Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 20
Текст из файла (страница 20)
КЪ(А зшсаЫе Еог ые аз а сегпр!асс гп КТ-РСК шау Ье ргерагей Егопг япа!1 пшпЬеш оЕ си1сигей се11з ассоггппд со сЬе спгессюпз сп Ргососо! д. 5рес!а1 Ецц1рупеп1 Вате« дрз Еог аисотадс гтс(егор(ресгез М!его/иде сиЬез ВЬ5 т/, ГЬ!и-зча//ед Еог атрИ/садоп) ог М(с«ос((ег р/асез Роз(сгче-д!зр/асетепс р1реое ТЬегта/ сус/ег рго8«агптед сЫ(Ь дегйгес/ атрИ!садоп ргососо/ 1Е сЬе йеппа! сус1ег а пос ег(шррей чг(сЬ а Ьеасей 1Ы, ые егйег пипега! ог! ог рага(6п агах со ргечепс ечарогасюп оЕ!(г(иЫ Ггогп йе геассюп пихсше йиппд РОК. Урасег Ьа«Ьз ргезег Со 75 С А(1ййопа! КеаеепЬ 5(ер 6 о/(Ь/з рго(осо/ гес/и!«ез (Ье геацеп(з!«з(ед т СЬарсег 5, Ргососо/ 2, СЬар(ег 72, Рго«осо/ 6, ог СЬар(ег 6, Рго(осо! 70.
5(ер 8 о/ 7/дз ргососо/ гес/иггез (Ье геаделп бзсед !л Ргососо/з 3 апд 4, 5, ог 6 о/ днз сЬарсег. МЕТНОхх йечег8е Тгап8сг!рЕ!оп ТЬе аиссеаа ог ЕаПиге оЕ 3'-КАСЕ ь Песегт)пег! Ьеге, аг йе Ьек)пп(пц оЕ йе ехрепгпеп!. 1Е (Ье гечегае сгапаспргюп хгер ччог)сч еЕЕ)с(епг1у, йе сЬапсе оЕ !80!а!(пк с1опеа ЕЬас сопгаш !Ье 3'-гегпи'- па1 аес)иепсеа оЕ !Ье гагцеГ гпКХА ь Ь(ПЬ. Оп йе ойег Ьапд, по атоип( оЕ гчог)с оп йе 1а(ег Пера оЕ йе ргогосо! сап сотрепааге Еог )пе(Тес!)че гечегае ггапасг)ргюп.
1! 18 йегеуоге ччог(ЬъчЬПе го !а1се йе гппе Го орг)пже ЕЬе гечегае ггапхсПр(аае геас6оп Ьу 6е(егт)п)пц йе оргипшп гагю оЕ ргипег со гетр1аге Еог еасЬ ргерагагюп оЕ КХА ап6 Ьу чагу)п8 йе сопсепгга6оп оЕ М82+ гп йе геасгюп. 1. Тгапауег ! р8 го 100 пц оЕро1у(А)' гпКХА ог 10 р8 го 1)!8 оугога1 КХА го а ЕгеаЬ т)сгоуиае ГОЪе. А6)иа! ГЬе чо1шпе го 10)г! ич(Ь Н О.
13епа(иге йе КХА Ъу Ьеаг(пк а( 75 С Еог 5 пипигеа, ЕоПои ей Ьу гарЫ сЬППпд оп ке. 2. То йе Йепагигеб КХА асЫ: 5х гечегге ггапхсг!Ргахе Ъи((ег 20 гпм го!игюп о(гоиг ОЫТРх )О рм (дТ),„-адаргог-рг!тег (80 рто!ех) -20 ип!ь!(г! Р!асепга1 КЫаье !пЫЬ!гог )00 — 200 ип!Еа/р! гечегхе ггапаспргаяе НО !О р) !.5 )г! ВЗ р) ! Р1 )р! го 50 р! 1псиЪаге ЕЬе геасгюп Еог 60 т)пигеа аг 37'С. 5е! ир йгее пера!(че сопгго1 геасгюпа.
