Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 112
Текст из файла (страница 112)
Ртсосо! 47 Р(гесс 5е(еспоп о( сЕ)ХАь сч(Й Ьаг(,'е Сепотсс РМА С(опеь 1(ЛО! Мос1е1с АС1115 апе1 О11допос!ео1141е5 ВАС РХА епсотраьь(пВ Йе 1агВе1 Велот(с геВ(оп Рпп(у аь г)еьег)Ьег) ш СЬарсег 4, Ргососо1 8 ог 9. В(ип1-епс(ег(, галс(от-рг(тег( сРХАь Р1еаье ьее Ргососо! 1, Раа5е 1. Со(7 Велит(с ()ХА РпгсЬаьег) Сгопс Ы(е ТееЬпо!о5(еь. Сугор(аьтк ро(у(А) КХА, риг(Е(ег( (гогл 1(ььие ог сеП (те о( т(егеь( Р1еаье ьее Ргососо! 1, 5саце 1. Р1еаье ьее йе шсгог)песюп со сЬЬ ргососо1 Еог гесопипепг)асюпь оЕ рпг)(у)пд КЫА со Ье пьес( сп сЫь ргососо1. Е)ХА ь(хе таг(гегь г(ХТР ьо(иВоп (ог п(с(г (галь(аВоп соп1а(п(пВ аП Еоиг г(ХТРь, еасИ а( 0.4 ть( (рН В.О) с(ХТР ьо(ийоп Еог РСВ соп1астлВ аП Еоиг с(ХТРь, еасИ а( 2.5 тьс (рН 8.
0) ОПВопис(ео1(г(еь (7 О тьь сп ТЕ (рН В.ОП: О115о3 ьхСТССА6ААТТСТ66АТССТС-3' О1)цо4 5'-6А66АТССА6ААТТСТССАСТТ-3' РогП1гче-сол1го! Е)ХА ТЬе рояВче-еопсго1 )37(А ьЬоп!д 1ье а рагс оЕ а репе ог ехргеяег) ьег)пепее сад (Е5Т) )гпоьчп со Ье ргеьепс сп сЬе ьсагипц ьецпсепс оЕЕсЫА. (Ело цепеь аге )гпосчп, сЬеп а ь!пц)е-сору сопсго! ОНА сап Ье ьеег1- ег) гпсо йе репою)с !агнес ЬеЕоге 1аЪе!шц (ас а 1:1 гпо!аг гасю) апг1 й1псег) )псо сЬе е()МА (ас а 1:10ь псо1аг гасю). ЬаЬе1 сЬе Е)ЫА ьашр!е пяль опе о) сЬе ргосоео!ь 5)чеп сп СЬарсег 9; сЬе сЛосее оЕ !аЪе!- )п5 ргососо1 Ь г)есегшшес( Ьу йе ехрегнпепса1 цоа! (Еог а 4)ьеоьяоп оЕ орсюпь, р1еаье ьее сЬе спсгог)пес)оп со СЬарсег 9).
ЕаЬе!ее1 Соспроопд5 (иряР(г(СТР (ЗОООСПтто(е) <! > Вю(гп-76-с(()ТР (0.4 тто(е) Брес1а! Е(1о1рп)еп1 Вагпег Врь Еог аи1отаОс ргре11еь Се(Пег соип1ег ог Сегеп(гоч соип1ег НеаВпВ Ыос(гь ргеьес со 74'С алг( 700'С НуЬг(г((ха((оп очеп ья(И гогаВпд ьр(пг((е, ог ьИа(г(пВ и а(ег Ьай МаВпес(с ьерага(ог 1ог гетосапВ ьсгерсаюсоп Ьеаг(ь Юула!) А4(его(иее (иЬеь (0.5-т! (И(п-ччаПег( (ог агпрИсабоп) РогП1гче г((ьр(асетеп1 ргреоеь 5ерИаг(ех 6-50 хрип со(итп, едиП(Ьгасег( т ТЕ (рН 7.6) Ргерас)гег) ео1шппь оЕ 5ерЬас(ех апг) ойег це! 61сгаВоп геяпь аге сосппсегеса)1у ачас!аЫе. 5(герсач(г((п-соа(ег( рагатаВпеВс Ьеас(ь ТИегта! сус(ег ргоегаттег( М(И с(еь(гег( атрП(гса(юл рго1осо! !( йе сЬеппа1 еуе)ег сь пос ес)шррег1 ьчпЬ а Ьеасег) 1!г), оье еЬЬег пппега) ог1 ог рагарпш ьгах со ргечепс ечарогаиоп оЕ1гдшг) Егогп йе геас6оп гп)хспге г)пг)пц РСК.
