Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 133
Текст из файла (страница 133)
Кесонег (Ье ргес|р|1а1е о1 ОНА Ьу сеп1г(Гиеа1(оп а1 гпахнпиги ереед Гог 5 пдпи1еь а1 4нС. 11. Сагейлйу чаеЬ (Ье ргес|рл1а(е о1 О(х|А ъчйй 704 е(Ьапо| апг1 сеп(г(аде аеа(п. Кегпоче 1Ье ылрегпа(ап( Ьу сагейл! азр|га((оп апд айочг (Ье рейе| о1 ОНА |о дгу а( гоогп |егпрега(иге. 12. О|ахи!не(йе ОГЛА $п 40 и| о1 ТЕ (рН 8.0). Тйе )ле(д о1 н|пй)ея(гапдед 3)$4А ь нлна()у 5 — 1 О Нйлгп! о1 лйе огВ)па! (иГеслед сн$1нге.
Огана()у 2 — 3 гг) о1 1йе ОГЛА ргерагайоп ь геен(год Гог еасй ле1 о1 (онг ЕЛГЛА лег|иенс(пе геасдопл нь(ий с$уе Рпилегю Тйе )плейпгу аид аилониг о1 Елт|А (и еасй ргерагагюи сап Ье еп(|юагед Ьу апа(ух(п8 2-4-Н! а)$9нолх Ьу е|есггорйогеяе гйюнПЬ а 1.0% айагояе Пе! сонин|и|ой е|Ыдвгп Ьгогп(де. 12.24 СйаРгег 12: 0ИА 5е((иепстй СОЕг РКЕРАКАТ!ОМ ОЕ 0ЕРНО5РНОКУЕАТЕ0 ВШМТ-ЕМОЕ0 ~ ВАСТЕК!ОРНАСЕ М13 ЧЕСТОК 0МА РОК 5НОТСЕ)М СЕОМ!МС Ме1Ьог! 1. 5е1 ир Ьно |иЬел, А апс| 8, еасЬ соп(а(п)па 5 рй о1(Ье герйса1ве1оггп о1(Ье ОНА о1(Ье с(еа(гег) Ьас(ег)орйайе М13 чес(ог.
Ас(!051 1Ье чо|игпе о1 еасЬ 1иЬе 1о 44 р! лн!1Ь Н,О аис(|Ьеп асЫ 5 р| о1 1Ье арргорпаСе 10х геа(пел(оп Ьиу(ег. 0)йе51 Ьо(Ь айцио(5 о1 ОМА ил(Ь а геа(г!сйоп епхугпе (Ьа( с(еанеа опсе чн!(Ып 1Ье ро!ус)оп)пй 5)(е апс| цепега(е5 Ыип1 (еггп!п! (е.й., сйке51 М13гпр1 8 апг()ог М13гпр19 чн(1Ь |йпс!!). 2. 3. 10. 11. 12. 13. ТЬе 1ойочллпц г)ау, сопи(|йе пигпЬег5 о1 Ыие апс( со(ог(е55 р!аг(иек й Ейе гели!15 о1 Ейе 1е51 ййайопа аге 5. 6.
7. 9. Апа(ухе а|к|ио(5 о1 |йе Ьчо гйцелгл Ьу айагоае йе! е!ес(горЬогел(5 |и рага||е! вл(Ь а лаги р|е о1 ипсйце51- ес) ОНА, (о Ье лиге (Ьа1 по с(геи!аг 1оггпк о1 (Ье ОМА гегиа(и. Сопйпие )псиЬайпц (Ье гегпа|пс|ег о1 1Ье гййе51(оп гп)х(игеа а( Ейе арргорпа1е (егпрега(иге чнЫ!е |йе це! 'ь гиии(пц. МеапчнЫ|е, сййе51 1 иц о( Ьас(ег)орЬаке ). ОНА ог о| Ьег Ь)кЬ-пю(еси)аг-нне(ф1 ОНА о1 с|ей пес( 5Ые (о согпр|е(юп чч((Ь А(и!. А( (Ье епс) о1(Ье гййе51(оп, ех(гас( 1Ье геасйоп лн((Ь рЬепо|гейого1оггп апс! рге- с)р)(а1е |йе 0МА чн)(Ь е(Ьапо!. Кесйкко!че йю ргегйрйа1ег( ОНА |и 20 р! о1 ТЕ (рН 7.6). 5(оге йле сйл- 50(чег( ОМА оп )се ипй| пеег(ег( |и 54ер 9 о1 ЕЫ5 рго1осо!. ЪЛгйеп (Ье М13 ге51г салоп гйкелйоп5 аге сигор)е1е, асЫ 10 р| о110х С|Р Ьи((ег 1о Ьо1Ь 10Ьек ЛсЫ 5 ип((5 о1 С|Р 1о 1иЬе А, апг( (псиЬа1е(Ье геасйопл (ог 15 гп)пи(ел а1 3TС. То еасЬ 1иЬе асЫ 2 р| 01 0.5 м ЕОТА (рН 8.0) апс) 5 р| о1 10% 505. АсЫ рго1е)пале К 1о а 8 па| сопсеп(гайоп о1 50 щ)ги!.