1п опе геаспоп, шс1ис)е аП оЕ ЕЬе согпропепп оЕ (Ье Пга(-8(гапд геасгюп, ехсер( йе КХА Гегпр1а(е. 1п апогЬег геас!юп, шс1ибе аП оЕ йе сотропепрп ехсерг гЬе гечегае ггапасйргаае. Опи! ргипег Егоип йе й|п1 геасгюп. Саггу ЕЬе сои!го!8 (ЬгоиЕЬ аП аиЬаесрлеп! ягера оЕ йе ргогосо1. ТЬеае сои!го!8 ргочЫе геаааигапсе йаг (Ье с())х(А ргобисг ауп(Ье!Пхеб ш йе та1п геасгюп 18 по! 6ие го сопсапипа6оп хч((Ь цепот(с 1)ХА, оПкопис1еог!Пе ЕгаЕгпепга, ог ае!Е- рппипц Ъу Сетр1аге то1еси1еа.
Тога! сРЫА гупйеях сап Ье еыппагед Егот ЕЬе ргорогбоп оЕ ТСА-ргес!РааЫе га6!оасг!ч!гу !псогрогагес1 !и гечеье ггапхсг!Ргаае геасг!опя аирр1егпепге6 ю!ЕЬ )Π— 20 РС! оЕ [пр)с!СТР (хр. асг. 3000 Счпнпо!е; р!еахе атее Аррепйх 8). Ве хиге го хег ир а сопгго! геасбоп ЕЬаг сопга!пх по (ЙТ), абаргог апг!хегье рпп1ег. Каг!юас6ч(гу гасогрогасе6 ш йе аЬхепсе оЕ рптег геш1ь Егоп1 хе!Е-рппип8 оЕ КНА то!еси)еа ТЬе 1еп8й оЕ ЕЬе рори1а6оп оЕ Огхг-хггапд сРХА то!еси!еа сап Ье еяг!тасей Ьу е1есггорЬогеях оЕ ЕЬе гайо!аЬе!е6 ргобисгх ЕЬгои8Ь ап а!Ка!!пе а8агохе 8е! (СЬаргег 5, Ргососо! 8), Ео!!оъчес1 Ьу аигогайо8гарЬу.
3. ЕИиге йе гечегае ггапаспргаае геасгюп (с(3ХА) го а Йпа1 чо)ите оЕ 1 гп1 ъч)(Ь ТЕ (рН 7.6). !г тау Ье песеьагу со геточе ехсея о118опис1еогйе апд гапдот Ьехап1ег рптегх Егоп1 ЕЬе сРХА ргерага6оп ап6 ЕЬеп го орг!т!ге ЕЬе сопсепггаг!опх оЕ Йе аепхе ап6 апг!хапае рпгпеь !и ЕЬе ап1Р1!Ксагюп геасгюп (р!еахе аее 5гер 3 оЕ Ргогосо! 9). АепрИкабоп ччеП оЕ а агеп1е писгогпег р1асе, 8.64 СЬаргег 8: Еп Ъ!гго Атр1фса6оп оу Е7ИА Ьу РСК 4. 1п а агеп1е 0.5-т! т!его!оке гиЬе, агпрППсагюп гиЪе, ог ЕЬе ае! ир а аепеа оЕ РСК8 сопгашшк йе ЕОПочч)п8: 6!!иге6 сРЫА !Ох атр110са6оп ЬиЕЕег 20 п1м го1и6оп оЕ !оиг ЙЫТРх !О Еим (ЙТ),„-айаргог-рг!тег (!6 рто!еа) )О )гм адаргог-рг!тег (32 рто!ех) )О )гм Кепс-хрес!Е1с, кепхе о118опис!ео6де ргппег (32 рто!ех) ! — 2 ип!Еь ЕЬегтоггаЫе РХА ро!утегахе НО 0 — 20 р) 5 )г! 5 р! !.б р! 3.2 р! 3.2 р! ! )г! го 50 р! Ргогосо1 10г йир(гГ Атр1фсаг(оп оу 3 ' соХА Епг(л 8.65 1с Ь еяеи6а! со аес ир а аепеа оГ ашр!сЕса6ои геас6оиь со Гсий сЬе апюиис о( сРХА сЬас Ееиег- асеа сЬе 1аг8еас 9иаис!су оГ агпр1лйес1 5' сепшш.
