Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 110
Текст из файла (страница 110)
Ргогосо! 3: Бгаее 2: Е!егггорогапоп оТ йе ХгЬгагу тго СО5-7 Се!Ь 11.В5 СТАСЕ 2: Е!есФгорога6оп от $пе $лЬгагу !про СОЯ-7 СеИВ 1п гЬ)ь пав о( йе ехоп агпр176сабоп рго!осо1, СОБ-7 се!1ь аге !галь(ессес) ьч)!Ь гесотЪгпапс РБР13 р1аяпЫь сопгашгпВ йе Вепоппс 1)ХА о( шсегея. СОБ-7 се!1ь ьчеге ог(В)па!1у Вепчеб Ггот гЬе А16сап Вгееп пюп1сеу 1сЫпеу се11 1гпе СУ-1 Ьу ггапьуоппагюп илгЬ а гер1каиоп-с)епгсгеп! БЧ40 йа! епсос1еь н616-гуре 1агае Т ап6Веп (О!пгпьап 1981; р1еаье ьее йе !п(огтабоп рапе1 оп СОБ СЕЕЕБ). ТЬе 1агВе Т апиВеп Впчеь гер!кабоп о( !Ье ггапьГесгег) р1аяпЫ Ьу ас6чаг1па гЬе Б'ьг40 ог!В(п о( гер!ка6оп.
ТЬе геьи!6пц Ь|ВЬ-сору пшпЪег оу йе !галь(есгег) р!аяпЫ а11оьчь Еог ч1Вогоиь ггапьспр!юп, гпгпа6пц аг !Ье БЪ'40 рготогег о( РБР13, о( гЬе Ьегего!оаоиь ппп!пепе (р!еаье ьее Р(Виге 11-16). Ойег !гапьуесбоп гесЬп(с)иеь, ьисЬ аь 1!ро(есбоп, Ьаче Ьееп иье6 ьч(гЬ ьиссеьь гп ехоп агпр!16са6оп (е.а., р!еаье ьее Ъ)(ььоп ег а!. 1994). МАТЕВ1АЕ$ Вийегь апг! $о!и6опь Р)еаье ьее АррепВ)х 7 1ог сотропеп!ь о( ь!ос)с ьо!и6опь, Ьи((егь, апд геааеп1ь. 011и1е ьгос!с ьо1и6опь 1о йе арргорпа!е сопсеп!га6опь. РЬоьрЬаге-Ьи6егес) ьайле (РВ5) гнггЬоиг г)ва)елг саполь Епкугпеь апд Вийегь Тгургил-ЕОТА ьо)ипол Мис!е1с Ас!с!8 апд О11еопис!ео1!деь Е)МА ТЬе р1аапЫ 775!А го Ье ггапьгесгед гчаь ргерагег1 1п Бга8е 1 оГ гЬгь ргогосо1, Мерь 10 — 12. Р)аьт(г) несгог Тог иье аь солсго) (57ер 3) Мег11а Ои)Ьессо'ь тос)17гег) ЕаВ)е'ь тес)гит (ОМЕМ) солгаттВ 70;4 Ьеаг-тасина!ее( Те!а) са(Е ьегит Сеп1г!йдеВ апд Ко$ог8 Бота(1 Н7000В го!ос ог ег)и(на)елГ прес!а! Еци1ргпепФ Е)есггорогапол с)енгсе алг( синеиеь Виед илй е)есГгог)еь ьрасег) 0.4-ст арагг Т)ььие сиИиге спьЬеь (700 тт) ИИе-Ьоге р(регГеь Се!18 апг! Т!88иеь СО5-7 се))ь СОБ-7 се1!ь аге Вгоагп го а сопйпепсу ог 75 — 85ауа гп ЕгМВМ сопгагпгп8 ! 0% Ьеаг-1пасичагед 1ега! са11 ьегпгп.
рог г!ега1!ь оу г!еа11п8 алй сеПь 1п со!гоге, гпс1псип8 ггурь1п1г1п8, р1еаье ьее Бресгог ег а1. (1998Ь). 11.86 СБаргег 11: РгерагагЕоп оГ'гРЕЧА ЕЕЬгагсез апгЕ Сепе ИепгфгагЕоп МЕТНОаа 'чЧааЬ йе шопо1ауег оГ СО5-7 се!15 чч)сЬ РЬоарЬасе-ЬпЕЕегег! аа)ше!асЫп8 ВВча1епс са6опз. ггешоче сЬе се!!а Ггош йе апгГасе оЕ йе г!ЕаЬеа Ьу сгеаспсепс чч)сЬ сгура)п-ЕГ)ТА.
