Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Сеп1г!Еред апе! Вологд РгерагаСгче сеп(г(Гиде Сепспсоп-100 аепсев |я|11 6с |п апу Ехед-апд1е госог |ч)сЬ ааарсогв сараЫе о! яиррогбпд 17 х 150-иип сиЬев. ТЬе сепспб|де гпыс Ъе сараЫе оЕ депегасшд а ясеаг)у Еогсе оЕ 10008. 5ол аП 55-34 го(ог прес!а! Ее!о!ргпеп1 Вагг|ег Оря Еог аисота0с ткгор|ре77ея Сопсел(гасогя (СелГпсоп-100, Ат|соп) МЕсгоуиее ГиЬея Г0.5 гп3, ГЬ)л-и а)!ед Гог атр)И)са()оп) ог МЫгои(ег р)аЕея Роя37|че-с33яр3асетеп7 р|репе ТЬегта! сус)ег ргодгаттес3 и |Я Ие|бгед атр)ГЕ(са13оп ргогосо! 1Е йе йеппа) сус!ег Ь пос ег)шррес) |чпЬ а Ьеасег) 1Ы, ме е|сЬег иипега1 о!1 ог рагагбп |чах со ргечепс ечарогабоп оЕ 11|)шд Егогп сЬе геассюп пихсиге |Ьсппд РСВ.
Ко(агу часиит ечарогаСог (ОрОола3) Рог ехагпр1е, |Ье дреейчас Егоп| дачапс 1пс. (Нк1|яЫ11е, Хенч Уог)с), Р1еаяе яее дсер 3. Магог ЬаГЬя ргечег го 75оС алс3 60 С Ае!е!!бопа! КеарепЬ 57ер 9 оЕ Я18 ргососо! гес3иггея Яе геаееп73 3(я(ес3 и| СЬарсег 5, Ргогосо! 2, СЬар!ег 72, Рго1осо! б, ог СЬарсег б, Ргогосоl 70. 51ер 11 оЕ ЕЬЕя ргососо! гес3и(гея Яе геадепЕя 3(я(ес3 гп РгоЕосо)я 3 апИ 4, 5, ог б оЕ ГЬ(я сЬарсег. МЕТНО0 Кеягегде Тгапдсг!р1!оп ТЬе яиссеяя ог Еа|!иге оЕ 5'-ВАСЕ 1я г)есегт)пед Ьеге, ас йе Ьед)пп)пд о( йе ехрепгпепс.
1Е сЬе гечегяе сгапяспрбоп ясер ччогЬя е(6с)епс1у, йе сЬапсе оЕ 1801ас)пд с1опея йас солса)п йе 5'-сегпп- 8.58 СЬаргег 8|!и Ъ'Есго Атр!г)|пас(оп оу'РИА Ьу РСК па! зес[иепсез оЕ сЬе сагдес гпКМА ь Ь!иЬ. Оп йе ойег Ьапй по апюипс оусчог[с оп сЬе !асег зсерз оЕ сЬе ргососо! сап сошрепзасе Еог !пейесс[че гечегзе сгапзспр6оп. 1с !з йегеуоге счогсЬ|чЬ|1е со са1|е йе спие со ор6пихе йе гечегзе сгапзспрсазе геассюп Ьу бесегпипсщ йе орйиши га6о оЕ рпгпег со сешр1асе Еог еасЬ ргерагабоп оЕ КМА ап|1 Ъу чагусщ йе сои сепсгайоп оЕ МИ|+ !и сЬе геасс!оп. 1. Тгапзуег 1 РИ со 100 пе оЕ ро1у(А)+ шКМА ог 10 ре со 1 )сц оЕ соса1 КМА со а Егей ш!сгоуще сиЬе. Ас[)изс сЬе чо1пше со 9 р! сч!сЬ Н О. Пепасиге йе КМА Ьу Ьеас[пх Еог 5 пипшез ас 75"С, Ео11о|че|1 Ьу гарЫ сЫ11|щ оп ке. 2.