ТЬе сои!го! соисашш8 по сРХА сеплр!асс аегчеа аа а сои!го! Еог сопсапипа6оп. 5. 1Г йе йеппа1 сус1ег (х пос Вием сч(сЬ а Ьеасес1 !Ы, очейау йе геас6оп ш(хсигеа сч(сЬ 1 с(гор (-50 Сс!) оГ 1$Ьс пипега! ос1. А1сегпа6че!у, р1асе а Ъеас1 оГ рагаГГ(п счах (псо йе шЬе (Г ияп8 а Ьос асагс ргососо1. Р1асе йе шЬеа ог сЬе писго6сег р1асе (п сЬе йеппа! сус!ег. Атпр)(уу сЬе пис1ек асиЬ ияп8 йе с1епасигасюп, аппеа!!08, апс1 ро1упсепха6оп с!тех апс1 сетпрегасигех 1Ысес1 (п йе саЫе. Сус1 Хшп Аппеа1(п8 Ро!утиепхабоп Репасигасюп Рстх 5 ппп ас 94'С 40 аес ас 94 С 5пппас50-58 С 40 пипа!72 С 1 ппп ас 50-58'С 3 пип ас 72'С ЕиЬа сус1е Еаас 1 ппп аС 50 — 58'С 15 ппп ат 72'С 40 аес ас 94'С ТЬеае с!шел аге ашсаЫе Гог 50-01 геассюиа аяепсЫе6 ш сЫи-лча1!ед 0.5-ги! сиЬеа апд (псиЪасед )и сЬепиа! сус1ега аисЬ аа сЬе РегЫп-Е1сиег 9600 ог 9700, Малсег Сус!ег (Ерреидогс), аи6 РТС 100 (М1 ВеаеагсЫ. Таиса аис1 сеилрегашгеа шау пее6 со Ье абарсед со ашс осЬег суреа оЕ ечшрсиеис аид геас6ои чо!шиея ТЬе ро! угиепхасюп геаспои !и сЬе Егас сус1е ь сагг!е6 ош Еог ап ехсеибе6 рег(о6 о(липе (40 пии- исеа) со еишге сЬе ауисЬеяа оЕ 1ои8 5чехсеибед сРХАа Ьу сЬе йепиоасаЫе РХА ро!уплегаае.
6. 'слг(сЬдгачч а аатпр1е (5-10 )с1) !тоги йе сеас геассюп ппхсиге апд йе Гош сопсго! геасс(опа апс( апа1ухе сЬетп Ьу е1ессгорЬогеяа ГЬгоицЬ ап а8агоае ог ро1уасгу1атпЫе Ве1. Ве тюте со (пс!ис)е РХА тпаг1сегх оГ ап арргорпате яхе. Ега!п йе Ве! мчСЬ ейссВшп Ъгоппс1е от 5'сВК бо!г( со чгаиа1ые сЬе РХА. А шссем(и1 ашр116сас)ои геасбоп аЬои16 у)е16 а геас81у ч(яЫе РХА Гга8икис оГ сЬе ехрессе6 яхе. ТЬе Ыеи6су оГ сЬе Ьаиб сап Ъе соийпие6 Ьу РХА аесрлеис1и8 (р!еаае аее СЬарсег 12, Ргососо! С)), 5оисЬеги ЬуЬпгВха6ои (р!еаае аее СЬарсег Гл, Ргососо! 10), ап6)ог геяпссюп шарр)и8.
1Г ио рго6исс Ь чляЫе а(сег 50 сус1еа оЕ ашр!18сабои, а66 ЕгеаЬ Та9 ро!угиегаае ап6 соис1пие сЬе ашрЬЕса6ои геасиои Гог а СшсЬег 15 — 20 сус1еа. 11 агир1лЕсасюп оЕ йе сас!ед сРХА ргерагасюи геш)ь ш а япеаг оГ РХА а(сег 8е1 е1ессгорЬогеа(а, йе 1ои8ея ргос1ись оЕ сЬе ашр118сасюп геассюи ьЬои16 Ье гесочеге6 Егоил а ргерагасгче а8агоае Ее!. Аи а1к!иос оЕ сЫа пласепа! саи йеп Ье геапср118егс Еог а 1иииег( ишпЬег (15 — 20) оГ адйссопа! сус1еа оГ РСВ.
