Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 179
Текст из файла (страница 179)
Веса|ье оп1у йе Ынпс ог гесеяед 3' сегнипсь оГ сЬе геен!дп8!шеаг РЫА ь знзсердЫе со ехопнс!еазе 1!1 (р1еазе зее ТаЫе 13-3), йВездоп ргосее|Ь ншйгесдопа11у аъчау Ггот сЬе ясе оГ с!сачаке ап|1 шсо сЬе сагВес РЫА. ТЬе ехрозед яп81е ягапдз аге сЬеп геточед Ьу д!Везсюп мнсЬ пнс!сазе 81 ог тнп8 Ъеап пнс1еазе, апд |Ье РХА ь |Ьеп гес|гсн!апхед. 1Г деягед, а зупсЬес|с 1!п)гег сап Ъе |пзегссд ас сЬе зве оЕ гес|гсн1аг|аабоп, ТЬе та)ог деЕесс оЕ йЬ |пейо|1 ь йас !с гег)н)гез пчо нп)с)не гезспссюп ясез ~птейасе1у ад)асепс со сЬе рос пс Егот счЬзсЬ де1едоп5 ог(8)пасе.! п |ноя сазез, |Ьезе ясез аге! осасед ш |Ье ро!ус1ошп8 ясе со опе я|1е оГ сЬе саг8ес зег)пенсе. Рог сЬе ргосес)нге со Ье с(Гесс(че, Ь ь еяепс|а! йас ЙВезс!оп оЕ йезе нчо ясез Ьу йе арргорпасе гезспссюп епхугпез Ье со|нр1есе.
Ночгечег, |Т йе с|чо ясез аге с!озе со еасЬ о|Ьег, сЬь сап Ье асЫечед оп1у Ьу й8ездп8 Гог ехсепдед с|тез к(й 1агВе ап|онпь оЕ опе ог Ьой епхугпез, счЫсЬ сап !еад со п|сЫп8 оГ |Ье сегпр!асе. Веса|ье ехопнс1еазе 111 еГВс|еп|1у а!гас)сз сЬе 3' епд оЕ а пк)с (Мазан|вне ес а1. 1971), де!едопз гпау Ъе Вепегасед |п нпдеягаЫе!осабопз |п ЬосЬ |Ье чессог апд сЬе саг8ес РЫА. То зо1че йь ргоЫен|, Неш)соЕЕ (1990) дезсПЬед а |песЬод |п зчЫсЬ а яп81е-зсгапдед с|ген!аг РЬа8енн|1 РХА ыье|1 аз а сетр1асе Гог ехсепз|оп оГ ап о118опнс!еосЫе рпгпег Ъу ЪассегюрЬа8е Т4 РЫА ро1угпесазе.
ТЫз геасноп Вепегасез а донЫе-зсгапдед с!гсн1аг |по1есн!е спаса!п!п8 а япа!! пк)с ог Вар )п)отта!(оп Рапе1х 13.75 пгппесбасе1у 5' то тЬе рпгпег. Ехопис!еаае 1П ь йеп гьес1 то телес! тЬе геаи16п8 3' епд, апт( тЬе ехроаес1 яп8!е-а!таис(ес( РЪ)А ь гешочес( Ьу т68еатюп ъч(тЬ а аш8!е-а!гипс(-арес(6с епс(опис1еаае (пис!еаае 51 ог пшп8 Ьеап пис1еаае). ТЬе геаи1тш8 ает ог'!шеаг пеатес( РЫА тта8шепта Ьаче а сопппоп тегпипгь соггеаровйп8 со тЬе 5' епъ$ от" тЬе ргипег. ТЬеае ъ(е1етеъ( шо1еси1еа аге йеп гес(гси!аг(тес( апъ( илес( то тгапатотш се1!я ТЫа шетЬос( Ьаз йгее ас(чапта8ея ° Ыеатед т(е!ет(опа сап Ье шат(е !топь апу роют лп тЬе таг8ес Р)ъ(А.