!псиЬа1е 1Ье геасйопа (ог 30 гп|пи1еа а1 56'С. |1 Ь )гпрсн1ап( 1о |геа| |йе неггог ОНА члйй рго1е)пале К аг йл)л л(айе 1о гегпоче ай 1гасел о1 ген(псСюп епгугпе апг) С1Р 5ийгециепл ййайоп геааюпл мл(! пог лчогй ейс)епг)у й геейиа| епхугпеь аге ахйне. Л(1ЬоийЬ югпе |пчею ййа(огз ге|у оп Ьеа| )паа(на(юп (65"С 1ог 1 Ьоиг, ог 75"С 1ог 10 гп|пигел) апг) а ь!пй(е ел(гассюп чй1Ь РЬепойсЫого1оггп го ассогпр|ЬЬ 1ЫК рипуюагюп, |геа|гпепг мл|Ь ргоге~пале К еплигел гпах|гпигп риг)|у о1 |Ье негЛог ОЯЛ апг) ей)с)еп1 ййайоп. Ех(гас( (Ье геасйоп гп|х|игел опсе чл(Ь рЬепо! апс) опсе чч((Ь рЬепо|геЫогоЫггп.
Тгапа(ег (Ье ас)иеоил рЬааЕ 1о а 1геей гпкгой38Е (иЬе, апг) асЫ 2 р| о1 5 м МаС|. АсЫ 2 но|игпеа О1 (се-со!8 е(Ьапо), апс! 5(оге 1Ье 10Ье оп (се 1ог 10 гп|пи1ек )4аС! 'ь олег) )плгеад о1 логйигп асе1а1е (РН 5.2) 1о ргечеп1 ргеЫрйа|юп о1 ЕОТЛ а1 1Ыл иер. Кееочег 1Ье ОМА Ьу сеп1пйда1юп а1 гпахкпигп ареес) 1ог 5 пйпи1ел а1 4"С и а пксгоЫце. Кепюче (Ье ьирегпа(ап( Ьу аар|га()оп, апг) асЫ 1 гп| о1 70% е(Ьапо! а1 госки 1егпрега(иге (о 1Ье 1иЬе.
Сеп1г((ийе айа(п 1ог а ЫИЬег 5 гп(ии(е5. Сагеййу гйлсагг( (Ье лирегпа(ап(, апс) 5(оге (Ье ореп (иЬе оп (Ье Ьепсй ипЫ (Ье !а51 1гасеа о1 е1Ьапо! Ьаче ечарога1ег). Оьао|че 1Ье ОМА |и 100 р! о1 ТЕ (рН 7.6). СЬесй (Ье гесочегу апс! |п1ейй(у о1 1Ье чес(ог ОМА Ьу апа!ух)пй ап айциос (2 и!) Ьу е|ес|горйогель 1ЬгоийЬ а 0.8% аеагоае Ке!. Саггу ои1 а лег(Е5 О1 1е51 йкайопа 1о г)е1еггп)пе (Ье ейесйнепекк О1 1Ье рйолрйа(ааЕ 1геа1гпеп1.
