Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 177
Текст из файла (страница 177)
34, сгегегш1пе йе ехасс епс!Ро1пга оугЬе с!е1ег1оп 1п еасЬ |пшапс Ъу РЫА аес)пепс1пд (р1еаае аее СЬаргег 12, Ргогосо1 3, 4, ог 5). 13.б8 СЬаргег 13: Мисадеиез(з ВАГ. З1 ВА1 31, лзо1асес1 6опс сЬе шаппе Ьассегшгп, А1сештоиаз езрераиа зр., ь а са!с)иш-с)ерепс)епс пис!еазе счЬозе ргес1огп(паис ас6чьу а8ашзс РХА Ь ехопис1ео1у6с.
Ма8пезшгп юпз аге а! зо гес)и)ге6 Гог Ги!1 ас6чиу. ВА1. 31 сопгалпы ° А 3'«5' ехоиис1еазе асг(ч)гу йас геплочез вюпопис!ео6с1ез Ггош доиЫе-зсгапс)ес) РХА (ВЬои апс) Сгау 1990). ° А 5' — «З ' ехоиис1еазе асбйсу сЬас счог)сз еГВ«слепс1у оп ып8!е-зсгапс)е6 РХА (Сгау апс( 1«л 1993).
° Аи еиз)оиис1еазе сЬас «Г!Везсз з(и81е-зсгаи«Гег) РХА з!олч1у ап6 с)еачез а чаглесу оЕ согяопа)!у зсга(пес( РХА юЬзсгасез, спс1ийп8 пе8ас(че!у зирегсо1!ед РХА, )ипсиопз Ьепчееп 1е6- ап«1 п8Ьс-Ьапс)ес) Р 1А (В-Х )ипсссопз), ап6 зирегЬе!сса! РХАз саггусп8 арипплс ясез ог соча1епс егозя!шЫ (1е8егзЫ ес а1, 1977, 1978; 1.аи ап6 Сгау 1979; К)1распс1с ес а1. 1983; Ч'е) ес а!. 1984).
ТЬе сошЬ«па6оп оГ сЬе сачи ехопис1еазе асс)ч(без салье« Ъой зсгапс)з оГ 6оиЫе-зсгапс(ест РХА со Ье зЬогсепес) Ггогп ЬосЬ евс)з. ВАЬ 31 лч(!!а!ю й8еы ып8!е-зсгапбе6 КХА ап6 АоиЫе-зсгавс)ес) ВХА, йе!ассег списЬ 1езз еГВссепс1у сЬап с)оиЫе-зсгапс1ес) РХА (Вепсеп ес а1. 1984). 1п гпо)еси1аг с!оп«п8, йе ехопис)ео!уск геас6оп оГ ВА1 31 Ьаз Ьеев сией ° То рто«Гасе иис- аи«Г Ь«йгесбоиа! г(е1ег(ои тисабоиз ас зресфс ысез ли с1оие«Г РХАз.
()в)йгес6опа! с)е!есюпз аге Ьезс Вепегасес( ш саг8ес РХАз с!опе6 Ъепчееп ссчо ив)с)ие гезспссюп ысез ш а р)аыпЫ ог РЬа8ешЫ чессог. ВЫ«гессюпа! «)е1есюпз сап Ье Вепегасе«1 Ггош а ип)с)ие шсегпа1 гезспс6оп зие ш йе саг8ес РХА (р!еазе зее р(Вогез 13-7 аис! 13-8). ° Аз аи ай( со гезст(с6ои тарр(иг оГ с!оие«Е РХАз (1е8егзЫ ес а1. 1978; Наизег апс) Сгау 199! ). ««Ьеп 1лпеаг 6ир1ех РХА Ь й8езсе«1 сч!ГЬ ВА1. 31, йе сегпипа! гезспссюп Ега8гпепь аге с)езсгоуес1 Вгзс, Го1- 1олче6 Ьу йе ылЪсегпипа) Ега8шепсз апс) ю оп. ТЬе оп1ег оГ гезспс6оп Гга8шепсз лп ап ипшаррес) зе8- псепс оЕ с!опе6 РХА сап сЬеге(оге Ье азсегсашес) Егош сЬе огс)ег сп и«ЫсЬ гезсгксюп Ега8шепсз йзарреаг 6опс зашр!ез йас Ьаче Ьееп й8езсе6 рбсЬ ВА1 31 Гог шсгеаяп8 регюс)з оГ 6гпе. 5о Еаг, йе 6шссюпз оГ >200 Вепез апс) йе ог8апгха6оп оГ ас 1еазс 100 сь-аспп8 зес)иепсез Ьаче Ьееп апа1ухед Ьу азьауш8 йе 6лпссюп оГ 6е!ес)оп писсапь сгеасе«1 Ъу ВА1.