° ВеяПстюв епхулпеа аге пот гьед. ° ТЬе епхутпаос геасоопа сав Ье сагпет1 ош аесрлевоа!!у тв а яв81е тиЬе, апъ( йеге ь по пееъ( то ехтгаст тЬе ао1итюп ълтЬ ог8ашс ао!чав!а ог со ргеслрпасе тЬе РЫА. Апойет плетЬос$ со соптго! тЬе ехтепт от" геаесооп Ь то 1аЬе1 йе РЫА гапс$ош1у ълй тЬюпис!еотЫеа Ъетоге с68еаиоп ъчттЬ ехопис1еаае !11. Весаиае тЬю-сопталшп8 пис1еотЫеа ате геяатавг то Ьус(го)уж Ьу ехопис1еаае 111, с(18еатюп ъчл11 атор ат йе 6гя р1асе йе епхуше епсоиптега а йю-аиЪат(титеъ$ пис1еояс$е. Ву соптго1!лв8 тЬе апюипт ог' а-тЫо шсогрогатюп, шчеат(8атога сап пюге теас(1!у оЫалп аеь о( геаестес( РЫА 6а8шепта от" тЬе т(еягет( яте (Кш8 апс1 боот(Ъоигп 1992). Ма!с(пК Тетпр)атеа гог $3$т$еохуает$оепс(пд чч!4$ч Ехопос)еаае $П 5еъ)иепсш8 атгасе8(еа Ъааес( оп т68еатлоп о( с(оиЫе-а!таис(ес( Р)ъ)А тегпр!атеа ълтЬ ехопис!еаае $!! Ьаче Ьееп ш гье япсе 1982 ъчЬеп Сио апс( "ъъти (1983) Вече!орет) а лпетЬос( ш ъчЬлсЬ тЬе РЫА аеоиепсе ъчаа оЪташеъ( Ьу геауптЬеы от йе геаестес$ а!таис(.
ТЫа шетЬос( е1(ш(па!ее( йе веет( лог а ргипег-ЬлгЫш8 яте, Ьит лт тес!шгет$1своъч(ес$8е от" тЬе геатпсооп пъар ог" тЬе таг8ет РЫА. А1$ЬоиВЬ (шргочешепта ъчеге плат(е (Сио апс$ Ъбл 1983), ехопис!еаае 111 ъчаа пот илес( ехтепяче!у то ргераге тептр1асеа гог РЫА аеъ(иепсш8 ипт(! 1984, ъчЬев Неп()сотТ'а рготосо) со сгеате пеатеъ( с$е!еоопа ъчаа риЫлаЬей Ноъчечег, тЫыпетЬос( Ь 1аЬог-штевяче апс1, ш аъ(с)1$(оп то епгуплаос геаесооп, гет)и(тел пшсЬ аиЪс!опш8, Втоъчй от" Ьассепа! си!!отея апъ$ рип6- сатюв от пис1ек асЫя $п ас(с((т(оп, а пеъч т)е!ет(оп ь пеес)ес( тот еасЬ 300 — 500 пис!еотЫеа о( аес)иепсе. Е$(ЧКЕ$4-БСА(Ч(Ч$(Чс МЕ)ТАСЕ(ЧЕБ! о Ып(сет-зсапв(в8 шита8епеяа (МсКптВЬт апс( Кш8аЪигу 1982) ь с(еа(8пес( то!осате апс( к$еп6(у (ипсоопа1 е!еплепь лп рготпотегя гер1(сатюв от)8(пя ап<$ ойег сь-астш8 ге8и1атогу ге8(опя А сапов ог шитапыа Вепегатеъ( ш ъчЬкЬ аЬогт ае8шепта о( тЬе таг8ет Р)4А аге гер!асес$ ш а ауатегпаос тааЬюп ъччй а "пеитга!'* РЫА асс(иепсе.
Вер!асш8 тЬе патша1 Р)4А лес)иевсе ъч(тЬ а асс(иепсе от йе ааше 1еп8й ъч(11 тьиа11у с(еатгоу тЬе (ивет)ов от" а рагтлси1аг гедл!аготу е1етпепт, Ьит (т ъчч1! пот сЬап8е тЬе арасш8, тогяопа1 торо(о8у, ог опч евтатюп о( йпсоопа! е1егпепта ъччйш йе т(огпаш. ТЬе рЬепосуреа ол шс((ч(йиа1 шшапь сап тЬегелоге Ье шарреъ( чт(тЬ аоше соптлс(епсе то арес(6с !всат(ова ъч(гЫп тЬе ге8и1атогу те8(ов.
