Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 199
Текст из файла (страница 199)
ТЬе ецшПЬпши аяос|асюп Ь|пйп8 сопясапса от" ает)иепсе-арес16с Р!ъ)А-Ьтпйп8 ргосе)па гап8е Егот 10а со 10'л м '. Аяшиш8 сЬас а ргосеш Ьаь ап ес)шПЪпшп ааюссадоп Ь|пйп8 сопасапс от'10'а м ' апд ап аяос)адоп гасе сопасапс от" 10' м ' а ', йе йяос)ас|оп гасе сопяапс от" |Ье геаи1сш8 РХА-ртосеш сои|р!ех М11 Ье 10 л м ' а ', апд 1са Ьа1Е-Пре ъчП! Ье -10 т)писеа !Яп86 ес а!. 1988; Яп8Ь 1993). ТЬия оп1у опе е|8Ьй от" йе сотр1ехез ъчП! ьигчтче а 30-тисните ъчааЬ. Сопле|!иепт!у, асгееп)п8 от ехргея)оп ПЪгапеа ъч)й доиЫе-асгапдед о68опис!еос)де ргоЬеа |а ипП)се!у со Ье аиссеяСи1 К сЬе ет!ш11Ь|1- шп аяоссадоп Ь)пйп8 сопяапс от" йе РХА-Ь)пйп8 ргосеш |а <1Оч м '. ТЬе ргоЫеп| сап Ье аПеъдасе|1 Ьу ияп8 а сопсасепасед ргоЬе йас сопса)па пш16Р1е Ъ|пйп8 ясеа !С1егс ес а!. 1988; 8саидс ес а!.
1988; ът)паоп ес а!. 1988). !п ь)де-Ьу-а)де сотпраг|аопя а ишсЬ асгоп8ег я8па1 ъчаа 8епегасед ъчсй ргоЬеа сопса)пш8 иил16Р1е Ъ|пйп8 ясея ргеянпаЫу Ъесаиае йе ргоЬе 1ъ сейеге|1 ас тоге сЬап опе ясе со |Ье Р)ъ)А-Ь)пйи8 ргосе|п рго|1исе|1 1и йе ЪассепорЬа8е р1ат!ие. ъът)сЬ сопсасепасед ргоЬет йас Ьаче Ьееп гайо1аЬе1е|1 со а ърес16с ас6чПу |и ехсея от 1От срт!С|8, П 1а роаяЫе со |1есесс аа 16|!е аа 1 р8 от' а )1-8а1ассоасдаяе 6ляоп ргосе|п сЬас сопсаша а Р!ъ!А-Ъ)пйп8 ясе (Яп8Ь 1993). Р1ат)иеа 8епегасед Ьу гесотиЬ~папс ).8с11 ЪассепорЬа8еа суркаПу сои|а|и 50-100 р8 от" 6ляоп ргосесп. Ноъчечег, оп1у а япаП ргорогдоп от йе ргосе|п рго|1исед Ъу йе ЪассепорЬа8ештесгед сеПа ъчои1д поппаПу Ье Го!дед !иго а соптогтпатюп ъшгаЫе тот Ъ|пйп8 Со 1тъ РМА 68- апд.
ТЬ)а ясиа6оп сап ютие6тпеа Ье нпргочед Ъу ехрояп8 |Ье 6ляоп ргосе|п Ъпейу со депасипп8 а8епса (Ипюи ес а!. 1988). %сгосеПи!оае 6!сегт саггусп8 йе 6|яоп ргосе)пт аупсЬеа)сед Ъу гесотЪ|паиС ЪастепорЬа8еа аге аоа)сед ш 6 М 8иатйпе НС1. Рипп8 СЬ)а ргосея, 1пао1иЫе а88ге8асеа от 6ляоп ргосеша аге ао1иЬ~!1гед ап|1 |1епасигед ргосеша аге тпаде ассеаяЫе со ао1- четА. ТЬе депасигапс 1а сЬеп 8гадиаПу геточед, росепдаПу аПоъч|п8 ап пкгеааед ргорогсюи от сЬе 6ляои ргосесп со ге!о!д шсо а соптогтасюпаПу асдче лотт.