Со1!есс йе се!!а Ьу сепсг)ЕпВассоп ас 250ч (1100 грш ш а 5огча11 Н1000В госог) Еог 10 шсппсек ас 4"С. А!МРОССТАЬ!Т Кеер йе СО5-7 се!)а соЫ СЬгооВЬоог йе ргосе6оге. Рог Веса)1а оп ггуряп)асп8 ее)Ь, р!еаза аее 5рессог ес а!. 11 998Ь). Аг!)пас йе чо1цгпе оГ сЬе Е)ХА аашр1е со Ъе паег1 Гог сгапаЕесс)оп со а соса1 чо!шпе оЕ 100 р1 ш РВ5 гчссЬопс г)1ча)епс саВопа. ТЬе агпоппс оЕ СЗСЕА гецшге6 Еог сгапасес6оп пшас Ье орс)шсаед аа деасгСЬед сп СЬарсег Сй, Ргососо! 5. йезпарепгс 4 х 10а СО5-7 се!1а Еп а чо1шпе оЕ 700 р! оГ РВ5 ччссЬопс гВча1епс саВопа, Мыс сЬе се1!а сч)сЬ йе 13ХА ш а соо!ег! е1ессгорога6оп спчессе (0.4-ап сЬашЬег). 1пспЪасе сЬе ппхспге Еог 1О шсппсеа оп ке.
Сгае оЕ РВ5 ччй гВчасепс са6опа сап!еа6 со агсш8 дппп8 есессгорога6оп, счЬ)сЬ сап гшп йе е!ессгорогасог. Ве аше со регуогпс а сгапауес6оп чпй чессог-оп!у ЕсЬСА аа а сопсго1. Оепс1у геапарепгс сЬе ее!1а апг! шсгог)псе йе ЕЕЬ)А 1псо сЬе се1!а Ьу е1ессгорогаВоп ас 1.2 )гЧ (3 )сч/еш) апгс 25 ре 1пппееВасе!у гесшп сье сичепек со ке, апг! асоге сьегп Еог 10 ш)ппсеа.
ТЬе сопбсг)опа Сог е)ессгоро гас!оп гпау пее6 со Ье орс)пиал аа деасгСЬе6 Сп СЬарсег с 6, Ргососо! 5. 1Ле а ъчЫе-Ьоге рсрессе со сгапаГег 1 х 10' оЕ йе е1ессгорогасег! се!15 спсо а аеПеа оЕ 100-ппп с!папе сп1шге йаЬеа сЬас сопсаш 10 ш! оГ ЕсМЕМ сопсашшВ 10% Ьеас-Епас6часед Геса1 са)Е аегшп сЬас Ьаа Ьееп ъчагшег! со 37 С. !пспЬасе йе сп1шгеа Гог 48 — 72 Ьопга ас 37'С ш а ЬшпЫЕВег! шспЬасог ччссЬ ап аспюьрЬеге оГ 5-7% СО . 11.88 СЬаргег 11г Ргерагаг)оп оЕсоАЕА ЕлЬгаг)ев апс) бене Иепп)гсаг)оп МЕТНОО В)пве гЬе г)ване сн1шге р!агев оЕ ггапвЕесгес) С05-7 се1!в гЬгее !пиеа ъчЬЬ ке-соЫ РВ5 1ас1с1п8 са!сшш апс) ша8пеянш юпв. Кеер р1агев оп а Ьес! оЕ ке Ьегчгееп Ппвев. АсЫ 10 ги1 оЕ ке-со!8 РВ5 Го еасЬ р1асе. Р1асе йе р1асе оп йе Ьес) оЕ ке, апс! Веп11у всгаре гЬе се1!в оЕЕ йе р1аге.
