагегЕ Ьу е1есггорЬогеяь ЕЬгои8Ь а13га!1пе а8агоье 8е!ь ЕР1еаье ьее СЬаргег 5, Ргогосо! 8!. 5ег ир йгее пса!Гче сопгго1 геасбопь, 1п опе геас!юп, Епс3исЕе а!1 оГ йе согпропеп!ь оГ 1Ье Гггьг-ьггапс! геасгюп, ехсер! ЕЬе К!хА !егпр3а!е.
1п апойег геасгюп, гпс!ис1е аГ1 оГ ЕЬе сошропепьи ехсерг ЕЬе гечегье ггапьспргаье. Ош1! ргипегь Ггогп !Ье й|гс1 геаспоп. Саггу йе сопсго1ь йгоиВЬ а31 ьиЬьег!иепс ьгерь оГ!Ье рго!осо!. ТЬеье сопсго!ь ргочЕЕЕе геаььигапсе ЕЬа! йе сГ7ЬЕА ргос1ис! ь пог гЕие 1о сопгапипа!юп ог ье!Г-рппипц Ьу К!чА. '1ЬгЬепечег рояй!е, ьег ир рояиче сопгго1ь сопгашгп8 чагуш8 ашоипь о! ап ехо8епогь ге!егепсе КЬЗА ег3игррегЕ и Ей а ьес оЕ ргипег аппеа!ш8 ягеь Ыеппса! го йоье иьег3 ш йе аийепгк гагоег 10х ашр!гаса!!оп ЬиЕЕег 20 гпм ьо!ипоп оЕ Еоиг г!ЬЗТРь ЕРН 8.01 рпгпегь Еорппитей р1еаье ьее Ье1о~ч3 -20 иппь3Н! р!асепга! К!чаче шЬгЬЬог 50 шм М8С! 100 — 200 ипгьЕН! гечегье ггагьсггргаье Н,О 2 Н! ЕН! 1 Н! 1 Н! 1Н! 1Н1 ю 20Н! 8.52 СЬарсег 8| Ги (7(сго Аиср11)ссас(ои о)'РНА Ьу РСВ КХА (Ъчапд ес а1.
1989). ЪЧ!|Ь югпе согеядЬЬ и и о(сеп роаяЫе со депегасе ап арргорпа|е геЕег- епсе Ьу с!опшд аупйебс сор|еа оЕ сЬе кепке ап6 ап6аепае рпи|ег-Ь~псдпд ясса оп еиЬег аЫе оЕ ап еходепоы Г)ХА аег)иепсе. ТЬе гесо|пЪ|паис с1опе |пау сЬеп Ье сгапасг(Ьед |п лсго шсо ап КХА секир!асе йас сап аегче аа а рояьче сопсгос Ги КТ-РСК. 1пасбчасе сЬе гечегхе сгапаспрсахе ап|1 с(епасьге йе сешр!асе-СРХА сошр1ехех Ъу Ьеас(пц йе геасбоп со 95'С Гог 5 пппьсея ТЬе сечете |гапаспрсаае гиия Ье шас6чапЫ со си|юге е(дс|епс аупсЬеяа Оигсид йе а|пр1!Вса6оп РЬаае о( КТ-РСК (де11пег ес а!. !992; СЬшпа)|оч 1994).
5оп|есипеа, шасьчасюп оЕгечегае сгапаспрсаае Ьу Ьеас |а пос аиГЕ|ссепс, 1с )а |Ьеп песеяагу со риьГу йе вегас-асгапд сТ|ХА Ьу ехпассюп |чиЬ РЬепоьсЫогоГопп ап6 ргес|рьасюп чпй есЬапо! ЬеГоге аесбпд ир сЬе РСКа. РгеашпаЫу, сопсапипапь гп йе гечегае сгапаспрсаае епкугпе 1еа6 со а Оесгеааед еДдс|епсу о( йе аи|р1|дса6оп геассюпя Ас!)ьхс сЬе геассюп ппхсьге хо сЬас и сои!а(пх 20 рпю!ех оГ сЬе кепке апс! ап6зепхе рпшегя ТЬе 20 рию1еа оЕ апьаепае о! Гдопис1еосЫе рпп|ег |п йе агирЬдса6оп геас6оп (ос!идее апу депеарес)Яс о!|допис1еосЫе ые6 |о роше йе аупйеяа оГ йе Влс-ягапь с)3ХА. ТЬе ргеаепсе оЕ ехсеаа о1)допис!еосЫе рпгпега сап!еа6 со агпр!|дсасюп оГ ипьеягаЫе (попсагдес) аег)иепсеа, |чЬегеаа а ОеагсЬ оЕ ргипега гедисеа сЬе ед)с)епсу оЕ а|пр1|дса6оп.