7. 1Г пппега1 о(1 шах паем со очег1ау сЬе аагпр1е, гепюче йе оВ Ггосп йе хатор!е Ъеуоге с!оп!08 Ьу ехсгассюп ссчсЬ 150 )с1 оГ сЫогоуогтп. ТЬе а9иеоы рЬаае, лчЬлсЬ соиса(иа сЬе аилрЬВед РХА, ьчП Еопп а писе1!е иеаг сЬе гиешаспя ТЬе иске!1е саи Ъе сгаиауеггесс со а ЕгеаЬ илЬе лч)сЬ аи аисоисабс иисгорсрепе. А !МРОВТАХТ Ро иог аггегирг сЫого(оггп ехггасгюиа !и иисгойег р!агеа. ТЬе р!аа6с иае6 !и йеае р1а(еа )а иоС геяатапт Со огВап!и ао!чеигя 8. Еерагасе СЬе агпр1сВес1 ЛХА !тоти йе геяс1иа! СЬегтпохгаЫе РХА ро1утпегахе апс1 с1ХТРа (р1еахе аее ртососо1 3). ТЬе РХА сап иоле Ье 118асе6 со а Ыиис-епбе6 чессог ог а Т чесюг, ог !с саи г88еасе6 чбй геасгк6ои епаугиеа аис$118асес1 со а чессог лч!ЕЬ соплрас!Ые сепишс (р!еаае аее Ргососо!а 4, 5, аи6 Ел).
1( ргоЫепи апас, р!еаае аее сЬе геше6)еа ап6 чапа6оиа 6еасг)Ьед Еог сЬе 5'-ВАСЕ геассюи (Ргососо! 9) ъчЫсЬ арр!у а1ю со йе 5чВАСЕ ргосессиге. Рго1осо~ 11 Михей О!~цопис~ео6де-рптед АтрИ~са6оп о1 с0МА т нввв !тлчв, тнв вввт ччлч то сюмв л свнв ччнвн омх а Гга8шепгагу ьег)иепсе оГ йе ргоге)п 1а )споччп )а со цае апцпо асЫ аециепсеа со деа18п о118опцс1еогЫеа йаг сап Ье иаед е!йег аа ргоЪеь го асгееп 11Ъгапез ог го ашрИу йе гаг8ег аег)цепсе Ъу РСК. Ап оЪч)оца ргоыеш ъчгЬ ЬоГЬ шеГЬодь 1а ГЬе де8епегасу оГ йе Вепедс соде. ТЬеге аге 64 роьяЫе содопь апд оп!у 20 апипо асЫя пюаг апипо аснЬ аге гергеаепгед Ъу гпоге йап опе содоп. Весацае йеге аге по ги1еа гЬаг Виагапгее ье!есдоп оГ гЬе соггесг содоп, а сеггаш ае9иепсе оГ апппо асЫа сап Ье епсодед Ъу а !аг8е пшпЪег оГ ййегепг о1!Вопис!еоддея с)п1еаа йе дея8пег 1а 1псгед)Ыу 1цс!су апд сЬооьеа йе соггесг содоп !и ечегу яп81е роа)гюп, йе о118опис!еогЫе ичко! пог Гогш а регГесс ЬуЬгЫ чдй гЬе гаг8ег Вепе ог сРХА.