Ноъчечег, и 1а нирогсапс со посе 14.31 !4.32 СЬарсег )4: Бсгеети8 Ехргекяоп (яЬгапек сЬас ехрокиге со бепасигапс гк пос а!ъчаук Ьепе6сьа!, аррагепс1у Ьесаике копье ргосе(пк аге пос геай1у гепасиге6 айег сгеаипепс ъч!сЬ 8иашйпе НС!. А яаге соигке ол ассюп 1к со 6гкс ксгееп а кес оь 61сегк сопса(п(п8 ргосе(п нпрппск йас Ьаче Ьееп ехрокед со 8иапЫше НС1. 1ь" по с1опек оь" (псегея аге гбепс(гьей йе ксгеешп8 кЬои16 Ье гереасей сЬ(к снпе ияп8 а кес ог ргосе(п нпрппск сЬас Ьаче пос Ьееп сгеасе6 ъч(сЬ 8иашйпе НС1. 1п копье сакек, и !к рокяЫе со ике 8оийъчексегп Ыосс(и8 со 6п6 оис ъчЬейег йе Р)ъ)А-Ь(пйп8 ргосеьп ос шсегекс ъчьП кигч!че бепасигас(оп апд гепасига6оп.
1п сЬ!к сесЬпнрле, пис1еаг ехсгасск сопсашш8 йе ргосеьп ог шсегекс аге Сгассьопасе<$ Ьу 8Р8-ро1уасгу1апьЫе 8е! е1ессгорЬогеяк, сгапкгеггег) со шсгосе1!и!оке шепьЬгапек, ап6 ргоЬед ъччй а сасепасед о118опис1еос!6е ргоЬе, Ьеьоге апд айег Ьеш8 ехрокед Со а сус1е ол бепагигагюп ап6 гепаШга6оп ъччй 8иапЫше НС1. А рояСьче геял1С, (и ъчЬ(сЬ а яп- 8!е ро1урерсЫе гк кЬоъчп со Ььпс1 йе ге1ечапс ргоЬе, ргочЫек епсоига8ешепс со ксгеепш8 ап ехргекяоп !ьЬгагу (М611ег еС а!.
1988). А)щипля ог'СЬе пис!еаг ехггасСк, СгеаСед апд ипггеаге6 ъччй 8иапг6(пе НС1, сап Ье аккауе6 Сог кресь6с Р!ъ)А-Ь(п6!п8 асспбсу ш пьесЬу1асюп ргосессюп ехрегнпепск, Ьу Р)ъ)аке 1 Соосрпп6п8, ог (и е1ессгорЬоге6с пьоЬ(1ьсу кЫ6 аккаук (р1еаке кее СЬарсег 17). Росепба11у роя6ь е р1ас(иек сЬас геасс ксгоп81у ъч(сЬ г(оиЫе-ксгапде6 01!8опис!еосЫе ргоЬек аге РЫ1сег1, гер!асей ас арргорпасе 6ь)ис(опк, апс1 гесексес1 Сог сЬеьг аЬь!1су со геасс ъчьсЬ ЬосЬ крее(6с апд попблпссюпа! сопсасепасес1 о118опис1еосЫе ргоЬек. !г" рокяЫе, сЬе попйпссюпа! ргоЬек кЬои16 Ье 8епегасе6 ггопь о!18опис1еосьЫек сопсашьп8 Ьаке киЬк6сисюпк )сиоъчп со ргечепс шсегасбоп Ьесъчееп сЬе саг8ес ргосе(п ап6 !ск Ь(п6!п8 ясе.
ТЬе анп ос йе кесопд гоипд оС ксгеепьп8 1к со !6епс!гу с!опек епсо6!п8 ргосеьпк йас геасс ъч!сЬ сЬе ъчййсуре о1ь8опис1еосЫе Ьис пос сЬе инлсапс чегяоп ог" йе РХА-Ь(п6!п8 ясе. С1опек ъчьй йеке ргорегбек аге ике6 со 8епегасе 1уко8епк ксга(пк ол Ьассепа сЬас и!ау Ье !идисед со купсЬекьхе 1аг8е аьпоипск ол ргосеш сог ике ш ЬьосЬеннса1 аккаук. Псниасе1у, йе 6лпссюпа!Ьу ог' сЬе ргосеш ншкс Ье бепюпксгасед ьп ехргекяоп ехрег(шеи!к ьи ъчЬ(сЬ а р1аяпЫ саггуш8 йе 6л11-!еп8сЬ с!опе6 сР)ь)А !к !исгосЬлсе6 шсо саг8ес се1!я со8есЬег ъч!сЬ а р!аяпЫ сопсашш8 пш16Р1е сорьек ог' сЬе гесо8ш6оп кег!пенсе ирксгеаш ос а Ьака! ргонюсег ап6 йе сойп8 кег!пенсе ос а герогсег ргосе(п. ТЬе аЬ111су ос йе ргосе(п епсос1е6 Ьу сЬе сР)ъ)А со ас6часе ог гергекк сгапкспрсюп 6огп сЬе ргоиюсег сап йеп Ье аккауе6 Ьу апа1укьк ог йХА ехсгассес1 Сгош сЬе сгапкгессе6 се1!к.