Весаиае а1! шигаптз сагту йе ааше пеитта! лес)иепсе, согпрапаоп о(тЬе(г рЬепотуреа Ы ча1Ы ш гпоат салех 1п тЬе ог(8(па1 1ш1сег-асапшп8 шейос$ (МсКплВЬт авс$ К(п8аЪигу ! 982), 5'- апъ(3'-с$е!етюп шитапта ъчеге ттгат Вепегасес$ Ьу теаестюп ъч(тЬ ехопис1еаае 61 (р1еаае аее йе штотшатюп раие1 оп ЕХОЫРСЕЕАВЕ П$). ТЬе тегппш от тЬеае гпитаоопа ъчеге тЬеп ргесье1у шаррес( то Ыепт(ту раЬь от шитапта ъчЬоае епй ролптх т)1(легес( Ьу ргесье!у тЬе пшпЬет ол" пис1еотЫеа ргеаепт ш йе пеитга! аулътЬет(с 1ш1сег.
Рагга ол шитавь ъчеге тЬеп уо1сес$ со8етЬет тЬгоиВЬ а аупйеос 1ш1сег (р!еаае аее р(Вите 13-9). ТЫа аоипс(а ягпр!е лп $Ьеогу, Ьит и ь ехтгегпе!у 1аЬоПогь апс1 типе-сопаишш8 ш ргас6се. То оЬташ а иааЫе лет от!тп1сегасаппш8 шитапта Ьу тЫа гпетЬос$, а !аг8е пшпЬег о( 5' апс( 3' с(е1етюпа гпгьт Ье сопатгистес(, лет)иепсес), апс1 лпатсЬеъ(.
1п тЬелг от(8(па! рарег, МсКптВЬт апт$ К(п8аЪигу (1982) пает(43 5' апс)42 3' т(е!ет(опа то оЬташ а сапоп о( $5 !ш(сег-асавпш8 пштапь. А!тЬоиВЬ йе плейос$ ъчаа !атег ягеаш!шес$ (е.8., р1еаае аее 13.78 СБарсет 13: Мнсаеепез)з $сАЬ)ООМ Мс) ьАСЕЬ)ЕЯо ронг шесЬодя аге ыед со сопясгисс пш16р1е пшсасюпя шсо а де6пед ге81оп оЕ с!опе|1 Р)ъ)А: сЬеннса! шиса8епея|я, саяяессе ппна8епеяя, гп)я)псогрогасюп ппна8епеяя, ап|$ шнсаВепеяя ъчнЬ с)оред ог яр))сед о118опи<1еосЫея. ТАВОТЕ 13-5 Моде оЕ Ас6оп оЕ Сопнпоп!у $)яед СЬешка! Ми!анена МОое Оь Асс|Он МитАсея| Квася чдй йс апнпея оЕ риппеь апд рупгпЫшсь со 8епегасе йахопшш девчапчея йас аге гарЫ1у Ьудго!ухед ш аъ)испив яо1идоп со )сесопк ргодисся Весаые йе гасся оЕ |Ьсяс дса|п- шапоп гсассюпь шсгеаяе ъчнЬ десгсаяп8 рН, гпша8спеяь м 1|Ь пйгоня асЫ В ияиаПу саг- пед ош ас рН 5.2. Х)сгнив асЫ Виан)пе — «хав|Ь|пе, ъчЬкЬ раста ъчпЬ йупнне адепше — «Ьурохап|Ыпе, ъчЫсЬ ра|гя ъч)сЬ сусЫше сусояпе — н|гас|1, ъчЬкЬ раня чд|Ь адепше $«)пгоия ас!д йсгсЕоге Вспегасея сгапясюв пшсапоы, ъчЬегс ршшея аге гср1асе|1 Ьу ршшеь апд руппнйпсь аге гер1ассд Ьу рупшЫшея.
ОЕ сЬс йгее Ьаяся, су|ояне н деапнпассд шоя сЕ6с|еп|1у ап|1 Виашпе сЬе 1еаяс е81<1епду. ТЬе ге!аочс гасея оЕ геасноп оЕ сусояпс:а|$е- п1пе:Впав)пс аге 6:2:1 15<Ььяег 1960). Нудгоху1апнпе Рсапнпассь сусояпе ас!оъч рН 1<рН 2.5) апд совчетя |с со ига<11, я'5-<усояпе, Ьоъчечег, Ь геяясапс со деапнпасюп. Ас рН 6.0, сЬе |$еапнпасюп оЕ сусояпе Ь 1псогпр!есс апд а ясаЫе )пссгшсйасс ргоднсс 1Ьу|$гохуапшюсусояпс) !я Еопнс|1 сЬас сап ра|г ъч)сЬ адешпс ЕЬаъч!су $967). 1п ЬосЬ саве|, йс гсшК Ь а сгапядоп тписадоп ъчЬсгс С-С Ьаяе ра|гя агс сопчсяед со А-Т. Кеася а1пюя ехс1ияче!у чд|Ь сусояпс, ъчЬкЬ |с деапнпасея со шаг|1 156ар|го сс а1.
