Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 175
Текст из файла (страница 175)
йресса! ЕГГосрпсеп1 М(егоГиВе ГиЬех (0.5 гпВ ог М)егоКГег р(асех гч!ГЬ "()'пьЬарегГ гче)(х Ее.В., Вахсег В7 790-7 7) МасегЬаГЬь ргеьес Го 30'С, 37'С, алг( 70'С АГЫЖопа! Кеаееп15 51ер 74 оГ ГЬ(х ргосоео! геди(гех сЬе геааелсь Е(хсег( гл СЬарсег 7, Ргосоео! 24, 25, ог 26 Яог ГгалхГоггпас)ол). 51ер 75 оГ ГЬ)а рго1оео! геди(гех 1Ье геаВелсь Вх(ег( гл СЬарГег 7, Ргосоео! 7 ог 4 (1ог тглгргерагаКол оГр)ахгп!ГГ Р)г(А) ог и СЬар1ег 3, Рго1оео! 3 (Гог ргерагаКол оГ гер!(еасгче Голл оГ М73 РНА).
51ер 76 оГ ГЬ(х ргосоео! гедиггеь йе геааелсх 7(хсегГ т СЬарсег 72, Ргососо! 3, 4, ог 5. МЕТНО0 1. Р)аеас 10 (ГК оГ !агнес РЫА (гесотпЬ|папс Ъассег(орЬаае М13 гер!1еас(че Гопп Р(ч(А, рЬаКет(г( РЬ(А, ог р!аат(с! РЫА) илй ссчо геьспс Коп епхутеа ГЬас с!еаче йе ро!ус!оп(па ясе Ьеси ееп йе рг(гпег-Ь(пг(1па ясе оЕ йе чессог апг! йе сагаес РЫА. То псахнпые йе ейк1епсу оЕ с1еачаее, ачо(г( няпа геаслесюп ясеа 1осасег( нпгпегаасе1у агЦасепс со еаеЬ осЬег сп а ро1ус1оп(пн ясе. РегЕолп сЬе г((аеаса нпс(ег сопйс(опа оЕ 1ож РГ(А сопеепсгаКоп апс( 1агае геаебоп чо1шпе нп(Ь йе арргорласе ЬнКег гееопннепг1ег1 Ьу йе епхугпе'а пгапнЕаешгеп Р(аеас Вгхс нпсЬ сЬе геаслеКоп епхупге йас аепегасеа йе Ынпс ог гееемед 3' сеппгпня 'гЧЬеп а11 оЕ йе с!оаегс егген1аг РВА Ьаа Ьееп согсчегсег( со 1(пеаг ЕгЫА, аа еопуггшег( Ъу анагоае ае! е!еесгорЬогеяа, аг()нхс йе ЬнКег апг( аг(0 йе аесопг( епхупсе.
А1сегпаоче1у, регЕолп а асапдагс( рЬепоЬеЫогоЕолп ехсгаебоп апг( ейапо1 ргессраасюп, апд аес нр а ЕгеаЬ г((аеас(оп сп йе арргорласе ЬнКег Еог сЬе аееопг( епхупсе. Апу РНА сЬас еаеареа с1еачаае Ьу йе аесопг( епхугпе нп(1 Ье г((аеасег(!и Ьой гЬгееКопа Ьу ехопне!еаае 11! агн1 а611 йегеЕоге Ье нп!гае!у со аепегасе чгаЫе 13.60 СЬарсег!3: Мисадеиех|Ь с1опея ТЬе еЕ6с!епсу оЕ с!еача8е Ьу йе ьесоп6 ге|се!сс!оп епкуте сап Ье сЬесСге6 Ьу епд 1аЬеПп8 |ч!ЕЬ "Р йе у|гас с!еача8е ясе ап6 «ЬееЫп8 Еог сЬе г пЬ|ециепс !оы оЕ -30% оЕ йе гайо1аЬе!. 1Е 6!ЕЕ|си!с!еа аге епеоипсеге|! |п с1еач!п8 йе сеп|р!асе РЬСА со сотр!есюп сч!ЕЬ пчо геяпсбоп епхутея |че гесоттепд пяп8 а сопипегс!а1 Ыс Ьааеб оп а тесЬо6 де|се!Ьеб Ьу Неп!СсоЕЕ ! ! 990). 1п сЬ!ь ргосе6иге, а!п8!е-асгапбед с|гсп1аг рЬа8ет!6 РНА Ь мед аь а сеспр1асе Сог ехсепяоп оЕ ап о1|8опие!еосЫе рии|ег Ьу ЬассепорЬа8е Т4 РЫА ро!утегаае.