То йе 6епасигес[ КХА а|Ы: 5х гечегзе сгаизсг[рсазе Ьиу(ег 20 шм зо!ииоп оЕ Еоиг с)МТРз (РН 8.0) )0 РМ Вепе-зрес(ЕЫ апСьеизе рпгиег С -20 ип(гз/Сс! р!асепга! КМазе шуИЪ|Сог (00-200 ип(сз)и! гечегзе Сгапзсг(ргазе Н,О 4 и! )Ф 4Ы ! р! си! Сигор! !псиЬаге йе геасг!оп Еог 60 пипигез аС 37'С. 5еС ир СЬгее пеИагсче сопСго! геасСюпз. 1и опе геас6оп, !ис!ис[е а11 оЕ сЬе сошропепь оЕ сЬе Игзс-зсгап6 геас6оп, ехсерс йе КХА сепср1асе, 1п апойег геасс!оп, !пс!ибе а11 оЕ йе согиропепь, ехсерс йе гечегзе сгапзспрсазе.
Оппс ргипег Егош йе 6иг|1 геасс!оп. Саггу сЬе сои!го!з сЬгопцЬ а11 зпЬзе|рлепс зсерз оЕ йе ргососо1. ТЬезе сопсго1з ргочЫе геаззигапсе сЬас йе с[ЗлА ргос[исс зупсЬеяхе|1 !и сЬе шаш геассюп [з пос 6ие со сопсапипа6оп |чКЬ Иепош!с [3МА ог о[!цопис[еос!6е Егахшепсз, ог зе1Е- рспп!08 Ъу сешр1асе гпо[еси1ез. Тога! с(!МА зуисЬеяз сап Ье езишасес( Егоги сЬе ргорогпоп оЕ сгкЫогоасеис асЫ (ТСА)-ргес)р|саЫе гайоасс!ч(су (псогрогасес) ш гечегзе сгаизсг!Рс[оп геаес(опз зирр!ешепсес( сч(сЬ (0-20 иС| оЕ [ "Р)г)СТР (зр. асс. 5000 Сйпшо!е; р!еазе зее Аррепйх 8). Ве |иге со зес ир а сои!го! геас6оп сЬас сои!а[из по о08оиис!еосЫе ргииег.
Кайоас6чау (псогрогасед |и йе аЬзепсе оЕ ргипег ге|и!ь Егои| зе!Е-рппии8 оЕ КМА шо!еси!ез. ТЬе !еихсЬ оЕ |Ье роро!асюп оЕ Впьзсгаий сс)МА пю!еси!ез сап Ье езс(шасес) Ьу е!ессгорЬогез(з оЕ сЬе гайо!аЬе!е|С ргос(иссз сЬгоиВЬ ап аИ|аИпе а8агозе Ве! (СЬарсег 5, Ргососо! 8), ЕоИосчег) Ъу аисогайо8гарЬу. То |иоиаог сЬе еИ)с(епсу оЕ чзие-зрзгфг!>МА зуи|Ьеяз, зес ир а ргииег-ехсепяоп геассюп сопса(иш8 йе Вепе-зрес(Ею апизепзе оИВоиис)еосЫе гас)ю!аЪе!есс ас |ь 5' епсс Ьу ЬассепорЬа8е Т4 ро!упис!еосЫе Ыпазе ап|! [у-||Р!АТР (р!еазе зее СЬарсег 7, Ргососо! 12).
ТЬе ргос)иссз оЕ йе гечегзе сгаизсг(рсазе геасиоп, счЬ(сЬ зп Вепега! |чИ! Ье Ьесего8еиеось ш !еп8сЬ, зЬои!И Ье апа!ухе|) Ьу е!ессгорЬогез[з сЬгоиВЬ аи аИ|а!ше а8агозе Ве! (СЬарсег 5, Ргососо! 8), ЕоИоъчес) Ьу ашогайо8гарЬу. Рхсепс)е|С ехрозиге Ип|ез (>24 Ьоыз) иоИ гиозс И)ге!у Ье ге9и(гес( со с)есесс сЬе рпп|егехсеияои ргосеисс(з) сошр!ешепсагу со !осч-аъии|еапсе шк)4Аз. 3. Кепюче ехсезз о!сдопис!еос!6е ог гапбогп Ьехапис!еос[6е ргииег Ьу 6[[ос!08 йе гечегзе сгапзспрсазе геассюп со а Кпа1 чо1шпе оЕ 2 гп! чч!сЬ Н О ап|! сЬеп арр1у!щ йе 801шюп со а Сепспсоп-!00 гикгосопсепсгасог (РгоЬпсап 1993; Еог а |1езсприоп оЕ сЬ!з ргосес[иге, р1еазе зее Ргососо[ 3). Сепсг!Еице йе 80106оп ас 500-! 1008 (2000-3000 грги !и а $огча11 55- 34 гогог) Еог 20 пипиСез аС а СешрегаСиге Ъе(чгееп 4'С ап6 25"С.
