Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Рго1осо! 9 КарМ Атрй~са6оп о1 5 с0МА ЕпсЬ отн|тчс |тт мостсст|Ак сютчт|чс ь моки ткт|5тклт|гтс |Ьап со ьо1ате а сРЪ)А с1опе йат 1ас)ь ает)иепсеа гергеаепта6че от йе 5' епт) от" тЬе соггеаропгбп8 шКЪ)А. Раг6а1 с1опеа от |Ьь суре, тч)6сЬ оссиг сопипоп1у ш сРЪ)А ЕЪгаг!е~, агье тчЬеп гечегте тгапаспртате та!1т то ехтепс)6гяатгапт$ сР)ч)А а!оп8 йе !611 1еп8|Ь от" йе гпКЪ)А сешр1ате. ТЬе 1оп8ег йе атаг6п8 шКЪ)А апт$ йе Ь|8Ьег Ка соптепт от аесопс)агу аттис|иге, йе цгеасег |Ье г!а)с от' !ао1ат)п8 ап !псогпр1ете сРЬ$А с!опе.
Ветоте йе ат)чепт от РСК, йе шчеат)да|от'з Ъея Ьоре о) тест|ту!п8 йе ятиатюп тч|ь то гетсгееп йе сРЪ)А ЕЪгагу ш 8геатег |1ерй |п |Ье Ьоре от" таатеп)пц опто а 6|11-!еп8|Ь с1опе. 1п гпапу шатапсея Ьоъченег, йе сопает)иепсе |на| !иг|Ьег Гг|ьтгатюп ап|$ гет)оиЪ!е|$ |$!аарроштгпепс. ТЬе оп1у соигае йеп ореп |чаа то Кепегате апт$ асгееп ат)т)тт!опа1 сРХА 1!Ъгапея 1п йе 1ате 1980я Ьотнечег, а Ьеттег |ю1и6оп ъчаа тоип|$ тчЬеп шетЬот)а ънеге т)еч!ает$ со сартиге тпЬяп8 ае8- тпепь от" сРЬ)А ап|$ |о акр!)ту |Ьегп Ьу РСК. ЕгоЬгпап ет а1.
(1988) т)еасг!Ъе|$ а Кепега1 ргосе|1иге тот |Ье гарЫ ашр66сатюп от сРЪ)А еп|Ь (ВАСЕ); 1.оЬ ет а1. (1989) т)ея8пе|$ апсЬоге|1 РСК то с!опе |Ье чаг!айе 5' ге81опа от'тпКЪ)Аа епсот$!п8 Т-се!1 гесертогя ап|$ ОЬага ет а1. (1989) |ье|1 е|ьеп6а1!у |Ье ааше тесЬг6|рте (Опе-а!т)ет) РСК) то с1опе )и11-1еп8|Ь сРЪ)Аз соггеаропсбп8 то шКЪ)Аа епсосбп8 а)се1ета1 гп|ьс1е а-тгорошуояпи от" йе Еигореап сотппюп тго8 апт) аеЬга6й (Вгас)тут)аи|Ъ гетто). ТЬеае сесЬп)т)иеа |$1$уег тгош сопчептюпа! РСК ш йат йеу гет!шге $спотн1ет$8е от оп1у а япаП ге81оп от аес)иепсе тч!|Ь)п е)йег йе таг8ес К1МА ог а раг6а1 с1опе от" сРЪ)А (р1еаае аее р18иге 8-5).
Риппк РСК, йе тЬегшоятаЫе Р)ч)А ро!ушегаае ь |$!гестес) то |Ье арргорпате |аскет КЪ)А Ьу а а!п8!е ргипег т)ет!че|$ тгош |Ье ге81оп от )|почни ает)иепсе; |Ье аесопс$ ргипег гет)и!ге|1 тот РСК ь сошр1етпеп|агу |о а Кепега! театиге от" йе тагкес — ш йе саае от" 5'-ВАСЕ, то а Ьоп|оро!уп|епс та|1 ат)т)ет) (|Ка сегпипа1 сгапатегаае) то йе 3' тегппп1 от сР)ч)Аа тгапасг!Ъе|$ !гпмнп а ргерага6оп от" шКЪ)А.!п е)Тест, тЬ)я яуптЬет!с та!1 ргоч!т)еа а рпп|ег-Ъ|псбп8 яте иратгеаш от" йе ип)спотчп 5' аес)иепсе от' |Ье тагкет тпКЪ)А. ТЬе ргос)иста от' |Ье ашр66са6оп геастюп аге с!апет! што а р!аяпЫ честог тог ает)иепстпц ап|$ аиЪ|ет)иепт тпап!ри1а6оп.