$973). Вни!6|е авд Ьудгоху1апвпе йегеуоге Вепегасе сЬе за|не суре оЕ сгавясюп пшсасюпя. В)во!6|с С1сачея йе Ьесегосусбс г)в8я оЕ сусояпе ап|1 йупайпс, ъчЫсЬ 1еадя со Ьудго!уск деруптп!|)адоп оЕ РЫА ас сЬс ясе оЕ апас)с ЕВгоъчп сс а!. 1966) ТЬс Ь|ВЬсг сЬс н|опоча!спс садоп сопсепсгапоп |и сЬс геассюп, |Ье Вгсассг |Ье ргсЕегспсе оЕ Ьудгахше Еог сусояпс.
Ривп8 РИА герИсадов, апу оЕ сЬе Еонг Ьаьея сап Ье шяегсе|1 шсо сЬс данВЬссг ясгапд орроясс сЬе аруппнйшс ясс. Нудгадпе СЬевь)са! Мя1ацеве5$5 СЬепнса! пшса8епеяя, йе пюяс чепегаЫе шейод оЕ 1оса) гавдопнхед ншса8епеяя, шчо)чея ехроя)п8 а яЬогс Ега8шепс !<200 Ьр) оЕ |1онЫе-ясгапде|1 Р)ъ)А со а шиса8еп, якЬ ая шсгоы асЫ, Ьу|1гоху1апнпе, Ь|ян16се, ог Ьудгахше Ер! саяе яее ТаЫе 1 3-5). ТЬс роро!адоп оЕ пшса8епйед Ега8шепся Ея сЬеп ысд со сгеасе а япа)! 11Ьгагу оЕ гесо|пЬ)панс с1опея сЬас сопсаш а пшса8ешхед Ега8шепс ш р1асе оЕ сЬе Ьошо!о8оия н«1!д-суре яеъ)пенсе. 1пйчЫна! гесогпЬ|папш саггуш8 пшсасюпя сЬас цепегасе а поче! рЬепосуре аге Ыепс|6ес) Ъу арргорда|е Енпссюпа1 сеься.
ТЬе ехасс 1осасюп ап|$ яре<16< сЬагассепяскя оЕ йе пшсасюпяЕя) сап Ье аясегса|пед Ъу апу опе оЕ а пшпЪег оЕ шесЬодя, шс!нйп8 РЬ)А яес)иепсш8 (р!саяе яее Ргососо! 7). $)пЕогсипасе1у, |Ье Егес)пенсу ас ъчЬ|сЬ пшсапся аге тесочетсд Ьу сЬе|шса! пшса8епеяя сап Ье ипассерсаЫу 1оъч (СЬи ес а1. 1979; 5о1пк1| 1981; ВияЬу ес а1. 1982; Кас)опа8а ап|$ Кпоъч1ея 1985).
ригйегшоге, ая яЬоъчп ш ТаЫе 13-5, пюя сошпюп1у ысд сЬегйса! пшса8епя геасс ъчЬЬ Ьаяея ш а ярес|6с шаппег, яо йас йе ьрессгшп оЕ пшсас!опя оЬ|а)не|1 чд|Ь а яп8!е пшса8еп шау Ье соо паггоъч со а11оьч а соп|ргеЬепяче апа1уяя оЕ а рагдси!аг яеВп|епг оЕ а рго|еш ЕЯюгс1е ап|$ Ха|Ьапя 1978; Р|Маю апд $«)асЬапя 1980; редеп апд Ь)асЬапя $982). р)па!!у, сЬепнса1 пшса8евеыя оЕ доиЫе-ягапдед РЫА В Ь|ВЫу повгапдош, чдй ге8)опя ргопе со |1епаснгасюп Ъеш8 йе шоя чн)пегаЫе.