Кереаг СЬе й!игюп зСер апс! сеисг!Еще адаш. Тгапзуег йе гесешасе со а ЕгезЬ 0.5-ш1 писгосще сиЬе апд гелосе йе чо1- шпе со -10 )с[ ш а го!агу часишп ечарогасог. Рссгйса6оп о1 с[се Речег5е Тгап8сг!р1а5е Ргос!сссЬ (Упизес[ с1МТРз аист ргипегз пшзс Ье гешоче6 ас сЬе сошр1есюп оЕ сЬе гечегзе сгапзспрсазе геас6оп. О(Ьегсч!зе, йеге !з а сЬапсе сЬас с[МТРз чч!1! Ъе шсогрогасе6 |псо йе са|1 а|Ые6 со йе 3' еп|1 оЕ йе сТ)МА Ьу сегпипа1 сгапзуегазе.
ТЬ|з ъчои16 Ъе а соса[ йзазсег аз йе ргезепсе оЕ ипсчапсе6 Ьазез зчои!6 сошргогп[зе сЬе аЪ|!иу оЕ сЬе са!1 со зегче аз а ргсшег-Ь!п6!пц ясе. ТЬе ргезепсе оЕ иппзед ргпиегз счои!6 а180 Ъе а ргоЫеш Ьесаизе йе|г 3' сеппш| счои!д сошресе чч[сЬ сТ)МА |и сЬе са!1!щ геас6оп.
Ргососо! рс КарЫ Атр11)лса слои ау 5'сР)я!А Епг)я 8.59 А1сегпас!че!у, гепюче сЬе д)я)ТРя апд цпцяед рпплегя Ъу ргеслр)саип0 йе сслС4А счгке )п 2.5 м ашпюплшп асесасе апд 3 чо!шпее оЕ есЬапо1. Тшо яессцепдас ргеслрлсасюпя оЕ Ел)я)А )п сЬе ргея- епсе оЕ 2.5 м апипошшп асесасе геыл1с ш сЬе гелпоча! оЕ >99% оЕ ЙЫТРя апд о!!анонс!еосЫея Егогп ргерагайопя оЕ ЕлЬСА ЕО)сауагпа апд Вег0 1903).
4. То йе с!3!я)А 1п а чо1шпе оЕ10 Н1 айд: 5х сегпипа! сгапяЕегаяе ЬнЕЕег 1 шм ЙАТР сегпипа! сгапяЕегаяе 4 н) 4 н1 10-25 ип!ся !псиЬасе йе геасйоп Еог 15 пиписея ас 37'С. ТЬе са11)па геасиоп сап Ье орсипиед Ьу яеШпд цр пюс1с геассюпя спаса!п!па -50 па оЕ а сопсго1 ЕлЫА ЕгаВшепс, 100-200 пцс!еосЫея лп 1епасЬ. АЕсег са)1!па, сЬе яие оЕ сЬе Егаашепс яЬонЫ шсгеаяе Ьу 20 — 100 пцс1еосЫея ая шеашгей Ъу е!ессгорЬогеыя сЬгоцВЬ а саля пешга! ааагояе Ве!. Моге ассцгасе ел!!шалея оЕ сЬе ачегаае пшпЬег оЕЬаяея аййей со 3' сегпиш сап Ье оЬсаспей Ьу яесс)па цр а сои!го! геасиоп сноса)шпа -10 пВ оЕ а яупсЬессс о110опцс1еоссде -30 Ьаяея лп 1епВсЬ апд 1аЬе1есс ас ия 5' сегпипш чйсЬ ллр 1Р1еаяе яее СЬарсег 10, Ргососос 2).