Тгапврег гЬе се!1 внврепяопв го сЫ!!ес) 15-ш1 ро1увгугепе гнЬев. ТЬе ые оЕ ро1уяугепе гнЬев, счЬОсЬ аге ггапврагет, сч111 Еас1!Ьасе гесочегу оЕ сусор!аяп Егее оЕ ппс!ег гп 5герв 8 апс1 9. Кесочег гЬе се!1в Ьу сепсг16г8аг)оп а! 300с; (1200 грш 1и а 5огча!1 Н1000В гогог) Еог 8 пнпнгев а! 4 С.
)Зесапг ав пшсЬ оЕ гЬе внрегпагапс ав ровяЫе. Вешоче гЬе гевЫна1 внрегпагапг вч)гЬ а р)рене. Кевнврепс1 гЬе се!! Ре!1ег Егоиг 1 х 10в го 2 х 10в С05 се1!в ш 300 )г! оЕ ТКМ Ьнйег апс1 яоге гЬе внврепвюп оп ке Еог 5 пнпнгев. АсЫ 15 р1 оЕ 10% Тгиоп Х-100 ог 4% )ч)опЫег Р-40 апс1 вгоге йе се11 внврепяоп оп ке Еог а ЕнггЬег 5 шшнгев. АсЫпюп оЕ поп юшс с!егег8епг 8епг! у 1увев гЬе р1авгпа гпетЪгапе счЬ11е 1еач1п8 йе ппс! еаг тегпЪгапе шгасг. Весочег гЬе пнс!ег Ьу сепгг)Ен8аг)оп а! 500о (1500 гргп 1п а 5огча11 Н1000В го!ос) Еог 5 пппнсев а! 4 С. ТгапвЕег гЬе внрегпагапг го а сЫ1!ес! 1.5-ги1 писгоЕнВе шЬе.
4в !МРОЙТАЬ!Т СЗве ехггете саге ччЬеп гегпояп8 !Ье внрегпа!ап!. Оо по! гонсЬ йе пнс!еаг ре1- !ег. 8 гЬе пнс!еаг гпегпЬгапев Ьнгвг, гЬе вагпр!е и48 Ьесогпе гоо ч1всонв го р1репе с)не го йе сопгапппаВоп чч1!Ь 8епопос ОЪ!А. 10. АсЫ 20 !с! оЕ 5% Я.б апс) 300 )с1 оЕ РЬепо1. Уоггех йе инхсше ЫВогонв!у апс) верагаге ГЬе ог8ап)с апс! ас)неона РЬавев Ьу сепсг)Ен8аг)оп аг шахнпшп вреес) Еог 5 инпшев аг 4 С гп а шкгоЕн8е. ТгапвЕег гЬе ас)неона 1ауег го а 1.5-ги! писгой8е гнЬе санга)пш8 300 )с! оЕ РЬепоЬсЫогоЕопи. Чоггех йе внврепяоп ч)8огонв1у апс! 1Ьеп верагаге гЬе ог8ашс апс! ас!неона РЬавев Ьу сепгг)Ен8а!)оп аг шах)шнш вреес1 1ог 3 пппнгев аг гоош гегирегагнге ш а ш)сгоЕн8е. 12.
ТгапвЕег йе ас)неона !нррег) 1ауег го а сЬгПес1 1.5-ш! ш)сгоЕн8е гнЬе сои!а)ши8 12 )с! оЕ 5 М НаС! апс! 750 !г! оЕегЬапо1. А)!очч гЬе КЫА го ргесгриа!е Еог 2 — 3 Ьонгв а! — 20 С ог Еог 30 пппйев ас -80'С. Гвпс1е1с асЫв аге тоге вгаЫе ш ейапо! йап ш Н,О. Рог 1оп8-гепп яога8е, вгоге гЬе КЪ!А ш егЬапо1 аг — 80'С !р!саве вес йе ране! оп 5ТОКАСЕ ОЕ К!с!А ас йе епс! оЕ ргогосо! 1 гп СЬаргег 7). Кесочег ГЬе К)ч)А Ьу сепГП6лВасюп ас гпахнпшп вреес! Еог 10 пппнсев ас 4"С 1и а ш)сгоЕн8е. 14. 131всагс) гЬе внрегиагапс апс1 счавЬ гЬе ре11ег вч)гЬ 70% ейапо!.