ТЬЬ геаебоп 8епегасеа а 6опЫеасгапбе6 е!геи1аг п|о!ееи1е спаса!п!и8 а япа11 п!еС| ог 8ар ипи|ейасе!у 5' со сЬе ригпег. Ехопис!еаье П1 ы йеп пае6 со ге|асс йе геап!с!и8 3' епй ап6 йе ехроье|С яп8!е-асгапбе6 РС4А ь гепюче6 Ъу 6!8еьс!оп |чЬЬ а яп81е-асгапйарес!6е епдопие1еаае !пие!еаае 5! ог ишп8 Ьеап пис!еаае).
ТЬе геаи!с!и8 вес оЕ !шеаг пеасед РНА Ега8тепса Ьаче а соиипоп сепп|пы соггеароп6!п8 со йе 3' епд оЕ сЬе рпи|ег. ТЬеае де!есе6 то!ееи!еа аге сЬеп гее!геи!аг!хед апд шее со сгап|Еоии се1!я ТЬЬ тесЬи6 Ьаа йе абчапса8еа йас пеасе6 де!ес!опь сап Ъе и|а|се |топ| апу ран|с |п сЬе саг8ес РС4А апд сЬас йе еигутас!е геасс!опа сап Ье саге!е6 оис ае|Спеис!а!!у !и а яп81е ыЬе; сЬия йеге Ь по пеед со ехсгасс сЬе |о1псюп |чЬЬ огхатс ао1чепи ог со ргес|рЬасе йе РНА. 5ечега! соппиеге|а1 Ыи аге ача|!аЫе Еог сопасгг|с!!ои оЕ бе!ес!оп тисапса пяп8 Неп!СгоЕЕЬ Н990) гпесЬо6 Ср!еаае атее йе шйгта6оп рапе! оп СОММЕКС!АЕ К!Т5 ГОП 51ТЕ-РЕКЕСТЕР МСЗТАСЕЬСЕ5!5).
РипЕу сЬе РЬЕА Ъу Ыаидаг|1 ехсгасс|ои счссЬ РЬеио!:сЫогоЕогис аиг) ргес|риасюи |ч)сЬ ейаио1. СагейПу геточе йе аирегиасаис, аиг) адсЕ 0.5 |и! 0Е 70% есЬаио! со сЬе реПес. 16па!и8 сЬе ре1!ес чбсЬ ейапо1 Ь ~гпрогсапс Ьесаые ао6!пт юп|НпЬ|Ь!с ехопие!еаье П! !НоЬеЬе! 1993) Ер!еаае аее йе !пЕогтас!оп рапе! оп ЕХО!|ССЗСЕЕА5Е П1). Ресочег сЬе счааЬес1 реПес оЕ РЬЕА Ьу сеисг)й5105 ас гиахииши ареесЕ Еог 2 |и!ицсеа ас 4"С |и а иисгойде, аи|1 йеи сагейПу геточе йе аирегиасаис.
1исиЬасе йе ореи сиЬе ои йе ЬеисЬ со аПоъч сЬе !аас сгасеа оЕ ейаио1 со ечарогасе, аи|1 йеи 61880!че йе РЫА Еи 60 Сс! оЕ 1х ехоиис1еаае 11! Ьийег. 5соге сЬе Асано)че6 РЬЕА ои !се. Р1асе 7.5 Сс! оЕ иис1еаае 51 геас6ои иихСиге |и еасЬ оЕ 25 0.5-ги1 ис)сгоЕпце СиЬеа ог 1и 25 ъчеПа оЕ а 96-счеП иисгосЬег р!асе сч)сЬ Е)-аЬаре6 иеПя 5соге йе иисгойег р1асе ог ис)сгойде сиЪеа ои а Ье|Е оЕ ке.