ТЬе ргос1нсся оЕ сЬе са)!!па геассюп аге яерагасей Ьу е1ессгорЬогеяся сЬгоиаЬ а 10% ро!уасгу!агпЫе яел)цепс!па ае! апй апа!угей Ьу ацсогайсоВгарЬу. ТЬе са11ей ргойнсся Еопп а 1адйег оЕ Ъапйя й)йегспВ лп 1епВй Ьу а ыпа1е пцс!еосЫе. 1деа11у, сЬе Ьопюро!угпепс сал1я яЬолл!д, оп ачегаВе, Ье -20 пнс!еосЫея Ы 1епдй апй яЬон!й Ье аиасЬей со йе чаы пла)опсу оЕ сЬе с$3ЬСА яцЪясгасея. 5. !пасс)часе йе сегпипа1 сгапяуегаяе Ъу Ьеас)п8 сЬе геассюп Еог 3 пипсиея ас 80'С. $31!исе сЬе ЙА-сал1ей с$3)я)А со а Кпа1 чо1игпе оЕ ! гп1 лч11Ь ТЕ $РН 7.6). Апср!йсае!оп Ел.
1п а ясеп!е 0.5-гп1 пс)сгоуиие сиЪе, агпрИ)сас)оп снЬе, ог сЬе сче11 оЕ а яеп1е писгосЬег р1асе, яес ир а яепея оЕ РСКя сопсасйп8 сЬе Е011ояч)п8л й)1нгей сЕЛЬСА 0 — 20 н! 10х агпр!лВсайоп ЬцЕЕег 5 нс 20 гпм яо1цсюп оЕ Еоцг ЙЬСТРя 5 н! 10 Нм 1ЙТ), -айарсог-рпгпег 116 рпю1ея) 1.6 н) 10 Нм айарсог-рпплег 132 рпло1ея) 3.2 н1 10 НМ Вене-ярес)Еле ргипег 2 132 ргпо!ея) 3.2 нс 1-2 нас!я ое сЬеппоыаые елс4А ро1угпегаяе 1 н! Н,О Со 50 Н! !с Ь емепйа) со яес цр а яепея оЕ агпр1!Всасюп геасйопя со Впд сЬе ашоцпс оЕ сал!ей ссл$4А сЬас аепегасея сЬе 1агаеяс лрлапису оЕ агпр!!Елей 5' сеппшс.
ТЬе сопсго1 геасбоп сопсасшпа по сЕ314А сегпр1асе яегчея ая а сои!го! Еог сопсапипасюп. 7. 1Ейе сЬеппа1 сус1ег Ы пос Япе<$ сч)сЬ а Ьеасед 1Ы, очег1ау сЬе геассюп пихсигея сч)сЬ 1 с$гор (-50 Н1) оЕ 11иЬс пипега! о!1. А)сегпас)че1у, р!асе а Ьеас1 оЕ рагаЕЕп очах 1псо йе сиЬе 1Е ия)па а Ьос ясагс ргососо1. Р1асе сЬе сцЪея ог сЬе пассос)сег р1асе лп сЬе сЬепиа! сус1ег. 8. АсирИу йе пис1есс ас)йя ия)па йе йепасигасюп, аппеа11пи, апс$ ро!упсепхас)оп Нгпея апс1 сеспрегаилгея 1!асей сп сЬе саЫе. ТЬеяе Йгпея аге шцаЫе Еог 50-Н1 геасдопя аяяегпЫей гп сЫп-лча1!ей 0.5-пл) шЬея апй лпсцЬасей лп сЬеппа1 сус1егя шсЬ ая сЬе Регсссп-Е! шег 9600 ог 9700, Маясег Сус1ег 1ЕррепйогЕ), апд РТС 100 1М) ВеяеагсЬ). Типея апсс сегпрегашгея гпау пеей со Ье адарсей со яшс осЬег сурея оЕ ессшршепс апд геасбоп чо!шпея.