5'-КАСЕ ь пот аа еаау аа Ка |юипс)я ТЬе тесЬп)т)ие тпчо!чеа йгее тет)иептта1 епгутпатк атера (гечегае тгапяст)рт)оп, а|1|6|юп от' Ьоп|оро)у|пепе та|1я ап|1 РСК), попе от' |чЬ|сЬ ь тоо1- ргооЕ ТЬе арес66с!|у от ап|р!!6сатюп т)ерептЬ еп6ге1у оп йе апсЬогш8 ргипег ап|1 ь 8епега11у 1отн. ТЬе рори1атюп от ашр1|6е|$ РЪ)Аа 1а тЬегетоге епг)сЬет$ $ог 5' аес)иепсеа от' йе тагкес шК)ч)А Ьит ь Ьу по гпеапа риге. 1п ас)|$!т!оп, йе ап|р1|6е|1 РЪ)Аа аге от" я|сЬ чаг!аЫе 1еп8|Ь |Ьас |Ьеу |ьиа11у арреаг аа а япеаг оп ап акагоае Ке1. Етпа11у, йе !таст!оп от' агпр116е|$ РЬ)Аа |Ьа| ехтепт)а то йе 5' сегш)пиа от |Ье татке| КЪ)А ь япа11, регЬара Ьеса|ье гечегае тгапаспртаае Ьаа |$!|6си1ту !п тгапаспЪ|п8 К)ч)А тешр1атеа |Ьат Ьаче а Ь|8Ь т)екгее от яесопт)агу а!гостите ш йе!г 5' ге81опя Ргогосо) 9! Вар!д Атр)фсаг!оп о) 5' СОХА Епду 8.55 тмчОРРР ААААААА веооепсе-вресбс рпгпег 1 А а ве)попсе-вресагс о!!донос!еаббе а овен 1о рпгпе зуп!Пез!в о!!пз!-в1гапб РОМА Ну течегве !гапзспр1азе тм пррр ААААА АА агз1-з1гапб СОМА тепоче ПМА апб опмзеб рпгпегз апб абб а Погпоро)угпепс тад !о 1)те 3' епб о1 !Не Ягврв!гапб СОМА ов!пд 1егпвпа! !тапа!егазе По!парс!у!нет!с гаа ове ап оадо(бТ) анар!от та рпгпе вупспеав о1 зесопб-в1гапб СОМА весапб-в!гапб СОМА абар1ог-рпвпег 1 ТТТТТТ | астр!бу бонпе-веапбеб СОМА омпд а вепмепсе-вресб!с абар1аг-ргтптег 2 апб ап ойдо(бТ) абаргог-ргвпег 1 АААААА абер!от-рппт !ог-рптпот 1 ТТТТТТ абартог-ргвп | с!еаче абар1ог-рпптетз вг)!П гев1псбоп епаутез абар1ог 2 абар1ог 1 Е!Сз()КЕ 8-5 Оегегш(паг)оп о(1Ье 5' Епд о1 шйй(А ()з(п Б'-ВАСЕ (А) А зег)пенсе-врес(!(с рг!гпег 1 согпр(егпепгагу 1о а ге8)оп о()гпоччп вег(пенсе )з аппеа(ед 1о 1Ье РМ)А.
Е)гв1-з1гапд зуп1Ьез(з )з асЬ)ечед из)п8 гечегве 1гапвсг)р1аве апд д(МТР ТЬе О(МА ех(епдв 1о 1Ье 5' епд о(йе шВМ)А. (В) ТЬе рпгпегз аге геточед 1гогп йе геас(юп ргодисгз Ьу зр!и д)а(уз)в, апд а Ьогпоро)угпепс 1а)! )з аддед 1о йе 3' епд о(йе ОМ(А иа!п8 1егпнпа! 1гапз1егаве. ТуркаПу, дАТР!з иаед го Вепега1е а ро(у(дА) 1а)(; Ьоччечег, зопве )пчев68а1огз рге(ег 1о иве г(СТР 1о гпа)!е а ро)у(дО га)), раггки(аг)у И 1егпнпа! Аз аге а)геаду ргевеп1 1гогп тече!де (гапвспрдоп ог йе К)МА.