0118опис1еогЫе ргоЬеа цаед го асгееп Вепогпк апд сРЬ)А 11Ъгапеь Ьу ЬуЬгЫгаадоп иьиа11у соггеьропд го апипо асЫ аес)иепсеь гЬаг аге 5 — 25 агпшо асЫь ш !еп8гЬ. Весацае оГ йе де8епегасу оГ гЬе Вепегк соде, йеге оЬчюца1у аге шапу гЬоиьапдь оГ пис1еогЫе аеоиепсеа йаг сои1д соде Гог аисЬ а аег)иепсе оГ агшпо ас)дЫЗпг11 йе адчепг оГ РСРс-Ьаьед гпегЬода ацсЬ аа пцхед о118опис1еоГЫе-рг)мопед агпр1г6садоп оГ сГ)Ь)А !МОРАС), )пчеа68агога яшр1у гпаде шге1118епг Виеааез аЬоиг гЬе шоя 11)се!у содоп цаед аг еасЬ роягюп апд йеп ьупгЬеяхед ап о118опис1еоГЫе ргоЪе — а "Виеаяпег" — йаГ шсогрогагес1 а11 оГ ГЬеье ЬипсЬеа (1.аГЬе 1985).
ТЬе ацп вам го Вепегаге а ргоЬе оГ ацГГгс)епг 1еп8гЬ ао гЬаг гЬе деггипепга1 ейесь оГ гЬе шеч)гаЫе пдяпагсЬеа ъчеге оиггче18Ьед Ьу йе атаЬ1!Ьу оГ ехсепа1че !гас!а оГ регГесс1у шагсЬес1 Ьааея биеаагпега геасЬед гЬе)г Ье18Ьг оГ рори1апгу 1п йе шЫ 1980а ччЬеп Вед81ш8 гесошЪ1- папг РХА согпрап)еь гчеге деьрегаге1у ггу)п8 го с1опе Вепеь оГ сопипегс!а1 ча1ие. Рог гЬегп, ьегепд)р)гу гчаа ойеп Ьапдаоше1у геччагдед япсе йе стт!ч)А апд Вепош1с РЬ)А с1опеа оГ гпапу цаеГц! апд 1исгадче Вепеа гчеге оЬсашед дипп8 гЬ)а репос1.
1п гесепг уеагя Ьо~чечег, Виеаашегь Ьаче Ьееп ес1)раед Ьу РСВА ргнпед Ьу де8епегаге роо!а оГ о!18опис!еогЫея ТЬеае роо1а аге пог гапс1ош аашр!еа оГ а11 роьяЫе аег)иепсеь йаг сап епсоде а раггки1аг рергЫе. КагЬег, гЬеу аге з)сетчед рори1адопа оГ о!18опис1еогЫеа йаг, оп ага!)агка1 Вгоипдя аге шоя 11)се!у го соггезропд го гЬе сод)п8 ае9иепсе оГ йе ацйепдс 8епе. 1п РСКа сопга)ып8 Вепош)с ог стт1)А гешр1асея йеге )а а 8оод сЬапсе йаг йе де8епегаге роо1в оГ о118опис1еогЫеа чч61 дпче агпр1г6сагюп оГ рагг оГ йе Вепе оГ шгегеаг гч)гЬ ЬгВЬ аресубс)гу. ТЬе геьи16п8 1)1)А ргодцсг )а Ыепдса! )п аег)цепсе со а зе8шепг оГ йе гаг8ег Вепе апд сап Ье цаед ипдег сопс66опь оГ Ь18Ь япп8епсу го ргоЬе сутул апд Вепоппс 11Ьгапеа апд го дегесг 8.бб Ргогосо! !1: МЬсед О!!цопос!еобде-ргстед Атр!фсаг!оп оу" сРИА 8.67 Ьото1оцоцх ьессиепсеа си цоисЬегп апд погйегп Ыося Ехрепепсе шд!сасеа йас сЬе МОРАС ргоседиге ыпоге ге!саЫе апд тоге аепяссче йап йгесс асгеешпц оЕ 1!Ъгапеа ъчссЬ ццеаяиегя ТЬса адчапсаце 1х сЬ)ебу Ъесаиье РСК-Ъааед псесЬой ацсЬ аа МОРАС геъ!и!ге Еаг аЬогсег сгасса оЕ аиипо асЫ аес!иепсе апд Ъесаиае РСК тесЬода аге пюге со!егапс оЕ гедипдапсу.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