8.60 СЬаргет 8ю Еп )тюссо Атр!фсасюоп оЕ 0)ъЕА Ьу РСК ТЬе ро!утепгачюп геасиоп ш Йе 6гя сус!е Ь сагпед оис Еог ап ехтепдед репод оЕ дтпе (40 пипитею) со епеше Йе юупЧЬеяю оЕ !оп8 сР)4Аю Ьу Йе ЙеппоюсаЫе РЬЧА ро1упюегаюе. ТЬе оршпшп сетпрегатиге Еог аппеа!ЫВ оЕ йе о!ю8опис1еосЫе рппюегю Йои!д Ье десегпппед етпртпсаПу. 5тагс ас 50'С апд Вгадиа!!у ъчог1с ир Чо сЬе ЫВЬеют тепюрегасиге йас Вепегасес Йе тпахипшп у|е!д оЕ юрес|6с ргодисс. 9. ЪИЧЬс1гаъч а сагир!е (5 — 10 р!) Чгот ЧЬе Чесс геассюп пихсиге апд ЧЬе Еоиг сопсго! геассюпх апд апа!уге йет Ьу е!есчгорЬогеях ЧЬгоиВЬ ап аВагохе ог ро1уасгу!агпЫе це!. Ве сиге чо шс1иде Е))ъ)А гпаг1сел оЕ ап арргордасе яге. 5ча|п йе це! ън(чЬ ейЫшгп ЬгогпЫе ог 5 т'ВК Со!д Чо ч(еиа1(ге йе 0)ъ)А. А юиссем6ю! апюр66садоп геасч|оп юЬои!д у|е1д а геас6!у ч|яЫе РЬ)А Етацтепт оЕ чЬе ехрестед яге.
ТЬе Ыепдту оЕ ЧЬе Ъапд сап Ье соп6ппед Ьу РЬ)А юе9иепс|п8 (р1еаюе юее СЬарсег |2, Ргочосо! 6), 5оийегп ЬуЬпсбгадоп (р1еаюе юее СЬарчег 6, Ргочосо1 |0), апдюог геяпсдоп тпарР|п8. !Е по ргодист Ь ч|с|Ые айег 30 сус|ею оЕ атпр1ю6сасюп, адд ЕгеюЬ Таю( Ро|упюегаюе апд сопдпие йе аюпрЬВсадоп геасдоп Еог а Еогйег 15-20 сус!ею. !Е апюрИ|садоп оЕ чЬе са|1ед сРЬ)А ртерагадоп геги1ь ш а япеаг оЕ РЬЧА абег Ве! е1естгорЬотеяю, гесочег йе 1оп8еюч ргодись оЕ ЧЬе аюпр1!6сачюп геасчюп (тот а ргерагач|че аВагоюе Ве!.
Ап а!напою оЕ йы тпатепа! сап ЧЬеп Ье геаюпр!обед Еог а 1ипютед пшпЬег (! 5 — 20) оЕ аддиюпа! сус1ею оЕ РСК. 10. 1Е тшега! о(1 сна сьес1 Чо очедау чЬе геассюп (|п 5сер 7), геюпоче йе ою! Егот йе хагпр1е Ъе(оге с!оп|яд Ьу ехсгассюп ъч|ЧЬ 150 р1 оЕ сЫогоЕопп. ТЬе ас!иеоию РЬаюе, ънЬюсЬ сопчашю ЧЬе ашр!|Еюед РЬЧА, ад|1 Еопп а ппсе1!е пеаг йе гпепьсы. ТЬе писе1|е сап Ье Чгапюйгтес! со а ЕгесЬ шЪе ънЬЬ ап аисотпадс писгорюретсе. А !МРОКТАМТ Ро лос ассегпрс сЫого(опп ехсгасс|опс юп тпкгоийег р|асея ТЬе р|асдс сьес| юп ЧЬехе р)асею |с пос гех|ссапЧ Чо огцапк юю!непся 11.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