1исиЬасе СЬе РЫА 801исюи ргерагес) Еи 5сер 3 Еог 5 ги)ииСеа аС 37'С. ТгаиаЕег 2.5 Сс! оЕ сЬе |ю106ои со сЬе Пгас |и)сгоЕиде сиЬе ог |чеП оЕ сЬе иисго6сег р1асе сои!а)псиП СЬе иис1еаае 51 геас6ои иихсиге. То СЬе гегпа)избег оЕ сЬе РЬЕА 801исюи, ас)с) 150 ииП8 оЕ ехоиис1еаае 111 рег рию1е оЕ гесеааег) 3' Сепий) Е ! |л! ПС оЕ ехоиис1еаае!!! ччП! депегаСе 1 игио1е оЕ ас1|1-8010Ые Соса! иис1еоСЫе |и 30 ги)ииСеа аС 37'С). Тар СЬе СиЪе Со иих СЬе соиСеиСа аисЕ |иииегПаСе!у геСиги СЬе СиЬе Со йе 37'С счасег Ьай.
Упдег сЬеае сопйс|апя сЬе ап|оппс оЕ ехоппс!еаае П! ы |а!огас!п8, ап6 -200 ппс!еос!6еа рег ииписе аге геточе6 боги сЬе Ыипс ес|6 ог гесеые6 3' сегт|пы оЕ еасЬ оЕ сЬе РНА и|о!есп1еа |п сЬе |ю!и6оп, Моге ог !еы РНА сап Ье геточе6 Ьу чагу|и8 |Ье Ьссегча!а Ьес|чееп | пссеьяче аатр1ея !п 8епега1, йе гасе оЕ ехоиис!ео1уск Й8е|6оп оЕ РНА, |чЬ|сЬ 6есегт!иеь |Ье гап8е оЕ йе ехоппс!еаае П1 6!8еьс!оп епбро!пся чаг!еысереийп8 оп сЬе гпо!аг гасю оЕ епхугпе со сеп|р!асе.
То епаиге |Ьас а0 РЫА гетр!асез аге де8габеа а| |Ье аате гасе ап|! йас аупсбгоп|еиу Ь гпа!пса!пе6 очег аечега! Ы!оЬааеа оЕ РНА Ега8тепс, ехопис!еаае П! тиас Ье ргеаепс !и ехсея ш йе Й8еабоп геассюп. ТЬе гасе оЕ ехоппе1еаае 6!8еас!оп сап а!ао Ье сои!го!!е6 Ьу саггу|п8 опс сЬе 6!8еас!оп геасс!опь ас 6!ЕЕегепс сегпрегатгея Неп|Еоб ! ! 987) еас!таге| |Ьа| а 2 "С 6!ЕЕегепсе |п сеи|регасиге ш йе гап8е оЕ 30-40'С сап сЬап8е |Ье гасе оЕ 6!8еас!оп Ьу 100 Ьааезйп!иисе. Ас 30-аесои6 Еисегча18, геточе 2.5-)с! аагир1еа оЕ йе РЫА ао!ис)ои аи|1 р!асе йеп| |и я|ссеаа)че ис)сгойде сиЬеа ог счеПа оЕ йе иисго6сег р1асе соиса)и)иц йе иис1еаае Я геасиои иихсиге. ЪА'Ьеи аП оЕ йе аасир1еа Ьане Ъееи ЬагчеаСегЕ, ЕисиЪаСе йе ис)сгоЕще СиЬеа ог иисго6Сег р1асе сои!а)и)и5 сЬе иис1еаае 51 аи|1 с)1деасес) р1аып)с) РЫА Еог 30 ис)иисеа ас 30'С. Ргогосо!рт Сеиегагтоп о) 5егь и) 24еггег) Ре!е6оп Мигапгх счтгЬ Ехопис!еаге Ш 13.о1 9.
АтЫ 1 )т! оЕ ппс1еахе 51 асор ппхшге со еасЬ оЕ сЬе ш!сгоЕпде спЪеь ог тче!1х апт! шспЬасе йе геассюп ппхспгех Еог 10 ш!ппсеа ас 70'С. Неас)и5 со 70'С шас6часех иис1еаге 5) аттт) аиу гехЫиа! ехоиис!еаге ))!. Еог Еигйег шЕопиа0ои ои )Ьеье еихутиех р)еахе хее сЬе шЕопиасюи раие)г ои ХС)СЕЕА5Е 51 )и СЬарсег 7 аит) ЕХОХС)- СЕЕА5Е П ! ас йе сит) оЕ )Ь)х сЬарсег.