!с и|ау Ье песеыагу |о гепюче ехсея о1(допис1еосЫе ап6 гап|!оги Ьехаи|ег рьшел Гго|п сЬе сс)ХА ргерагаьоп ап|! йеп со ор6- пике сЬе сопсепсгаьопа о( сЬе кепке ап6 апс(хапае рпшегв ш йе агир1|дсаьоп геасс!оп (р1еаае аее дгер 3 оЕ РгоСосо! 9). Ас!|1 со сЬе геассюп ппхсиге: 1х агпр1(дсасюп ЬиЕЕег (ог чо!шпе гег)шгед Со Ьппд геасьоп пихеиге Со 99 ИИ 1 — 2 ипьх йеппоасаЫе )3ХА ро!ушегаае 77 и1 ! 01 1Е йе йеппа1 сус1ег 15 поС Г)С!ее! сч)СЬ а Ьеаге|1 1Ы, оче6ау СЬе геас6оп ппхсьгех чч(СЬ 1 с!гор (-50 )с!) оЕ 118Ьс пппега1 о(1.
А1сегпабче1у, р1асе а Ьеас! оГ рага16|п |чах |псо сЬе сьЬе |Г ьяпд а Ьос хсагс ргососо!. Р1асе сЬе сьЪех ог йе шкго6сег р!асе Ги сЬе йеппа! сус!ег. Агпр11Гу йе ппс1ек аснЬ ьхшд йе с1епасьгабоп, аппеа1(пд, ап|1 ро1успепка6оп сппеа ап|1 сешрегасьгех 1Гхсес) 1и сЬе саЪ)е. ТЬеае 6п|еа аге |шиаЫе Гог 100-И! геасьопа амеи|Ыед )и сЬш-|ча!1ед 0.5-и|1 шЬеа апд ГпсиЬасе6 |п йеппа1 сус1ега аисЬ аа сЬе РегЫп-Е!и|ег 9б00 ог 9700, Маяег Сус!ег (ЕррепьогР, ап6 РТС 100 (М) КеаеагсЬ).
Типеа апд сепг регашгеа шау пее6 со Ье адар!ад со |шь ойег суреа оГ ее)и)ргпепс ап|1 геасбоп чо!шпек. Ро!уикпкаьоп аЬои16 Ье саге)е6 ош Еог 1 пипи!с Еог ечегу 1000 Ьр оЕ !епдй оЕ йе сагдес )3ХА. Мокс йеггиа! сус1ел Ьаче ап еп|! гош|пе ш |чЬкЬ йе ап|р1|де|! аап|р!еа аге шсиьасе6 ас 4 С ип61 йеу аге гепюче6 !гоги йе и|асЫпе. 5а|пр! еа сап Ье 1е(с очегшдди ас сЬ|а сегпрегашге, Ьш аЬои16 Ье асоге6 сьегеа(сег ас -20'С. ЪЯГЬс)гаъч а хашр!е (5 — 10 )|1) Егогп сЬе сея геас6оп ппхсьге апс( йе Еопг сопсго! геасс(опа апс) апа1уке сЬеш Ьу е1ессгорЬогеяа (ЬгоьдЬ ап адагохе ог ро1уасгу1ашЫе де1. Ве хьге со !пс1цде РХА шаг)сека оГ ап арргорпасе яке.
5саш сЬе де! чч(сЬ ейЫшпс Ьгоп|Ые ог 5'с'ВК 0010 со ч(хьа11ке ГЬе РХА. А |шссеы(и) а|пр1|Всаьоп геасьоп аЬои!|! у!е16 а геап51у ляЫе Г7ХА Ггадшепс о( йе ехрессе6 яке. ТЬе Ыепсьу оЕ сЬе Ьапд сап Ье сопдпие6 Ьу РХА аег)иепсшд (р!еаае аее СЬарсег ! 2, Ргососо! 6), доийегп ЬуЬгЫ(касюп (р1еаае аее СЬарсег 6, Ргососо! 10), ап6)ог геаспссюп |парршд. !Г по ргодисс Ь ляЫе айег 30 сус1еа оЕ аи|р!|дсасюп, а|Ы ЕгеаЬ Тад ро!угпегаае апд сопьпие сЬе агпр!|дса6оп геассюп Еог а Ешйег 15 — 20 сус1еа.
Ртоеосо! 8: Атр!фсиг(оп оЕ сРИА Сепетпгег( Ьу Венето Тгапаст(рс(оп оЕ тйЬЕА 8.53 9. !Е пииега1 о]1 счаа паем со очег1ау с Ье геассюп (]и 5сер 6), гепюне (Ье о!! Егогп 1Ье аагпр1е ЪеЕоге с!оп]пц Ъу ехсгасс]оп сч]1Ь ! 50 р! оЕ сЫогоЕопп. ТЬе ациеоиа рйаае, юЬ]сй сопсагпа сЬе апср!]Егес1 ОМА, чАП Еопп а гпгсе)!е пеаг ЕЬе гпеп(асиа. ТЬе писейе сап сЬеи Ье сгапаЕеггегс со а Егеай сиЬе а 31Ь ап аисогпаис писгоргрессе. А 3)чСРОКТАМТ Оо по1 аиетрс сЫого(оггп ехсгасс]опа 'в писго01ег р]а1ек ТЬе р!аас(с иаег( (п 1Ьеае р]асеа ь по1 геа(асапс 1о огйап(с ао]чепЫ.