31. 1в а«Ывлоп, ишйгес6опа1 6е!есюпз Вепегасе«Г Ьу ВА!. 31 Ьаче Ьееп гье6 со сгеасе зесз оГ вез!ей сегпр!асез Гог зел!иепс(в8 !оп8 зе8шепсз оГ РХА с1опес) ш ЪассепорЬа8е М13 чессогз (Ропса ес а!. 1982). Ргорегс(ез оГ ВАГ. 31 Мозс сопипелс(а! ргерагавопз оЕ ВА1. 31 сопсаш вчо Ыпеиса!1у йзсшсс Гоппз оНЬе епхуспе, а Еаы (Р) Гоггп зч)сЬ а пю1еси1аг ие)8Ы (М,) оЕ 105,000 апс) а з1олч (5) Еопп (М, = 85,000).
ТЬе 5 Гопы ь а ргосео1уссс с)е8габас(оп ргобисс оЕ йе Р Еопп апд ь Вепегасед Ъу а ргосеазе ш сЬе юрегпасапс оЕ А!геготоиоз си!сигез. ТЬе р Еопп ссзе1Е арреагз со Ье а с)е8гас)акоп ргодисс оГ ап ечеп 1аг8ег рюселп (Наизег ав6 Сгау 1990). ТЬе сччо Еогшз оЕ ВА1 31 де8гас)е яп8!е-зсгапл)ед РХА ас арргохипасе1у ес)иа! гасез, Ьис сЬеу ЖЕГег шаг(сел)1у ш йе асспбсу сЬас Вепегасез иш- агн) Ълйгес6опа! «1е1е6опз, с.е., сЬе 3'-«5' ехопис1ео1у6с с(е8гас)ас)оп оГ 6оиЫезсгапс)ес) РХА. ТЬе гасе оЕ сЬе геассюп оГ йе Р !опп ь с)езспЬес( Ьу йе е«)иас)оп оЕ)г«се) ес а1.
(1983): Р (чо'(5!) Р ( а«ах (5) Е К«« зчЬеге ч, )з сЬе сш6а! геассюп че!осбу, (5] ь йе шгба! зиЬзсгасе сопсепсгасюп ехргезье6 сп шо1е/1)сег оЕ с)ир)ех сегпиш', Р Рс Ь сЬе аррагепс шахипшв че1осву ас сЬе сопсепсга6оп оГепхугпе сией апс) К лР ь сЬе аррагепс МлсЬае!ь сопзсапс. ТЬе ча!ие о(К рр Ь -58 пм лчЬеп сЬе «пила! 1еп8сЬ оЕйе с(ир!ех зиЬ- а!гасе ь ш Йе гап8е оГ 2.0 — 2.5 )сЪ (Нгау апс) Ьи 1993). Ас ЫВЬ юЪзсгасе сопсепсгасюпз апс1 счогЫп8 ас гпахшсшп чеюйсу, опе ипсс оГ сЬе Р Еопп ге1еазез 2.1 арр пшо1ез оГ пис1еосйеЛЬег/пвписе Ггош с)ир!ех РХА пю1еси!ез.