5е1 ир йче геасйоп5 аа с(е|а)!ег) |и ТаЫе 12-3. !псиЬа1е (Ье ййа1)оп геасйопл 1ог 12 — 1 6 Ьоига а( 16"С. Тгапа(ес( сиги ре1еп1 Е. сой о1 ап арргорпа1е 5(га)и (аее СЬар(его 1 апс) 3) 05(пе 10 ~, 10 ', апг( 1 р| о1 еасЬ о1 1Ье ййа()оп геасс 005. Р|а1е 1Ье Ьас(ег)а оп гпесйа соп(а|гйпц |РТС апд Х-йа!. )псиЬа1е |йе р(а(ел а1 3TС. ла()51аглогу, сйарепке (Ье г(ерйолрйогу)а(ег) чес(ог ОМА (п(о айг)ио(5 апс) 5(оге (Ьепл а( — 20"С. ОерйолрЬогу|айоп лЬоиЫ гес)исе |йе пиплйег о1 р!айиел Ьу а (асгог о1 50-1 00 (Кеасйоп 3 чъ. Кеасйоп 1 )и ТаЫе 12-3). Вйа1юп о( с(ерйолрйогу(а1ед чеглог 1о а лгапдага ргерага1юп о1 Ыип1-епг(ег) |гайгпепи лЬоЫд гелий )и а 10-50-(о)8 )псгеале (и со)ог)ель р)ациеь (Кеагйоп 3 чъ.
Кеасйоп 5). Ргогоео! 1; бепегаггоп о( а Г.г(ггагу ОГ'Капе(опг)у Огег1арргпе ОНА Тпгеггг 12.25 ТАВЕЕ 12-3 Тец( Е(еа((оп КеасВопц оГ (ТерЬоцрЬогу!а1ег) М13 Тгее(ог 0)МА Т4 (3)н)А 30уа РЕС АТР (5 п$84) ЕГСА5Е (ОРТ1ОМА1) (Н() (ТАГЕ!55 (1МГТ5) (Н() Туре ое 0)х(Аа А В С Н,О (Н() 10Х ЕГСАТЮМ Во! ееа (Н() Т($ВЕ 5.0 1.0 1.0 2.0 1.6 6.0 1.0 !.0 1.6 5.0 1.0 1.0 2.0 1.6 6.0 1.0 1.0 1.6 3.0 1,0 1.0 2.0 1.6 "А .= 50 пц (-О О ! Ршо1е) оГ 1)певец ей попрЬоарЬагааеггеагед несгог Нп а но(шпе оГ 2 8$)$ В = 50 пц оГ Епеапгей Р Лог РЛоаае ига!ее несгог ($п а но)пше оГ 2 8$)$ С = 20 пц оГ ЬассепорЬаце 2 Г$МА ог фХ 174 Вр $3МА с(саней го сошр)ецоп гн)гЬ А!и! Дп а но1пше оГ 2 81). "цогпс согпгпегс)а1 1(цаае ЬпГГега сопгшп АТР.
$4Ьеп пяпц епсЬ Ьппега, йе адйаоп оГ АТР Ь по )опцег гег)п(гей 'ТЬе е(цсгепсу оГ)гцапоп сап Ъе $псгеааее Ьу аее(пц РЕС 8000 (Зона нг)н) го а сопсепггагюп оГ 5аа гп ГЬе япа! 1гцацоп шгхгше (аее СЬаргег 1, Ргогосо1 $9). 1$ ь ппроггапг го нгагш йе а!ос!с ао)паоп оГ РЕС 8000 ю гоогп гегпрегагпге ЬеГоге а88(пц и аа гЬе )ап сопгропега оГ йе!гцацоп геасгюпа. $$МА сап ргесгрпаге аг сгг18 гегпрегашгеа Ггопг ао!ппопа сопгагп(пц РЬС 8000. Рго1осо| 2 Ргераппд 0епаЫгед ВоиЫе-й~гапс|ед 0МА Тегпр!а1еь аког оеср.|епс~пц оу 0|деоху-гпес||а1ед Спа|п Тегт|пабюп | ы тнвокч, вк)тлвнс|нс ог тлвнлттлкнэ |лот|в|в-втклиттнл етлвмю РХА тегпр!атеа аЬои!6 тчог)с |че!1; ш ргас6се, |Ье ге|и!та Ьаче Ьееп а 1!тт)е т)!аарро!пт!пц.