(Я ТЬе (дТ)„ас(ар1ог-ргнпег 1 гв иаед го рпгпе йе вуп(Ьез(в о( йе зесопд 21гапд. Апур)(дсадоп (з сопдпиед (о 8епега1е епои8Ь ргодис1 (ог с)огнп8 'ш1о а р(азш)д чесгот апд (ог зиЬвег)иеп1 зег(иенс)п8. Тгипса(ед сОХАз Вепегагед !Ьлпп8 5'-ВАСЕ Ьаче ТЬе загпе гегпиш ав 61))-!еп81Ь гпо)еси!ез (!.е., а ргипег аг 1Ье(г 3' епд апд а Ьгнпоро)угпепс га!! аг 1Ье(г 5' епд). Вой (и!)-!еп8й апд ггипса1- ед пю)еси)ез аге 1Ьегеуоге агпр66ед ш йе РСВ РЬазе оу 5'-ВАСЕ. Мапу ге6пеп1 епгз ОЕ 1Ье ог(8- ша! (есЬО(г)иез Ьаче Ьееп шггодисед 1о а))еч!а1е йезе апг! ойег ргоЫегпз (Тог геч(етчз, р)еазе зее ГТОЬшап )995; 5сЬаеуег )995; СЬеп )996). ТЬе Го))отч(п8 ргогосо! (в Ьазед оп а гпос66сагюп Ьу чч'.!.
СЬеп (Ст)ахо-'ччге))согпе) оу 1Ье ог(8(па! ше(Ьод ОГ ргоЬшап ег а!. ()988). Еиг(Ьег е!аЬогадопз апд пюд(6!садопз дгантп Кгош а чапе(у ОЕ о(Ьег Роигсез аге дезспЬед а1 1Ье епд ОК йе рго1осо!. 8.56 СПаргег 8: /п Ч(гго Аглр!1)тсаг!ол оГРИА Ьу РСК МАТЕИАсо ~ /МРОКТАХТ То гедисе йе сйапсе о/ соп1ат/пайоп шйЬ ехо8епоиь РХАь, ргераге апд иье а ьрес1а! ьег о/ геа8епть апс! ьо!игюпь Гог РСК оп!у.
Ва1се аП 81аььтчаге Еог 6 Ьосиь а( 150'С апг! аитос!аче аП р1аы(ситаге. Еог пюге (п/оггпаПоп, р(еаье ьее ЕЬе рапе( оп СОХТАМ/ХАТ1ОХ 1Х РСК 1п ГЬе сЬар1ег !иггодис6оп. САОТ1ОХт Р/еаье ьее Аррепд/х 12 Гог арргорпа1е Ьапд11п8 оЕ тпа1епа15 гпаг/тед ит/ГЬ <!>. Войег5 апс! ьо1о6оо5 Р/еаье ьее Аррепд/х 7 Еог соптропепгь о/ ь(ос/т ьо/и1!опь, Ьи//егь, апд геадеп(ь. 01!и1е ь(ос/с ьо!и1гопь 1о 1Ье арргорпа(е сопсеп(гаоопь.
70х Аглрййтса0ол Ьи//ег СП/ого/огт <1> дАТР Л глм) Гг/!ьос//ит ьа/О г/А/ТР Г20 тм) ьо/и8ол сол(атт8 аИ Еоиг с/А/Трь (рН 8.0) Р/аселга/ И/х/аье /лП/Ь!Еог Г20 ил!Еь/рИ Р!еаье зее тЬе тпГопиагюп раие1 оп 1ХН16!ТОК5 ОЕ КХаьгь тп СЬартег 7. ТЕ ГрН 7.6) Епкуоте5 апе! ВРГГег5 5х Кечегье Ггальслргаье Ьи//ег Кечегье Ггальсгтр1аье ГКА/Я-г/ерелг/ел( /3/т/А ро/утегаье) Р1еаье зее ЕЬе раис! оп КЕЧЕК5Е ТКАХ5СК1РТА5Е5 ()5ЕР 1Х КТ-РСК ш Рготосо! 8.