ТЫз ча1ие оГ С«,„аа арр1(ез со РХАз счЬозе сопсепс оЕ (СоС) ь Ъевчееп 52 ап«1 67 Мо!«7«. Носчечег, Ъесаизе Йе ас6Ысу оЕ Йе Р Еогш оГ ВА1. 31 оп с)оиЫе-зсгапс)ес$ РХА лпсгеазез а!1861!у аз йе (Р '-С) сопсепс оЕ йе юЬ«!гасе 6есгеазез, Ъ' ы зЬои16 Ье шсгеазес) «РР Ъу шсегро!аиоп Ьу а Гассог оГ 1.7 аз сЬе (С '-С) сопсепс Аесгеазез 6 ош 52 со 37 Мо1«А«(Сгау апс1 Рл 1993). !п)оста!!оп РапеЬ 13.о9 геаспааюп все и Гиеаггхе р!аагп!б ОРСА Ьу еадеааоп гаги гевгбсгяп епгуте О гес~геи!аг!ге ПРСЯ Сгадтепса Фаг Паче Ьеео б~цеагеб Со Ше бее!геб ехсепг Е!Сс)КЕ 13-7 СепегаС!оп о! В!61гееС!опа! 0е!е6опа Ь О! еа6оп сч!1Ь ВАЕ 31 13!аеаг)оп ргосеес а сгогп а аВе чиСЫп йе Сарае!. Ес)иас)оп 1 саппос Ье иаеб со ргеб)сс сЬе !Впебса ог" беВгабассоп гог сЬе 5 уогт ог" ВАЕ 3! Ьесаике йе ча)иеъ оуК рр гог сЫа епкугпе аге 1агаег сЬап сЬе Ь)аЬеас сопсепсгасюп оГ киЬасгасе сЬас сап Ье аааетЫеб П1 арр Ы сЬе геас6оп (абрау апб 1ш 1993).
Носчечег, япсе )5] 1а тисЬ 1ея йап К ~~, а р1ос ог" ч, челы )5) у)е!ба а асга)ВЫ 1ше. ТЬе сепо оп сЬе г)аЬс-Ьапб к)бе о1 Ес)иасюп ! гебисеа со Р ()г'рр, К'рр ), ачЬ)сЬ ь сопасапс п1ах я ас Вхеб епхупсе сопсепсгасюп. Весаиае сЬЬ сепп ь сЬе а!оре ог" сЬе р1ос оГ с, чегаиа !5), Ь ь роаяЫе со са!си1асе Р1с,, [5) ) Сог апу рчеп сопсепсгасюп ос сЬе 5 !опп ог" ВАЕ 3! апб со ехсгаро!асе геаи1са сгот опе епгуте сопсепсгасюп со апойег. Еог ехагпр1е, !г х ишсв оГ йе 5 Сост саса1уге йе ге!еаае ог" 0.5 геяс1ие/т)песе угогп а сегсаш сопсепсгасюп ог" доиЫе-асгапбед епЪасгасе, сЬеп 2х ишь а611 сага!ухе сЬе ге1еаае ог 1.0 геа)дие/т)песе. 1п Вепега1, сЬе 5 Сост ог ВАЬ 31 сгипсасеа 1шеаг бир1ех )3ХА 20 — 30-Со!б тоге а!осе!у йап сЬе р гост (ЪСге) ес а!. 1983).