ТЬе япш!|апео|ь ьо!атюп апт! рипбса6оп ог" 1агие пшпЬегк от" р! аяпЫк Ьак Ъееп с)!|6си1т то аитоп|а|е, Ьш ргераппВ йеп| !п ктпа!1ег ЪатсЬеа Ьу сопчептюпа! тесЬп!с!иеа ь оЬчю|ь1у а т!еер!у !пегбс!епс тчау |о аьас1| а РХА кет!иепсе !опадет |Ьап а Ы!оЪаае ог ттчо.
Риг|Ьегшоге, йе гехи!ь от |Ье лет!иепс!пд геаст!опа тЬегпзе!чеа Ьаче ойеп Ьееп !еаа |Ьап ЫеаЬ В1ап)с ппаВея ччеа1с Ьапт!!пВ ра||егпя аЬогт геа|1- 1епВ|ЬВ ргешатиге тегпппатюп от аес)иепс!пВ ргот)исти апс) атгопВ атора салынь Ъапт)а асгоя а11 1апеа от |Ье ие! Ьаче а!! Ьееп сопнпоп сошр1аш|я Моте гесепт!у, Ьотчечег, тч!|Ь тЬе ача!)аЬ!Вту от" ппргочед РХА ро)ушегааеа ап|1 йе ат!чеп| ог сус!е аетрлепс!пц, |Ье т!иабту ог РХА лет)иепсе оЪ|а!пет! ггош т!епатигет) |1оиЫе-атгапт!ет! тешр1атеа Ьаа игеас1у нпргоче|1. !т' саге ыа1|еп тчттЬ йе ргерага|юп ог" йе |егпр1а|е, 6 Ь по|ч рова!Ые |о оЬ|а!и ает!иепсеа арргоасЬ!пВ |Ье |рла1пу, !г' пот йе геат1-!епВ|Ь, гоибпе1у оЪ|аше|1 6огп ыпц!е-атгапт1ет1 РХА |ешр1атея РКЕРАКАТ!ОМ ОГ ТЕМРЕАТЕ О!ЧА ТЬе 1|еу гас|от |Ьа| т)етегпппеа |иссек ог та!!иге от ает!иенс!пВ ог" т!оиЫе-атгапт!ет) р!аяпЫ РЬ)Аа ь йе трла1!ту от" йе |етпр1а|е.
ТЬе Воа! Ыо |ье а шетЬот) от рипбсатюп |Ьа| е1ип!патез аа!т апт! о|Ьег япа!1 шо1еси!еа |Ьас |пЬ~Ьн Р!чА ро1утпегааея апд то Вес гЫ ог" япа1! 6адгпепта ог" пис1е|с асЫ |Ьа| шау аегче аа ипъчаптет) ргнпегя 1п шоя сааеа, |Ье шетЬос)а тьед гог Ьо1а|юп от" лет!иепс!пд-агат)е р!аяпЫ РХА тгош сгапагогшет) Ьастепа1 си!тигеъ аге Ьааес) оп йе |таис)аг|1 аПса1|пе 1уяа ргоседиге от' В|гпЪонп ап|1 Ро!у !1979). ТЬе Ьеат ге|я!|я Ьотчечег, аге оЬса1пет) тгош !агВе-аса!е ргерагат!опа от" р1аяпЫ РХАа |Ьас Ьаче Ъееп риг!6ет) ех|епяче1у Ьу ет)и!1!Ь|1- итп септг!6лиаттоп |и С|С!-е|ЬЫ!иш ЬготпЫе Вгат)!епта ог Ьу со!шпп сЬгошатоцгарЬу (аее СЬар|ег 1, Рготосо1а 9, 10, апт) 11). ТЬе 6па! ргерагат!опк от" р!аяпЫ Р!9А аЬоиЫ сопла!и а чету Ь!аЬ ргорог6оп от" с!пает! с|ген!аг шо1еси1ея !9!с)сед с!гси!аг шо1еси!еа рго|6|1е а юигсе ог" 3'- Ьу|1гоху! сегпнп! тЬа| сап Ье ех|еп|1е|1 Ьу РЬ1А ро!уп|егакея !п лет!иепс!пд геаст!опа |Ьа| иае !псегпа! 1аЬе1!пи, |Ье ипЬнЫеп рго|1ись ог" иптчаптес! ех|епяоп геас6огь сап иепегате а Ьап|1 ас ечегу роя6оп о! а ает)иепс!пд!а|Ыег.