Тегтта! с/еохулис/ео1/т/у/ !галь/егаье Кегтта! !галь/егаье) Р!еазе зее тЬе шЕоппадоп раие( оп ТЕКМ1ХАЕ ТКАХ5ЕЕКА56. 5х Тегттаl !галь/егаье Ьи//ег ТПегтоь1аЬ/е Р/ЧА ро/углегаье Тат/ РХА ро1утегазе Ь йе зтапдагд апд арргорпате епаутпе Еог тЬе аптр66садоп зтаВе оЕ пюзт Еопиз о/ КТ-РСК. Нотчечег, тчЬеге е!опВадоп Еготп 3'-пизтпатсЬед рпгпегз Ь зизрестед, а тЬеппозтаЫе РХА ро1угпегазе чдй 3'-г5' ргооттеадйп5 аст(ч(ту птау Ье рте/еггед (СЫапц ет а1.
1993). Се!5 А8агоье ог ро/уасгу/ат!с/е 8еl <1> Р/еазе зее 5тер 9. /х/ос1е!с АскЬ апе! О1!копос!еоТ(с1е5 Аг/ар1ог-рлтег (70 рм) Г5 ' СЯСТССАСТССАСАТСС 3 ') тл Н О (70 рто/еь/р/) ТЬе адарсог-ргипег ы мед (и соп)ипсгюп чдтЬ а Пепе-зрестйс зелье рптег то атрй/у а рагдси!аг загнет сРХА. Айег атпр66сабоп, тЬе деягед ргодист сап согпрпзе аз Пи!е аз 1за апд аз пшсЬ аз 100зта оЕ тЬе тога! у(е!д оЕ РХА. 1Е песеззагу, йе уте!д оГ деягед ргодист саи Ъе ииргочед Ьу зегйиВ ир а зесопд гоиид оГ атпр66сатюп ияп5 тЬе адар!от-рпптег апд а пезтет1 Веие-зрестйс аийзепзе рптпег йат ЬтптЬ то а зес(иепсе чдй(и тЬе агпр!т6ед зе5тепт оЕ гагВет РХА.
Айег тЬтз зесопд гоипд о/ пезтед атр66садои, а1тпоя аП о/ тЬе ргодист детестед Ьу етЬЫшти ЬготиЫе зташ(п8 сопсатпз зеоиеисез соггезропс(- шВ то тЬе 5' ге5(ои оГ йе деягед тпКХА. О1щопис!еот(де рптпегь зуптЬеягед оп ап аитоптатед РХА зуитЬез(хег сап Вепегайу Ъе изед тп зтапт(агд КТ-РСК чдйош йтгтЬег рипйсадои. Нотчечег, атир66сас1оп оЕ 1отч-аЬипдапсе птКХАз ы ойеп тоге е/йстеит тГ гЬе о65опис1еотЫе ргипегз аге рипйес( Ьу сЬготасо5гарйу оп сопииегстайу ачайаЫе геяпз (е.5., ХЕХ5ОКВ, ХЕХ 1тЕе 5степсе Ргодиси) ог Ьу деиатиппц ро!уасгу1апис(е це( е1естгорЬогеяз, аз дезспЬед ш СЬартег 1О, Рготосо! 1. Гг/7)т -Аг/арГогрг/тег Г70 РМ) (5' САСТССАСТССАСАТССАГТ), 3') т Н О Г70 рлто/еь/р/) ТЬе (дТ) и-адар!от-рптиег ЪтптЬ то тЬе ро!у(А) ' !таст асЫед со тЬе 5' тегпипы о( сРХАз Ьу сегпппа1 тгапзГегазе.
!п гЬе ехатир1е 5(чеп ш тЬтз рготосо1, оие о/ тЬе тегпиш о/ йе агпр1т6ед РХАз Ьесоптеь ес(шрред чдтЬ гесоВп(т(оп ягез Еог Хйо1, 5ай, Асс1, Н/пс! Ь апт/ СЕК гехт пстюи еихутез. Ргососо! 9| Вар!|3 Агар!фса71оп о)~5 сР)|ТА Еле!я 8.57 Селе-яресИЕс апИяеляе о)!Волос)ел!|де рптегя (70 )см) т Н О (10 рто)ея))с!) ТЬе депе-ярес|6с апсаепве рп|пегя яЬои16 Ъе согпр!егпепсагу со йе !|ловчи яециепсе оЕсЬе сагдес п|ВХА, яЬои16 Ъе 20 — 30 пис!ео|Ыея )и 1епдсЬ, апс) йои16 сопса|п арргохипасе1у еоиа! пшпЬегя оЕ йе Еоиг Ьавев, часЬ а Ьа!апсес) биипЬисюп оЕ Сг апс) С геыдиея ап|3 а 1о|ч ргорепясу со Еолп ясаЫе весил|!агу ясгиссигея. Рог Еигйег с)еса)!я, р!саве вее Реядп оЕ Оддопис!еосЫе Ргйпегв Еог Ваяс РСВ |п йе )и!го|)исс)оп со йь сЬарсег.