Носчечег, Ьу сопсгаас со йе р Согт, сЬе асс)ч)су ог" йе 5 уогт оп боиЫе-асгапдеб )3ХА Еи1огтаиоп Рапе!т 13.71 йе совсепсгайоп оЕ сЛе 5 Еопп со Ье иаей ш сЬе ехрейтепс )бгау апй Еи ! 993). Весаьье оЕ сЬете соиьр!касюпя сЬе Р хрес)еа ь сЬе епхуте оЕ сЬоьсе Еог сопсгоПес) аЬогсеп)пц оЕ йир!ехеа ьчЬоае Ьате согпрояиоп аЛоьча чч)йе 1оса) чапасюп. 'ььЬеп йе ргойисст оЕ ВАЛ 3) йцеайов аге со Ье 1ьцасес1, П ь ипрогсапс со сопяс$ег сЬас сЬе ачегаце 1епцй оЕ а)пц)е-асгапйей са))т сгеасес$ Ъу й)Ветс)оп оЕ )ьпеаг йоиЫе-тсгапйей РНА ь ь$ерепь1евс ов сЬе га6о оЕ Р апй 5 Еоппа апй оп йеьг сопсеппасюп.
ТЬе ачегаце!епцсЬ оЕ йе ргосгисцвц 5' са))а йесгеатез чйсЬ шстеаяпц епхугпе сопсепсгайоп ЯЬои апй бгау 1990). НьцЬ сопсепсгайопз оЕ йе Р ог 5 Еопп )>2 апй 10 ип)са)т), геаресс)че)у) чйП цепегасе РХА то)еси)ет йас сапу ап ачегаце оЕ ъечеп пис1еосьйет оЕ япц! еасгапйей РХА рег септипия 2 — 498 оЕ сЬеае гпо)еси)еа сап Ъе Ыипс-епй-1ьцасес1 со опе апойег а)Лоос Еигйег сгеасгпепс. 1.оьч сопсепсгас)опа оЕ еиЬег )опп (Ье1оьч — ! апй 5 ип)са/т! оЕ йе Р апс1 5 пис)еаае, гетрессьче)у) ьчьП цепегасе!опц т)пц)е-асгапйей сепшш ьчЬоае еЕ6сьепсу оЕЫипс-епй 1ьцасьоп ь чету 1оъч. ТЬия а 1оьч сопсевсгасюп оЕ Р ептупье ш а ргерагасюп гпау Ье сотрепьасей ш сЬ)а гецап) Ьу а ге1айче1у Ь)цЬ сопсепсгайоп оЕ 5 Еогт.
Ночтечет, гераьг тйй ЬассепорЬаце Т4 РЛ)А ро)утегахе )ог, ьп холопе сахея сЬе К1епоьч Егацтепс) )а оЫ)цасогу ас 1оьч сопсепсгас)опа апс$ с$еягаЫе ас ЬьцЬ сопсепсга6опа оЕ ВАЛ 31. А1сЬоицЬ рше ргерагасюпа оЕ сЬе Р апй 5 Еоппа оЕ ВАЛ 3 $ аге сопьтегсьаПу ачаь!аЫе, сЛеу аге чету ехрепяче. Кею!ь ияпц пихей ртератас)опт чч)П чагу, йерепсцпц оп йе те1авче атоивь оЕ йе пчо Еогпь т йе ьпьйа! Ргератайоп. Ноьчечег, пихес$ ргератас)опа оЕ йе ептуьпе ьчот)с регЕес)1у ьчеП Еог тиас ригроаея а1$ЬоицЛ П ь песеяагу со саггу ош рте)ипшагу ехрет)спев)а со йесетпипе йе сопсепсгасюп оЕ епхуте апй сЬе сипе оЕ йцеасюп сЬас ц)че сЬе ь1еягес1 геяь1ся Ргерагас)опт псЬ ьп йе Р Еопп аге ргеЕеггей Еог тисЬ саа)та ат гепьоча1 оЕ 1опц )>) 000 Ьр) аецтевсз Егопь сЬе сеппшь оЕ йоиЫе-хсгапйей РНА, йецгайасюп оЕ йоиЫе-ягапйей КЫА, апй тарршц оЕ геяпсПоп ясея В-Х РЛ)А )ипссюпя авй 1еяопа ш йоиЫе-хсгапйей Р)4А.