12.26 Р1аяпЫ тешр!атеа аштаЫе Еог бег)иепс!08 сап аЬо Ье ргерагей Егош япаП-аса1е сп1|пгея 5ечега1 Ь!ПЬ-1ЬгопВЬрит шетЬода Ьаче Ъееп деаспЬед, (е.8., р1еаае аее Нпап8 е| а1. 1994; МОЫег апй В!ап 1997), Ъпт, аа уе|, ГЬеае Ьаче по| Ьееп ъчЫе!у а|1ор|е|1. Сопипегс!а1 Ы|8 якЬ аз СВХЕСЕВАХ Я ВЮВепе), Е'.|!Аргер ТпгЪо М!п!Ргер ((2!а8еп), ъ47!хагй (Ма8!с) Мш(ргерз (Ргоше8а), РЕКРЕСТргер (ЕррепдогЕ-5 Ргппе) аге а ишсЬ Ъепег ор|юп, Ьш |Ьеу аге ге!абче1у ехрепяче апдlог аге Пидтед |п |ЬгопПЬрпт. Рог гоп6пе аеъ)иепс!08, ъче гесо|пшеп|1 риг!Еу!08 р)аяпЫ Р)ъ)А Егош ашаП-аса!е сп1|пгез Ъу ргес|рЬабоп ъч(й РЕС (р!еаае атее |Ье рапе! оп А001- Т)О)ъ)АЕ РКОТОСОР РОК1Е)САТ)О6) ОГ РЕАВМ10 0ХА ЕКОМ 5МАИ:5САЕЕ СЫТОКЕ5 ВЧ РРЕС1Р1- ТАТ1ОМ ЪЧ1ТН ВЕС а| йе епй ОЕ1Ь16 рго|осо1).
1и опт ЬапсЬ, й!ыпетЬой, а1йопВЬ )епцйу, сопяа|епду у!е!йа ргерага|юпа оЕ р1аяпЫ Р)ъ)А оЕчегу Ь|ВЬ цпаП|у. РЫеоху-гпесПа|ей 6еъ)пепе!08 ь регЕоппед оп с1епа|шей р1аяиЫ Р)ъ)А |ып8 Пепе-зрес!Е- к рпшега ог пп)чегаа) рг!шега |Ьа| аге сошр1егпеп|агу |о 8еъ)пепсез ЙапЫп8 геЯпс|юп ятеа соиппоп1у |ьед Еог с!оп(п8 (е.8., р!еаае аее СЬеп апй 5ееЬцгц 1985; Наиоп' апд 5а)саЫ 1986; М|егепдогЕ апд РЕеЕЕег 1987) (р!еазе аее йе шЕоппа6оп рапе1 оп 1)МттЕВВАЕ РВ)МЕВ5 |п СЬар|ег 8). Реиа|пга6оп ь ВепегаПу асЬ|ечей Ьу ехроз!08 |Ье с1оаей с!гсц1аг р!аяпЫ Р)ъ)А со аП|аП ЕоПоъче|1 Ьу пептгаПхабоп (е.8, р1еазе бее СЬеп апй 5ееЪпг8 1985; Няао 1991).
А1|егпабче1у, Ьеа| |пау Ъе |ьед |о йепа|пге )шеаггхей ргерагатюпа оЕ допЪ|е-атгапдед р!аяпЫ (е 8., р1еаае аее ъътап8 апд 5од)а 1991). Ноъчечег, |Ье де|аП8 оЕ йеае ргосейигеа ч агу Пгеаду Егош опе рарег со |Ье пех| ав апйога аее)с |о Ппй спид(6опз |Ьа| ргечепс гарЫ гепашга|юп оЕ |Ье |еп|р1а|е. !и йь рго|осо!, ъче пае а йепа|пга6оп ргосейпге |Ьа| ь 1ЬогопВЬ апй гергойпс(Ые, Ьит !еп81Ьу. Моте гарЫ а1|егпа||че шетЬодз оЕ депашгабоп аге дьсптьед !и ап а|Ы|6опа1 рго|осо! а| |Ье епй оЕ 1Ь18 ргососо!.