!угу гЬе ре!1е! 1и а)г апс1 ген)вво1че и )и 20 !в1 оЕ ТвЕРС-ггеасес! Н О. Ргогого! Зг 5(аце вц Кечегзе Тгапзсг(ргазе-РСЯ 11.89 Яаце 4: Кечегье Тгапьспр$аье-РСР 1и (Ь|з з(а8е ог 1Ье ргогосо|, сТ))ь)А пю|еси)ез аге цепега1ег! (гопг йе К)ъ)А |зо)агеб гп 5(аце 3. Мо)еси!ез оу р5РТЗ-дег)чег) с):гЬ)А !ас)с|п8 8епопг|с Т))ъ)А вег)иепсез апг( йозе сопгагшп8 8епоппс 1Э)ъ)А зеъ)иепсез ЬагЬопп8 сгур(|с зр|ке в|(ей аге е))пг(па1ег) Ьу с($8езг|оп ъч)1Ь ВзгХ! (р)еаве зее р)8иге ! 1-18). ТЬе г)|8езг|оп ргог)исгз аге с)опег) гп1о а В)иезсг|рг чесгог (5(га1а8епе) го Тас|3|гаге |г(епг|()саг|оп оу йе ехоп-ггарреъ) ргог(исгз. Н)ЬА1а1 )п1гоп Вз1Х| Вз|Х| Ьай в|ге МСВ ЬаИ вйе ЗН40 ргопю1ег ро|у(А) в)цпа! вР!)Се зае Вз(Х| вйез 3' врйсе вае виЬс|опе цепопхс ггацгпеп1в ровз|Ые врйс|пц енеп1в А.
Оепогп(с |гадгпеп1 чп|1Ь по ехоп С. Оепогп)с 1гадгпепг ъчйп сгурпс врйсе в|1е сСЬ)А ргобисг ейпхпа1еб Ьу Вз1Х| б|цев1юп сСг|А ргобис1 ейгп|па1еб Ьу Вз)Х| б|цев1юп В. гзепогп)с гга9гпеп1 соп1а)п~пц ехоп ргорег врйс|пц оссигв; Вз(Х| вйе |п1еггир1еб Ьу ехоп ЕЗС()31Е 11-18 1|пеаг ТГ)еъч оТ $Ье М|п|цепе о1 р5РсЗ ТЬе 5740 ргогпогег зеоиепсе (зЬас(ег) Ьох) апг$ ро|у(А) абб(1(оп в)8па( (ореп Ьох) аге зЬоъчп аг е|1Ьег епбз о( йе ||пеаг зсЬегпе. (ВЬаг|ед раггегп) ъ)есгог-бег(чеб ехопз; (орел Ьох) (пггоп(с зециепсев; (паггоъч ореп Ьох) гпи|цр|е с|оп|п8 в(ге (МС5).
Ь)оге йе |пс|изюп о(Вз(Х) Ьа|(-з|гез аг йе чесгог зр)(се г$опог апг$ зр|ке ассергог в(1ез. ТЬгее роза(Ые зрйс)п8 с|аваев сап Ье г|егвеб (гогп 1Ыз ехрепгпеп(: (А) ТЬе Вепопнс (гацгпепг г|оез пог сопга|п ап )п(асг ехоп ог йе (гацгпепг ь с|опег| Ы йе ъчгоп8 опеп1а1юп; чес(ог-оп3у зр))с(п8 оссигв. ТЫз ргобис1 )з иггиа||у е!ип)пагеб Ьу Вз(Х| б(8езг(оп рпог го с|оп|п8 о(1Ье ргог|- ись. (В) ТЬе 8епоппс (гацгпеп1 соп1аез ап |п1ас1 ехоп, допеб |п (Ье ргорег опеп1ацоп; ргорег зр))с(п8 оссигз Ье(ъчееп 1Ье чес1ог вециепсез апб 1Ье ехоп вециепсез (оипб |и йе ВепогЫс 0$4А.