1О. С1опе (Ье агпр]]Есег] ргог]исса ]псо ап арргорпасе1у ргерагег] чессог Ьу апу оЕ 1Ье псесЬог]а г]еаспЬег] гп Рго1осо1 4, 5, ог 6. ВеЕоге с1ошпд, аерагасе ЕЬе апср]!Есег] О]х]А Егогп сЬе ген]г]- иа! сЬеппоасаЫе ОМА ро]угпегаае апс] г]]х]ТРь (р!еаае атее Ргососо! 3). ТЬе ОМА сап сЬеп Ъе 138асег] 1о а Ыип1-епг]ег1 чессог ог а Т чессог, ог ]1 сап г]]деасег] ъч!1Ь геасг]сс]ои епхугпеа аиг] 1]расее] со а чессог сч]1Ь сопсрас!Ые сепп]п!. Роог у)е]г]а о( ргогсис( ]и РхТ-РСК гпау Ье гсие Со ]пейксепс СОМА ауп(Ьеа(а ог, пюге Егег]иеп((у, Со (пе(- Еессве атрййсасюп о( СОМА. )пчеас(Пасе 1Ье ]аиег роаа(Ь]3(су Ьу ьеййпц ир а аег]еа оЕ геасйопа (п счЬ(сЬ чапаЫе агпоипса о( СОМА 1епср3асе аге ассгсесс со сЬе РСК 5иЬорс)гпа] асиоипса ос СОМА сепср]асе гпау цепегасе а пипсЬег о( сс(асгесе агпр](йсас]оп ргодисса, ъчЬ]сЬ гпау Ье ]агйег ог ьгпа]]ег 1Ьап 1Ье аи(Ьепйс сагйес ае9иепсе.
А гпоге согпгпоп ргоЫегп 'ь а попаресЫс агпеаг о( агар!]йесс репе]исса, аа ч)аиа]- аег! оп а а(а]пег] Ве]. ТЬЬ оиСсогпе 'ь саиаегс Ьу ариг)оиа рг)гп)пц, ччЬ]сЬ оссига счЬеп ехсеаа СОМА сепср]асе Ь ргеаепс )и (Ле РСК. Гог 1Ь(а геааоп, псапу ехрег]гпепсега иае < С ОА о( ЕЬе СОМА цепегасесс (п (Ье гечегае (гагат]рсаае геассюп аа 1егпрса1е (и (Ье еиЬаеесиеп1 РСК. ]п (ЬВ сазе, аг(сс]Попа] г]МТРа гпиа1 Ье агсг]егс Со СЬе РСК.
Опсе СЛе Ьеа( сопсеп1габоп о( 1егпр]а1е Ьаа Ьееп еа(аЬ()аЬегс, Сйе о(Ьег рагатие1ега о( РСК сап Ье орсапыеес ]и а ауасегпас]с ЕааЬ(оп Ьу часу)пй СЬе сопсепсгайоп оЕ (ч(йа~, айеппй аппеа](пд сопг(31(опа, апгс ао оп. Н ргоЫегпа ай(3 рета(ас; ° СЬес]с СЬе (псецп(у о( СЬе ЯМА ргерагайоп Ьу е]ес(горЬогеа(а 1ЛгоиВЬ ап ацагоае Пе] соп(а]п]пе (пипа(гсеЬуг]е. ° 5е1 ир сеас геас1(опа соп(а(п(п8 а сои(го] тПМА, ап о](ео(г]Т) ргапег, апгс а гагс)о]аЬе]есс 1гасег 1о гиеааиге Псе е(йс]епсу о( СОМА ауп(Ьеа(к ТЬе соса! агпоипЫ о( Есгас-асгапгс СОМА ауп(Ьеа]а сап Ье гпеааигегс Ьу гсесегтп(п)пе Псе ргорогйоп о( гагс]пасс(ч(су (псогрогасег] ]и геасйопа 1Ьас Ьаче Ьееп аирр]егпепсегс чпйс 10-20 )гС! оЕ !а~Р]г]СТР (ар.
асс. 3000 С()гптпо(е). ТЬе а(хе о( Псе Естес-асгапг( СОМА гпо]еси]еа сап Ье еас]гпасег] Ьу е]ес(горЬогеа(а СЬгоиВЬ айса]тпе аеагоае Ве]а (аее СЬарсег 5, Ргососо( 3). ° Таас Еог (Ье ргеаепсе оЕ ]пЬ(Ь)соса )и СЬе ргерагайоп о( КМА Ьу пйх)п8 часу(пц агпоип(а ос сЬе ргерагайоп чн]ПЬ а сопСго] апг] согпрапп8 СЬе у(е]сса о( СОМА. ° Риг](у Сйе СОМА аа гсеаспЬесс (и Псе Еоо1по1е Со 5(ер 3 Ье(оге ргосеегс]пй 1о РСК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