Рага(Есп ьчах гпау Ье пьес) пос оп1у со ргечепс ечарогасюп, Ьш а!ьо со псаспсаш ьерага6оп Ьепчееп согпропепп (е.ц., рппсег апг) сешр!асе) ппс)! йе геае6оп ппхшге Ь Ьеасей ТЫь ргечепсь попьреегас Ьспйп5 оЕ рппсегь г(пг(пц сЬе шсВа1 РЬаье оЕ йе геасВоп (р1еаье ьее йе 1п(огшасюп рапе! оп НОТ 5ТАКТ РСК сп СЬарсег 8). Яасег Ьа(И ргеье1 (о 65'С А(ЫИ1опа1 Кеацеп(5 5Сер 7 о( 1И(ь ргососо! гедшгеь геаВепп Пь(ег( т СИар1ег 70, Рго1осо! 2. 5(ер 2 о( (И(ь ргососо! гедиггеь геаВеп(ь Еог Йе ьулйеяь о( галс(от рг(тег( г(оиЫе-ь(галс(ег( сЕ)ХАь ог РСК-атрИес( гпьегсь Егот а сЕ)ХА ПЬгагу Пь(ес( (п Ргососо! 7, 5(аВеь 7 апс( 2. 5(ер 2 о( Йгь рго(осо! гедиггеь геаВелп Еог (аЬе(гпд Пь(ег( и СИар1ег 9, Рго(осо(ь 3, 5, апс( 6.
5(ерь 79 алс( 20 гедшге геаВеп1ь Пьсег( сп СИар(ег 6, Рго(осо(ь В апг( 70. 11.102 СЬаргет 11: Ртератапоп о1'сЕЗИА Е!Ьтат!ег апс( Сепе Ес(епгфсаг!оп МЕТНОО Ргерага6оп оЕ йе Е!п!сегее! С0(ЧА Роо!5 1.аЪе1 оП8опис1еогЫеа 3 апс1 4 аерагаге1у Ьу РЬоарЬогу!апоп аг (Ье!г 5' гепгиш ияп8 ро1уппс1ео(Ые Ыпаае, аа с)еаспЬес( !и СЬарсег !О, Ргогосо! 2. Мсх йе 1аЪе!ес! сотр!ешепсагу оП8оа !и ес(па! пю1аг гапоа (-2 р8 оЕ еасЬ), с!епагпге гЬет Еог 10 ш!писеа а! 100'С, апс1 31осч1у соо! гЬегп го гоогп гегпрегагпге. (Зиг!п8 й|а ргосеяь йе оП8оппс1еогЫеа аппеа! со Еопп ап ас(аргог. Ас()па! йе сопсепггагюп оЕ йе ас)аргог го 1 )г8йп1. Ргераге гЬе ЕОПочч!08 Пцапоп с)оиЫе-аггапс(ес( Ыипг-епс)ес( о1!8опос!еогеае агпр86сапоп аг ! Сс8/р), Егосп 5сер ! ! Ох Т4 РХА !!Вахе Ьо((ег гО шм АТР Т4 13ХА 88ахе аг ! ип!г/!с! НО геаспоп гп а асеп1е 0.5-гп! ш(сгоЕи8е ГОЪе: с)ЗХА (5сер 2) 2 РВ саяегсе ппхшге 3 Р1 3 р! за! за! со 30 р! 1пспЪаге ГЬе 1с8апоп Еог 16 Ьопга ас !4'С.
1пасочасе йе Т4 ВХА П8аае Ьу а 10-пипи(е !пспЬапоп аг 65'С. Ас(йп8 АТР ас а сошропепг оЕ гЬе гОх 1с8апоп ЬоЕЕег !еачес гооге чо1шое Гог чессог ог Гогес8п ОХА !и йе геасс!оп ш!хгоге. !Е их!п8 а сопппегсса1 !!Вахе ЪиЕЕег гЬас сои!а!пх АТР, гае адгаиоп оЕ АТР Ь по !оп8ет гецшгеа РипЕу гЬе ргос)вась оЕ гЬе П8аг!оп геаспоп Ьу РЬепоЬсЫогоЕопи ехггаспоп, Ъу арпи-со!- шип сЬгошаго8гарЬу гЬгои8Ь 5ерЬас(ех С-50 (р!еаае аее АррепгПх 8), апс! Ъу агапс(агс1 егЬапо! Ргесгрпапоп. Ргу йе реПе! апс! геаиарепс! Ь 1и !О р1 ТЕ (РН 7.6). В1ойп Еа!зе!!пе оЕ йе Сепогпк С!опе5 1псогрогаге Ъ!ог!пу1агес( геаЫпеа шго йе ВАС 8епош(с Е)ХА с!опе ияпц п!с1с ггапа1апоп. Ргераге гЬе ЕОПосч!08 пк1с !тапа!аооп геас(юп ги а агеп1е 0.5-гп1 ппсгоЕи8е шЪе (1аЬе! еасЬ ВАС ЕЗХА аерагаге!у): рог!Есес( ВАС ЕЗХА (О.