Сопсасепасес1 ргоЬек аге икиа!1у ргераге6 Ьу сгапкгегпп8 ь'Р гекЫиек со йе 5'-Ьубгоху1 сегпнпь ол съчо сошр1ешепсагу купйеск о1ь8опис!еосЫек, аппеа1(и8 йе РЬоярЬогу1асед апс1 гайо!аЬе!е6 РХАк, апд 68а6п8 йе аппеа!ест Р)ъ)Ак со гогш сопсасегпегк. А!сегпа6че1у, йе 6оиЫе-ягапйе6 сопсасегпегк шау Ье гайо!аЬе!ег) Ьу ияп8 гечегке сгапкспрсаке ог сЬе К!епоъч сга8- гпепс со саса1ухе сешр1асе-йгессед адй6оп оь' (а-ьлр)6ХТРк со гесеккеъ1 3' сегинш.
Кер!(са 61- Сегк аге ргерагед ггош а ЬасСепорЬа8е ). ехргеккюп 1(Ьгагу. ТЬе га6!01аЬе1е6 сопсагешегк аге йеп икег1 со ргоЬе йе 6!сегк гог р1ас(иек ЬагЬопп8 сЬе рюсеьпк ог шсегея. ТЬе го!1оъчьп8 ргососо1 ъчак ргоч!бед Ьу Мече МсКп!8Ьс (Упьчегясу ог Техая ЯоисЬъчексегп Мейса1 Сепсег, Ра1!ак). МАТЕль!АЕ6 САС)Т!СЫъ): Рсеаяе кее Арреийх 12 (ог арргорпа(е Ьаид!!и8 о( тагепа1к шаг(ъелс ъч(сЬ <!>. Вслйег5 апг! Яо! сл6опя Р1еаке кее Арреийх 1 Сог согироиеи(к о! к!ос(ь ко1н6опк, Ьийегк, апгс геа8еигк. Рьсиге к!ос!ъ ко1и6оик Со йе арргорпале соисеилга6оик. АТР (уОО тм) Ма)ье съчо АТР ко! ниах, с0 гиМ аоь) 50 илМ, гекресььче!у, Ъу й1исгоп о( йе !00 гоМ яьосль ьпсо 25 ьнМ Тг!я-С! (рН 8.0). 14.34 СЬаргет 14: 5стеелгле Ехртегг!ол Ыбгадег ссас11оас6сте Сопсроопс15 1у-агР!АТР 170 тС!)т1, 5000 Сг)тто!е) <!> Се15 Ь)олделагит!л8 ро1уасту!ат!де ее) <! > Р!гаге все 5гер 7.
прес!а! Ес1о1ргпеп$ АдЬеа!че !аЬе)а тат)сед чч!1Ь гад!ласс)че !л)г ог сЬет!1ит!леаселс тат)гете <! > йепяаЫе а1сегпаочеь со гаоооасоче !п1с аге сЬепп!штнпеясепс шаг)сегг ача)1аЫе !гота 5сгасааепе !01оцоя). ТЬе шаг!гегг сап Ье пасс) гпапу отпев апо кЬоп!4 Ье ехрояей со Опогексепс !)аЬс )пп Ьегоге еасЬ печг гоппсС о! апсогагСсоагарЬу. Ва1алВ д1ьЬеь 172 х 8 !лсЬеа) Стаса)1!г!л8 д!ьЬ Гогсерь, Ыилс-елдед )ч)еед)е !78-ВаиВе) алд аут!оде ВИед ьисЬ ччасегртоо! Ыас)г т)г 11лсоа 1л)с) Ь)с!тосе)1и1оае И!ей 5ерЬадех С-75 ьрил со1итл, ег)и!1!Ьгагед гл ТЕ 1рН 7.6) багет ЬаСЬь ргеьег Со 76'С, 65'С, алд 85'С ИтЬагтал ЗММ Ыоодлд рарет АсЫЖопа! КеадепЬ 5сера 8 алд 70 оусЬта ргососо) тес)и!ге йе геа8елсь 1!асед !л Ртососо! 7 оу йса сЬарсег.
МЕ1НОО Ргерагас1оп о1 Рас1101аЬе!ес! СопсаФепа1ес! РгоЬе5 1. 5ес пр сччо аерагасе рЬоарЬогу1ассоп геассюпа, еасЬ сопсанппа опе оу йе аупсЬессс о!1аоппс1еос!ссея со Ъе аппеа1ей о1!аоппс1еос!г)е 200 па 10х !сспаае)11ааае Ьпйег 2.5 р1 100 шм дпЬюйгепо! 2.5 Сс! су-пР)АТР 1ОО рС1 Н„О Со 23 Сс1 Ъассег)орЬаае Т4 ро!уппс1еоссгСе !сспаае (8 — !О ппсга)Сс!) 2 Н! !пспЪасе йе геассюпа !ог 1 Ьопг ас 37'С. 2. М)х йе ссчо рЬоарЬогу1аооп геасоопа соаесЬег. Аппеа! сЬе о!!аоппс1еоссг!ея Ьу !пспЬас)па сЬе ппхспге ш сЬе Со!1оччспа аег!пепсе, ччЬ1сЬ 1к шоас сопчешепс1у сагпед опс ш а йеппа! сус1ег: 2 пппшея ас 85'С 15 ппппсеа ас 65'С 15 ппппгеа аС 37'С 15 ппппсеа ас 22'С 15 шсппсеа ас 4'С АсЫ 4 р! оЕЬас)егюрЬа8е Т4 РХА 1!Паве (1 ААге)вв шис/)с!) апс) ! р! оЕ 50 тМ АТР.