ТЬе Вз(Х! Ьа|В з)гез аге по1 гесопзг(ги1еб. (С) ТЬе Вепогп)с зег|иепсе соп1а3гь а сгурцс ар||се в(ге йа1 асцча1ез а сгурВс зрйсе з|(е (оипб |п 1Ье |п1гоп о( р5Р|ЗЬ |п 1Ыз сазе, |гпргорег зр()с)п8 оссигз Ье1ъчееп йе чес1ог зециепсез апг| йе Вепоппс Тгацгпепг. Ноъчечег, йь ргобис( ъч(3! гега|п а рогцоп оТ (Ье МС5. ТЬе МС5 ь Яап|ъег$ Ьу Вз(Х| в)гез, а()оъч)п8 йь ргобис1 (о Ье е|пгппа|ег| Ьу Вз(Х! гйцезцоп Ье(оге с|оп|п8. (Аг|ар1еб, ъч)(Ь реггп(зз(оп, (гого 0.М.
СЬигсЬ.) Ргогого! ге Всамое 4: Яечегье Тгапьсг!Ргаье-РСК 11.97 Ас!ЕЕ!1!опа! Веаееп15 51ер 74 оЕ йгь ргососо! гег)и!геь йе геадепсь l)ьсесЕ )и СЬарсег 7, Ргогосо! 25. Чес$ог5 апс! Васина! Яга!п5 Е. со6 ьсга)п ЕЗН5и Еог апогЬег ьсга)п йа1 регт)сь и-сотр)етепсапоп) рВ)иеьспрс П ЕК5 ог 5К) 151гасаВепе) МЕТНОО вкупе!се5!5 оЕ е!се с0)ь!А 1. Сепегасе сЬе 6гьс-пгап6 сЕ)ХА Егопс 1Ье сусор1аьш!с КХАь !ьо1асес) ш сЬе ргеспоиь асане (51аке 3), исаич сЬе 5А2 01!Копие!еосЫе аь а ргипег.
1п ап Ксчаье-Егее 0.5-гп1 сиЪе согпЬше: КЬ)А 3 и! 10х агпр66саиоп ЬиЕЕег 2.5 р! г))4ТР ьо1пооп аг 1.25 гпм 4 и! 0.1 М г)!СЬ!оСЬге!Со! си! 3' о!!Ко Е5А2, 20 Пм) 1.25 и! !)КРС-сгеа1ег1 Н,О 11.25 р! Неа1 сЬе геассюп пихсиге со 65'С Еог 5 пипшеь. ~ 1МРОКТАЬСТ То гег!исе Еоггпасюп оЕ ьесопг)агу ьсгис1игеь !п СЬе КМАь, г)о по1 р!асе йе геассюп ппх1иге оп !се! ТЬеп аг)й КХаье !пЕКЬ!сог си! Мо-М1У гечегье сгапьспрсаье 1200 оп!и) 1 П! 1псиЬа1е йе геасбопь Еог 90 иипигеь аС 42"С.
2. Уье ЪосЬ йе 5А2 о!!Копис1еос!Ве рппсег ап6 йе 5!36 01!Копие!еос!Ве ргипег со саггу ош а 1иппе6 ьесоп6-ьсгапд ьупсЬеь!ь. СошЬспе сЬе Ео11огппд !п а ьсеп1е 1Ь!п-ъча1!ег) агпр66сасюп шЬе: гечегье 1гапьспр1аье геасссоп Е5сер 1) 12.5 р) 1Ох агпр66саиоп ЬпЕЕег 4и! г)ЫТР ьоЬигоп аг 1.25 шМ бр! 5А2 о!сКоппс!еосгае рпгпег !20 рм) 2и! 5176 о!)Коппс!еоГЫе рппгег 120 ПМ) 2.5 Н! Та4 Е)НА ро1угпегаье 1 — 2 пг61ь ТСЕРС-сгеасед Н О со 40 и! Ргосем йе чессог-оп!у сопсго! !п сЬе ьагпе счау. ТЬ)ь сч!!! ьегче аь ап ппрогсапс сопсго! опппц сЬе РСК апа!уь!ь.
3. 1Е 1Ье йеппа1 сус1ег Ь пос Есссеб ьч)сЬ а Ьеасег1 1Ы, очег1ау йе геас6оп иихшгеь чг!1Ь ! г1гор (-50 р1) оЕ 1!КЬс пипега1 011. А1сегпапче1у, р1асе а Ъеаг) оЕ рагаЕ6п ьчах !псо сЬе сиЬе !Е испив а Ьос ьсагс РСК. Р1асе йе сиЬеь ш сЬе сЬегша! сус!ег.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