! шх)ш!) ! и! Ьюг!и-гб-с((ЕТР (0.04 гпм) ! Р! ! Ох и!с)с сгапс!аг(оп Ьо((ег 2р! с1ХТР гшх Еог псс1с ггапс!а6оп (0.4 гом) ! сс! !и-пр) с(СТР (3000 С!/шшо!е) ! Р! РХА ро!ушегахеЛЭХаае ! (5 ип!Ест!с!) ! гс! Н,О го 20 ф 1псиЬаге йе геаспоп Еог 2 Ьопга а! 4'С. РппЕу гЬе гагПо1аЬе1ес1 апс1 Ь~ог!пу1агес( ргос1ись оЕ йе пк1с !тапа!апоп геаспоп Ьу арпп- со1шпп сЬгошасо8гарЬу ГЬгопВЬ 5ерЬас1ех С-50 (р!еаве аее АррепсПх 8) апс1 агапс(агс( ейаио1 ргес!РЬагюп. Кеапарепс! гЬе реПес ш 10 )с1 оЕ ТЕ апс1 атосе П ас — 20'С.
Ргераге ас 1еаас 2 )с8 оЕ с(опЫе-а!таис!ес! с)ЗХА Егош сусор1аяпк ро!уас(епу!агес1 КХА Ьу гапс(ош рпппп8 (р1еаае аее Ргососо! 1). Ртогаса! 4: Р(гесс 5е!еспоп оу сРЖАя М|Ь Еагче шепот!с РЕ|ЕА С1опея 11.!03 Ргераге Ягер1ач1йп-соа1ед Рагагпадпе1!с Веадь 7. 1п а 1.5-|п1 яеп1е т(его(и8е тЬе, ячаяЬ 3 ти (300 Н!) оЕЪеас(я |ччй 500 Н! оЕ ясгерсачЫ!п Ьеас)-Ъ|пйп8 Ъийег |Ьгее Втея. РоПоичп8 еасЬ ячаяЬ, ге|поче йе Ъеас(я Егот |Ье Ъ!пйп8 Ьийег ия!08 а гпа8иепс яерагасог.
Кеяиярепг( йе Ьеас)я ас а сопсепсгасюп оЕ 10 тВЕт! |и ясгерсачЫ|п ЪеайЪшйп8 Ьийег. 8. Теяс ап а1и1иос оЕ еасЬ 1аЬе1!08 геаспоп (Егои| 5сер 6) Еог йе аЪ!1!су со Ъ|и|1 со ясгерсач!йп Ъеас)я. Ргераге |Ье Ео11о|ччп8 Ъ|пйп8 геассюп ш а ясеп1е 0.5-|п1 ппсгоуи8е сиЬе: яяаяЬея) яСгерСачЫ|и-соаСед Ьеас(я (5Сер 7) 20 н1 !аЬе!ес! Вепош!с РХА сопВВ' (5|ер б) ! н! ясгерсач!с(!и Ъеад-Ь|п65пВ ЬиЕЕег 29 н! *Мгх ея|и!|по!аг апюипся оЕ еасЬ яерагасе1у !аЬе!ес( ВАС |и сЬе сои!!а со у|е14 а иихсше ас а сопсеп|габоп оЕ |0 иВЕН1, 1псиЪасе йе геассюп Еог 15 пипшея ас гоот се|прегасиге яч!сЬ оссаяопа1 иепс1е т)х!пи.