ТЬе 5 Еопп оЕ сЬе ептуте ь Ьеас ти)сей Еог гегиоча! оЕ аЬогс хецтепса )) 0 — 100 Ьр) Еготп йе сегпипь оЕ йоиЫеасгапйей Р)ь)А. Мьхей ргерагасюпх оЕ сЬе ептуьпе сап Ье ььей )ог апу оЕ сЬете саз)ся а!сЬоицЬ сЬе гею!ь ьч)П чагу аа иьепсюпей аЬоче. Рас48 апс$ Г)еотех ° Р)цеас)ова ьчиЬ ВАЛ 31 аге ььиаПу сагпей оис ас 30'С ш а ЬиЕЕет (РН 8.0) сопсаш$пц Ьесьчееп 0.4 авй 0.6 м )ь)аС! апй )25 тм оЕ ЬосЬ Саь" апй Мць". ° ТЬе Р)ь)А аЛои)й Ье рипбес1 Ьу сЬгопьасоцгарЬу оп С 6)ацеп со)итпа )ог йеи ес)шча!епс), сопсепсгасей Ьу ргес)РЬайов чйсЬ есЬапо1, геяьрепс1ес1 ш сЬе япаПеас ргасска! чо!ите оЕ Тпь/ЕРТА, апй йеп с61исес1 шсо йе геасйоп пихсиге со а 6па! сопсепсгасюп оЕ >20 тпцйп! )Еот а Етацтепс -2 1сЬ ьв 1епцсЬ).
ч ТЬе апюипс оЕ ептуиье отей аЬои)й Ье са!си1асей со йцеас <2098 оЕ йе )епцсЛ оЕ йе сагцес Егацтевс ш йе Еьгас 5 пипи)ее оЕ йе геассюп. ° А1н)иоь ьчПЛйгаьчв Егот йе геасйоп ас чатьоиъ с)теа аЬои)й Ье а)отей ас 4'*С ш 20 тхс ЕбТА. ° А цоой ьчау со сЬес)т сЬе ргоцгеть оЕ йе ВАЛ 31 йцеайоп и со й)Ветс ап а))с)иос оЕ сЬе запьр)ет са)сеп ас чапоьь Витез чйсЬ а геьст)сс)оп ептутпе йас с!еачеа йе сагцес Етацтепс аечега! твеь. Аз йе йцетйоп ргосеейя сЬе Етацтепса сцаарреаг Егот йе й)цеас ьп а йебпей отйег. Кпочйпц йеи яте апй тиар роясьопя П ь рось)Ые со еасипасе йе гасе оЕ ВАЛ 31 йцеайоп.
Н)84от)са! Реп!песе ВАЛ 31 ьчаа гПтсочетей ассЫепсаПу Ьу Ногасе бгау ьчЛеп Ье ьчаа ап ать)тсапс ртоЕемог ас сЬе !)п)чегясу оЕ Насосов ш сЬе еаг1у 1970я Ас сЬ)а типе — аечега! усата Ьеуоге то)еси1аг с1опшц оЕ РЫА Ьесатпе роььЫе— йе оп1у тоигсе оЕ тППцтат атпоипь оЕ рто)сагуос)с с)отей сиси1ат йир)ех Р)ь)А ьчаа йе ЬассепорЬаце РМ2, ьчЬьсЬ Ьай Ьееп йхсочегей Ъу Копи1ю Етре) о, а СЫ!еап т)стоЬ)о!оц)зс, Ехре)о ьчаа а репрасеск чьПог со сЬе Са!)Еогша 1пяВше оЕ ТесЬпо1оцу, ьчЬеге бгау ьчат а розсйоссога1 Еецоьч ш !епу ьт)поцгай'а 1аЬогасогу. бгау апй осЛега ш ьт)поцгай'т 1аЬотасогу ьчеге )псегетсей ш йе Ьуйгойувапис ргорегйет оЕ с)отей с)гси1аг Р)ь)А апс$ ю пеес$ей со рипЕу ЬассегюрЬаце РМ2 оп а!агце аса)е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