!псиЬасе сЬе пихсиге Еог 12 Ьоигв ас 1б С. АсЫ 0.5 М ЕЕ)ТА (РН 8.0) Со а 6па1 сопсепгга6оп оЕ 5 тМ. Верагасе сЬе 1аЬе1ес1 о!с8опис!еосЫев Егот ипивес1 (у-вхр]АТР, в)п81е-всгапс)ес! о118опи- с1еосЫев, апс1 ип118асес) доиЫе-всгапдед о118опис1еосЫев Ьу хрип-со1шпп сЬготасо8гарЬу СЬгои8Ь а 5ерЬас)ех С-75 со1шпп (р!еаве вее Аррепйх 8). Евсппасе сЬе врес66с ас6чбу оЕ йе 6па! ргоЬе. ТЪе врессбс всичиу вЪои!с! Ъе >2 х !О' сргпЕрспо!е. !с ь а!во ровяЫе со асЪсече сЪе врессбс асилсу гес!Ыгес! !и й|в ргососо! Ъу 66сп8 йе гесемеи 3' епс!в оЕ ип!аЪе!ес) сопсасепасес! о!с8опис1еосЫев.
Айег сЬе 68ас!оп, вес ир йе епй66сп8 геассюп вв с)евсг!Ъес) сп Ртсосо! 7 оЕ СЪврсег 10. СЧЪегечег ровяЫе, ые пчо (о-ир)дЕСТРв !и еасЪ геассюп со спсгевве сЪе врес!6с асисбсу оЕ сЪе сассю!вЪе!ес! Ргойись. Ас йе епс) оЕ йе геасиоп, вера- гасе сЪе !аЪе!есс о!с8опис!еосЫев Егосп сЪе ипыеи (а-в'Р)с)ЪЕТРв Ъу врио-со1испп сЪгоспасо8сврЪу (р1еаве вес Аррепйх 8).
Апа!ухе йе яхе оЕ СЬе гайо1аЬе!ес) ТАХА Ьу попс1епасш(п8 ро!уасгу!агпЫе Пе! е1ес- сгорЬогеяв апс1 ашогайо8гарЬу (р1еаве вее Аррепйх 9). !Е а!1 Ьав ропе чче11 ш йе аЬоче аппеа1шц апс) гайо1аЪе1ш8 ехрепгпепс, йе сопсасепасес1 Е))х)А вЬоиЫ Еопп а !асЫег оЕ ро1утегв оЕ сЬе оп81па! с)ир1ех о!1цопис1еосЫе. Ргерага6оп 01 Г!!1егь Ргераге а8аг р1асев сопсаш(п8 р1ас)иев оЕ сЬе ЬассегюрЬа8е Х ехргевяоп !сЪгагу апс! пшпЬегес1 пЬгосе11и1ове 61сегв ехасс1у ав с1евспЬес) сп Ргососо! 1, Всерв 1-8.
СЧЪегечег ровяЫе, ые ап ипаюрПЕсес) ехргеяюп !сЪгагу. !Е йе рсосе!и оЕ пиегевс ы сох!с со Ъассепа ог гарргеяев 8гоъчй оЕ сЪе гесоюЫпапс ЪассепорЪа8е, сЪе с1опе спау Ъе ипиепергевепсес! ю агпрППед !сЪгапев. ()ве Ыипс-епс1ес1 Еогсерв (е.8., Мс11сроге Еогсерв) со геточе сЬе пшпЬегес) пбгосе11и1ове 61- Сегв 6опс йе 1асчп оЕ р1ас)иев апс) р!асе йегп оп сАсЬагтап ЗММ рарег счЬЬ ЕЬе яде ехровес) со йе р1ас)иев Еас(пц ирсчагй А!)осч йе 6!сегв со с)гу Еог 15 пнписев ас гоогп сетрегасиге. 1ау а весопс) (питЬегес)) 61сег 1трге8пасес) сч)сЬ |Р'1С оп еасЬ айаг р!асе (р1еаве вес 5сер 4 10.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