1п зес)иепс!08 шеГЬода |Ьа| |ье |Ьеппо1аЬПе Р)ъ)А ро1ушегааез зпсЬ аа 5ес)пепаае, йепа|- пга|юп оЕ йе |ешр!асе Р!ъ)А ь сагпей оп| ЪеЕоге |Ье аес)пепе!08 геас6оп ь азаешЫей. ТЬе ЕоПоълп8 ргососо1 со |1епа|иге р1аяпЫ РЫА Ъу аП|аП 8Ьои1й Ье |ье|1 ш сои)ипсбоп ъчЬЬ Рго|осо1 3, ш ъчЬкЬ д!деоху-ае|)пепе!08 геаст!опа аге сага!ухед Ьу 5еъ)пепа8е. Рог сус!еаеъ)пепе!08 геас|юпя ъчЬъсЬ аге сага1ухей Ьу а йегшозтаЬ)е РХА ро!ушегазе, |еп|р1а|е Р)ъ)А !8 йепа|пгей Ьу Ьеа608 |Ье аес)пепе!08 геас6оп |о -94'С Еог 3 — 5 ш!пптеа ЪеЕоге Ъе8!ппш8 |Ье |Ьеппа1 сусПп8 рго|осо1 (р1еаае аее Рго|осо! 6). ТаЫе 12-4 ргеаепга |Ье ашопптз оЕ допЫезтгапйей Р)ъ)А |уркаПу гес!шгей Еог ОПйеоху бег)пепсш8. ТАВЕЕ 12-4 Атпомпш о( 000Ь)е-аттапдей 0ХА Вет!штей Еот 0Ыеоху-тесВа1ед 5ециепс)п8 Веас6опа 5|26 От Роовгт-зталмото 0)ъ)А (ъттстоа + 1мзтат) !и )|Ь Амооб|т От Течч|Ате |сеошаеи (тмопь) 1 )сЬ 2.5 )4Ь 5 )4Ь 10 (4Ь 20 ЕЬ 10 25 50 100 150 200 250 500 6.6 п8 16.5 п8 33 п8 66 п8 100 п8 133 п8 166 п8 ззо п8 16.5 п8 4! п8 82.5 п8 165 п8 250 п8 330 п8 410 п8 825 п8 ЗЗ п8 82.5 п8 165 п8 330 п8 475 п8 660 п8 850 а8 1.65 т|8 66 п8 165 п8 330 п8 660 п8 1.0 Н8 1.
ЗЗ Н8 1,66 08 З.ЗЗ 08 132 п8 330 п8 660 п8 |.ЗЗ 08 2.0 08 2.66 ||8 З.ЗЗ 08 6.66 ||8 Ртотосо! 2: Ртераттд Репатитей Тетр!атет Еот Яедиепстд Ьу Р(йеоху-таей!атей С)|атп Тети|подои 12.27 12.2В СЬаргег 12: РИА 5едиепс!ие МАТЕИАЕБ САОТ1О!ч): Р1еаае аее Аррепйх 12 Еог арргорпаСе Ьапс)!!пав оЕ таСег!а1ь тагес! ис!СЬ <! >. Войет5 апс! Бо!оЕ!оп5 Р1еаае атее Аррепйх 1 Еог согпропепСа оЕ аСос1с ао!ипопь, ЬиЕЕега, апс) геаКеп1я ОК01е хСосК хо!ипопа Со СЬе арргорпаСе сопсепСга11опя Аттопгит асеСасе 15 м, ипЬиЕЕегес), рН -7.4) СЫогоуоггппаоату! а)соЬо! Е24:1, ч)ч) < ! > ОМ5О <!> Орбоиас, р!еаае гее 5гер 10. Ейапо! ЕчаОН 12 М)ЕЕНА 12 тхг) <1> Ргераге Ьу арргорпасе г01исгоп оЕ а 1О гг сопсепсгасес) гсос)г ао!ибоп оЕ Ь)аОН )ыс ЬеЕоге ые, РЬепо), ес)и))ЕЬгасес) сч)ЕЬ Н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