10. Тгапхуег сЬе ппсгоЕп5е спЬев ог пнсгос!сег р1ате со а Ьет) оЕ ке апс) апа1ухе а1тт)пота оЕ еасЬ оЕ йе вашр1ех Ьу адагохе де! е1ессгорЬогеяя СЬооте а соисеисгасюи оЕ а5агохе сЬас тч!)! а)!отч гиахииши т))зсг)ш)иас)отт Ьесъчееи сЬе ог)5)тта! )3ХА аит) 6 а5шеисх йас аге яиа11ег ш яхе Ьу ир со 2 )тЬ. 11. Роо1 йе хатпр1ех сои)а!п!пц Р)ч)А Егарпепсь оЕ йе т)ех!тес) яхе. А)Ы 1 ))1 оЕ К1епочч ппхспге Еог еасЬ 10 ))1 оЕ роо1ег) хашр1е апг) шспЪасе йе геассюп ппхсше Еог 5 пппшех ас 37'С. 12.
Рог еасЬ 10 )т! оЕроо1ет) хашр1е, асЫ 1 )с! оЕ0.5 шьс с))ч)ТРя Сопс!ппе !пспЬат!оп Еог 15 ппп- Шех ат гоот сетпрегасше. ТЬе ти05а1 Ьпес тисиЬасюи тч))Ь йе К!еиотч еихутие ти 5сер ) ! ь сагг)ет) ош )и йе аЬхеисе оЕ т)ХТрь со а))оъч сЬе 3' ехоиис)еахе аспчиу оГ сЬе еихуите со геиточе аиу гешаш)и5 ргостит))и5 3' сепити! Гхош йе т))5ехсет) ГтХА. 13. АсЫ 40 )с! оЕ Т4 ЬассепорЬаце!!5ахе ппхшге Еог еасЬ 10 ))1 оуроо!ег) хатпр1е.
Мтх апт) сопс!ппе !пспЬасюп Гог 2 Ьопга ас гоош сешрегаспге. 14. Тгапхуогш йе арргорпасе Е. со1т Ьохс тч)сЬ а!!т)мосх оЕ сЬе 1!расее) Р)ч)А. 15. Ргераге ш!п!Ргерагастопх оЕ ЬассегюрЬаце М13 гер1!сас!че Еопп Р)ч)А, р1аяпЫ, ог РЬацетпЫ РХА Егош ас !еахс 24 гапт)ош!у хе!естес) р1ас)пеа ог со!оп!ея 16.
Ь!пеаг)хе )Ье Р)х)Ах Ьу т)тцехсюп чч!)Ь ап арргорпасе гехспссюп епхутпе апг) апа1)хе сЬеп. х!хех Ьу е!ессгорЬогех!х )ЬгоицЬ а !оуо аг)атосе це!. !пс1пс1е йе опв!па! р1аяпЫ ог ЬассепоРЬаце РЫА йас Ьаь Ьееп !тпеаг!хег) Ьу гехспсстоп епхуше с))аеас!оп ах а шаг1сег. СЬоохе с1опех оЕ ап арргорпасе а!хе Еог хес)пепе!пц (СЬарсег ) 2) ог ат)йс!опа1 тех!с!сс!оп епхуше шарр!пц. Арргохииасе)у 80 — 9096 оЕ йе т)е)есюих ъч!1 суртса1)у гесати а итт)чегха) ог гечегге рг)шег-Ьшйи5 ясе аит) саи Ье хет)иеисет) пиите сЬе арргорпасе о))5оиис!еос)т)ея Еог ГтХА гет)иеис)их, Ь Ь Ьехс со хе)есс с)оиег сЬас ййег )и яхе Ъу -400 Ьр со еигиге йас аи очег)арр)иц хес мч)) Ье аиа)ухой Еог арргорпасе Е)ХА хет)иеис)и5 ргососо1х ыш5 сЬе ге))дасет) аит) гесгаихуогшет) РХАя хее СЬарсег )2. Рго1осо! 10 Сепегабоп о1 В|йгес6опа! 5е1ь о1 Ое!европ Ми1апЬ Ьу Ицеь6оп чий ВАЕ 31 Мис|еаье н тн!5 метноо, тне нг7сеел58 ВАЕ 31 (рцпйед Егош гЬе гпаппе Ъасгепшп А!теготопоа егре))апа ВА1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