Кеточе |Ье Ъеас(я Егоп| йе Ъ!пйп8 ЬиЕЕег ия!08 а |па8песк яерагасог, аи|1 сгапя(ег йе яирег- паСапС Со а ЕгеяЬ ягеп1е 0.5-т1 писгоЕи8е СиЬе. Ряе а бе!иег соипсег ог Сегеп(соч соипСег Со теая|ге йе гас(!пасс!ч!су ргеяепс оп |Ье Ъеас!я апд |п |Ье яирегпасапс. 1Е йе гасю оЕ Ъоипг( со Егее ср|п !я >В:1, |Ьеп ргосеес( |ччй |Ье яе!еспои. !Е йе га6о оЕ Ьоипс) со Егее срги Ь <Вс, и ь !!(се!у |Ьас сЬе РХА |чая гея|ясап| со ргорег !аЪе!!пВ |и 5сер 5. Ве(оге 1аЬе!!пВ, |гу риг!Еу!иц сЬе ВАС РХА Еш|Ьег Ьу яечега! гоипг(я оЕ ехсгассюп ъч!|Ь рЬепоЬсЬ!огоЕопп апсс раяяспВ и сЬ|оиВЬ а 5ерЬас(ех б-50 ярии со!шпп.
Осгес1 СОМА Ье!ес1соп (Рпгпагу йе!ес1соп) 9. В1ос1| ог "гереаС яирргеяя" гереСи|че яес)иепсея |и йе роо1 оЕсРХА (Егоп| 5Сер 4) ия(и8 Сас! РХА ая Е011осчя: а. Ргераге йе Ео11о|ччп8 аппеа1!08 геассюп ш а ясег!1е 0.5-т) ппсгоуи8е сиЪе: сРХА саггу!па !спссегя (5сер 4! 5 н1 (| нВ) Ьшпап аепо|п!с С„|| РХА 5 Н! (! НВ) Ь. Очег1ау йе геасбоп ппх|иге |ччй!!ВЬС пипега1 о!1 (-50 Н1) Со ргечепг ечарогапоп, апс) с(еиашге йе РХА Ьу Ьеаппц Еог 10 пппшея ас 100'С. Соо1 сЬе геаспоп иихсиге со 65'С, г(е1!чег 1О Н! оЕ 2х ЬуЬгЫ(хас!оп яо1ипоп ипс(ег йе о|1.
Мис йе со|пропепся Веп|1у. !исиЪасе йе геасВоп пихшге Еог 4 Ьошя ас 65'С. ЕЕУАС РХАя аге ияе4 ая |Ье депо|и!с !агнес, |Ье РХА и|ау Ье гоп!а|и!пасе|( мч|Ь Ьояс (уеаяс! пЬояогиа1 яег(иепсея. В!ос(с |Ьеяе яег(иепсея Ъу ия!пх ас !еая |00 па оЕ сРХА иегае4 Его|и гКХА (р1еаяе яее сЬе рапе1 оп ТКО(СВ1Е5НООТ!ХС а| сЬе еп|С оЕ сЬЬ ргососо1).
10. АЕсег ЬуЬгЫ|хасюп оЕ|Ье сРХА роо15 со сЬе С„|1 РХА !я сотр1есе, яес ир йе ргипагу йгесс яе!ессюп. Ре1(чег 5 Н1 (50 и8) оЕ Ьюс!пу1асес! ВАС РХАя !гоги 5сер 6 шсо а ЕгеяЬ т!его(и8е сиЬе, ап|1 очес(ау йе яо1ипоп ичй 1!ВЬ| ипиега! о|1 (-50 Н1 ) со ргечепс ечарогапоп, Репасиге йе ВАС РХА Ьу Ьеапп8 со 100'С Еог 10 пиписея. Соо1 сЬе геассюп со 65'С. 11. Ргераге |Ье Ео!1ояч!08 аппеаВп8 геассюи ш а ясеп1е 05-т! пс!его(ице сиЪе: Ьюипу!асей ВАС РХА Егот 5сер |0 5 Н! (50 иа) Ыос1|е4 сРХА Егот Еиер 9 ( ! нц сРХА р1ы 20 н1 | НВ Ся|! РХА) 2х ЬуЬгсаиасюп яо1шюп 5 н! М!х йе геа8епся Вепс!у, апс! !псиЬасе йе геаспоп Еог >54 Ьоигя ас 65'С ш а госа|ЫВ ЬуЪ|Ы!хас!оп очеп ог яЬаЫп8 |часег Ъай. То сартше апт) тчахЬ йе цепоппс Г)ХА апт) ЬуЪптцгет) сВХАя ргераге )Ье ГОПочч)пц )и а хтеп1е 1.5-ш! ш!стоГице гиЬе: ъчаьЬе<) ьтгергачЫш-соагет) Ъеат)ч ЮО р) аппеацпц геасцоп Еготп 5)ер ) ) 50 р) чтгертаптцп Ьеат)-Ыпт))пц ЬиЕЕет юо р) 12 !псиЪаге )Ье пихгиге Гог 15 пт!потек ат тоопт гептрегагиге ччПЬ оссах)опа! цепце пихтпц.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