Сепе-ярес16с рпшег 1 Ь иве|3 |п сЬе гечегве сгапяспрсаяе геассюп (дсер 2) со рпи|е яупсЬеяв оЕ депе-ярес|6с Есгяс-всгапг) сРХА. Сепе-ярес|6с рп|пег 2 Ь согпр!е|пепсагу со а яе|)иепсе )и сЬе сагдес гпВХА йас |я 5' со рпи|ег 1 ап|! Ь няе|! )и сЬе а|пр!16сасюп |саде оЕ йе геасбоп. Ая одясисаеб Ъе1о|ч, геясисбоп вися аге а1|чауя |!еядпе|! )псо ас!арсог-рп|пегя. Ноччечег, йеу сап а!яо Ъе )псогрогасес)! псо йе депе-ярес|6с о1!допис1еосЫев. ТЬе ргевепсе оЕ гевсисбоп ясея я|пр1|6ея с1оп)пд оЕ йе а|пр1|6е|1 с1)ХАя.
Кап|!от Ьехапис3еоос3ея (1 та)т!) |п ТЕ (рН 6.0) ГорНола3) 1п ап егпегдепсу, гапг(ош Ьехапис!еосЫев сап Ье иве|) )и р!асе оЕ сЬе депе-врес|6с апбяепяе о1|допис!еосЫе со рпп|е вупсЬеяя оЕ сРХА (Нагчеу апг) Раг!|хоп ! 991). 5иЬве|!иепс ые оЕ а депе-врес16с яепяе рпи|ег )и |Ье РСВ РЬаяе оЕ сЬе 5'-ВАСЕ геассюп депегасея сЬе |!еяге|! Рго|1исс (Нагчеу ап|! Раг!аоп 1991; Арсе апг) 5)еЬегс 1993). Вапг)огп о!)допис1еосЫев аге с1еаг1у пос йе Егвс сЬо)се Еог 5'-ВАСЕ япсе йеу с)о пос Ьаче |Ье аЬг!иу со йяспп|шасе Ъеичееп сЬе сагдес апг) апу осЬег яе|)иепсе |п йе ясагс|пд рори1асюп оЕ гпВХАв.
ТЬеу гпау ргочЫе а |чау со 1еар сЬе Ьиг|3!е оЕ сРХА яупйеяв |и сЬе аЬяепсе о!а депеярес|бс апсаепяе о1)доссис!еосЫе, Ьш йеу а1яо сЕе!ау йе )и!го|)иссюи |иго йе 5'-ВАСЕ ргососо) оЕ а сл|- с|а1 ве1есс!че |сер. Весаые оп1у а япа!1 Егасбоп оЕ йе сРХАя депегасег) Ьу гап|Еош рлпипд чбП аЬо солса|и а Ь~псапд ясе Еог сЬе депе-врес|6с вепве рпгпег, сЬе у!е16я оЕ ашр))Е|ес) ргог)исс аге сурка!!у чегу 1о|ч |чЬеп галс)ош Ьехапис!еоиг)ев аге иве|3 со ргипе сРХА вупсЬеяя !п ВАСЕ.
То!а! ВАГА ЛОО Рд)т!) и Н О ог Ро)у(А)' ВЧА Г70 )се)гп!) )л Н,О Тоса1 ВХА ехсгасюд Егои| се1!в |ч||Ь сЬаосгорк адели Ь депега11у сЬе сешр!асс о( сЬо|се Еог ВТ-РСВ Еог п|ВХАя |Ьас аге ехргеяеб ас гпо|Еегасе со Ь|дЬ аЬип|3апсе (Еаеййге ес а!. 1994). Ро1у(А)+ ь рге(евген ая а сешр1асе Еог а11 Еогшв оЕ ВТ-РСВ |чЬеп |Ье сагдес шВХА Ь ехргеяей ас 1о|ч аЪип|Еапсе. ВХА вшсаЫе Еог ияе ая а сешр!асе |п ВТ-РСВ гпау Ье ргерагес) |гоги япа11 пшпЬегв оЕ си1сиге|1 се!1я ассогедпд со сЬе сдгесбопв |и Ргососо1 8.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