ТЬ)я ргоЫегп сап Ье а11еласед, Ьис пос 1пЕотп а6оп Рапе!з 13.79 епбге!у е1спипасес), Ьу ияпц ыпц1е-ксгапс1ес1 Р)к)Ак ак киЬкстасек Еог пппацепеяк (С)геепЕле)д ес а!. 1975; 5Ьогс!е апс) Восяеш 1983). ТЬе у(е16 оЕ тисапь сап Ье )псгеакед Ьу станк(ессшц сЬенисаПу тисацеп)тес) РХА спсо ап ипц ыгаш оЕ ра соП йас )ас)ск итасц Ь -81усоку!аке апс) Ь сЬегеЕоге ипаЫе со геточе игасл! геябиек цепегасес) Ьу беат)пас(оп (Рше ап6 Ниапц 1987). Муегк ес а1.
(1985Ь) шсгосЬлсе6 тесЬосЬ со сгеас япц1е-ыгапс)ес1 РХА чбсЬ сЬеписа1к сЬас Пагпаце аП Еоиг Ьакек. Неге, ыпц1е-ыгапбе6 Р)к)А оЕ а гесотЬспапс М!3 ЬассепорЬаце Ь ехроке6 побег Пеулпеб сопй6опк со сЬеписа!к (п)стоик асЫ, Еогпис асЫ, апд Ьубгагше) сЬас нюй(у Ьакек ш япц!е-ксгапбе6 РЬСА ьт(сЬоис ЬгеаЫпц сЬе рЬозрЬойексег Ьас)сЬопе. Айег генсоча! оЕ сЬе сЬеписа!к, а ишчеша! кег)иепсшц рпнлег апс) а РСк)А ро!утегаке аге ике6 со купйеяте сЬе сопср)епсепсагу зсгап6 о( Р)к)А. 'лкгЬеп сЬе ро!уплегаке епсоипсегк с(аплацес) Ъакек (п сЬе сегпр1асе ксгапй П спсогрогасек пис1еосЫек еяеп6ацу ас гапс1осп.
Весаике аП рокяЫе пис! еосЫек сап Ье шсогрогасес) ас а япц)е роя6оп, йеге Ь а 759а ртоЬаЪс! Пу оЕ пшса6оп ас ечету ясе оЕ с)агпаце. ригйеппоге, Ъесаике сгапкчетюпк аге цепегасед ссчке ак Егес)иенс!у ак сгапя6опк, сЬе геки!6пц пшсасюпк цепегасе РХАк (апс) киЬкег)иенс!у ргосешк) лч)сЬ а счк1е крессгшп оС сЬапцек. Айет сЬе ехсепяоп геассюп Ь согпр1есей йе доиЫе-к!таис)ед сагцес Егацтепс лк ехсЬе6 апс1 тес!опес( шсо ап арргорпасе чессог. Ми!антк сап Ье Ыепс)улей йгесбу Ьу Р)к)А кес)иепс)пц о( ганс)от с!опек. ТЬе та)ог ргоЪ)ет сч)сЬ Муегк' гпесЬо6 Ь сЬе Егесрлепсу сч)сЬ кчЬкЬ шеци! нпна6опк сап Ье Ьо!асей То ргечепс сЬе Еоппа6оп оЕ ипассерсаЫе пшпЬегк о( пш16р1е пшсапск, и Ь песеыагу со )нпгс саге6лцу сЬе !епцсЬ о( снпе сЬе япц!е-ксгапс)ес1 РЫА Ь ехрокед со Патиц)пц сЬеписа!к, Нокчечег, йЬ гесрпгелпепс гпеапк сЬас гпапу оЕ сЬе сегпр1асе ксгапсЬ ексаре пюй6сабоп а!соцесЬег.
ТЬегеЕоге, сЬе Ьекс сЬас сап Ье асЬсечес) Ьу сЫк гпесЬос( Ь а Егес)иепсу оЕ ыпц! е пшса6ом оЕ 10 — 159я ТЫк ргоЫепл сап юте6тек Ье ацечласес( Ьу ияпц с)епасиппц цгайепс це1 е1ессгорЬогеяк со ршл(у Егацтепск оЕ РХА сЬас саггу нпна6опк (Муегк ес а1. 1985Ь,с) ог Ьу иыпц а ксгеешпц лпесЬос1 ылсЬ ак япц1е-ксгапс)ес) Р)к)А соп(огтасюп апа!уяк (Опта ес а1. 1989Ь) со Ыеп6Еу гарЫ1у с!опек йас саггу пшсасюпк.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
