Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 111
Текст из файла (страница 111)
4. Ашр)!Еу йе пис!ек аснЬ иь!пц 1Ье с1епасигасюп, аппеа1ша, апг1 ро)ушепха1юп сипеь апс1 1ешрегагигеь!РьСед гп йе СаЫе. 11.92 СЬаргег 11: Ргерагасюп и) гР)чА Е!Ьгаг!ег апгЕ Сене 1г(епсфгас!оп ТЬеае Пшеа аге ашсаЫе Гог 40-Н! геае6оиа аяешЫеВ !и сЫп-юаПег( 0.5-пг) снЬеа апг) !псн- Ьасег) (и йеппа) сус!ега а~еЬ аа сЬе Регпп-Е1шег 9600 ог 9700, Маасег Сус!ег (Еррепг(огу), апг( РТС 100 (М) ВеаеагсЬ Ь Т!шее апг1 сешрегаснгеа гиау пеегс со Ье аг(арсег) со ашс ойег суреа оЕ ег)н!Ршепс апг) геае6оп чо1шпеа. ТЬе рыроае оЕ сЫа РСП Ь со Вепегасе г)онЫе-а!ганг)ес( шасепа1 Гог ВсгХ! г)(Веас!оп.
ТЬгее-пнпнсе ехсепяопа аге оаег1 ш сЬ!а сшПа! РСВ со спсгеаае сЬе еГПксепеу оГ сарснге оГ 1опВег еРЬ)А ргогсось Ьип!сегс сусПОВ Вше Ь снег! со пншпнге сЬе роаяЬ!1Ьу оЕ Вепегас- !пВ РСВ апсЕасся Сопнпне со ргосея йе псасепа) ашр1ь6ес) Егогп СО5 сеПа сгапа(ессес) сч!ГЬ чешог РС4А а1оие (ЕнаВе 2). АсЫ 30 ншь оЕВзсХ1 со йе РСВя Очег1ау сЬе геасс!Оп ш!хснгеа сч!(Ь!!ПЬс пнпега! ос! (!Е нос а)геаг1у оп йе геаспоп) апг! !пснЬа(е СЬе ш!х(ига очаги!ВЬС аС 55"С. ВггХ1 6!Веас!ои Вгеас!у гебнееа чеесог-оЫу ар1!се ргог(исса апг) Еа!ае роянчеа Вепегасег) Ьу а сгур6с арПсе ясе чпсЫп сЬе чеесог си!гоп. ТЬе чессог РЬРЕЗ соиса(па аечега! егурск арПсе ясеа.
ТЬе псо!его!еа Вепегасед Ьу аЬеггаис арПе- (иВ ас сЬеае ясеа аге ВеиегаПу а пнпог сошропепс оЕ сЛе апср116ен ргоднеса, апг) ВепегаПу арреаг оп!у 0) !и йе геассюп снЬе сноса!п!пВ егпрсу чессог, (П) ш а геасбоп ш гчЫсЬ йе р5РЕЗ 1сЬгагу Ь оЕ роог цнаПсу, ог (ш) счЬеи сЬе Веиоппс Р)4А сопса(па ио ьапаспрь йас сап Ье Ыеп66ео сч(сЬ сЬса гпесЬой АЕЫ ап агЫнюпа1 20 пп!са оЕ Ва(Х! со сЬе РСП апг1 шс ОЬасе сЬе геаспоп Еог ап асЫнюпа1 2-3 Ьонл ас 55"С. МеапсчЬ!1е, ЙцеаС 1 НВ оЕ РВ5!!(К5 ог 5К) Со сошр1епоп сч!СЬ ВгоПХг. РОНГу йе Е)ЫА Ьу ехсгасс!Оп сч!й РЬепо! апс) ргес!Рнапоп сч!(Ь есЬапо!.
Г)!аао!че сЬе йцеасег1 Е)ИА сп Н,О ас а сопсепСгапоп оЕ 2 пП/Н1. ЕО1!осч!ОП: 5 — !Он( 4.5 н( 7.5 н1 2.5 н1 2.5 н) 10 — 20 ншь Со 45 Н) 1п апойег 0.5-гп1 ашр1сГЫасюп снЬе, пнх йе РВ51ИК5 ог 5К) йВеаСед сч!СЬ Егор57 (2 иц/Н1) 10х агпр1г6сасюп Ьн((ег г()4ТР ао1нгюп аг 1.25 гпМ В5Р-С.) оПВоинс1еоСЫе рпгпег (20 НМ) В5А-1) оПВопнс!еосЫе рпгнег (20 нм) Та9 РЫА ро1ушегаае Е(,О Ргерага1!оп оЕ йе с0)х)А апд Чес$ог аког С!оп!пд 1п а 0.5-ш1 аспр! ЕГЫасюп спЬе, пнх йе ВггХ1-г(!Веасег( ВТсРСВ (5сер 6) 10х апср!г6еанои Ьнйег 614ТР ао1нСюп аС 1.25 шМ 5АРР оПВопнс!еосЫе ргнпег (20 Нм) ВОРУ оПВоине)еосЫе рпшег (20 нм) Таг) РЬ)А ро1ушегаае НО Го!1очч!ОВ: 10 н1 10 н) 16 н( 5 н1 5 н1 2 — 4 шнЬ Со 100 Н) Ргососо! 3: 5(аде 4: Яечегле Тгаплсг(рсале-РСК 11.93 1О. 1Е 1Ье 1Ьеггпа! сус1ег Ы пос ллссес) лч)1Ь а Ьеасес) 1)с(, ол ег!ау йе геас6оп ппхсигеа (51ера 8 апс1 9) лч)1Ь 1 йор (-50 р1) оЕ)л8Ы пппега1 ол1. АЬегпасгче1у р)асе а Ъеас) оЕ рагаЕКлп игах шсо йе сиЪеа УЕ ияп8 а Ьосзсагс РСК.
Р1асе йе сиЬеа (и 1Ье йеппа1 сус1ег. 11. АшрНу 1Ье пис!ек ас)сЬ ияп8 йе с1епасигасюп, аппеа!ш8, апс1 ро1ушегыаКоп Ошеа апс1 сешрегасигеа 115(ее( ш 1Ье саЫе. ТЬеье г!юез аге лшгаЫе Еог геас6опл аыелпЫеЛ ш 1Ь)п-лча!!еЛ 0.5-ш! лслЬел апЛ )псиЬасес1 !п сЬеппа1 сус!егл юсЬ ал сЬе Рег)с!и-В)шег 9000 ог 9700, Малгег Сус!ег (ЕррепЛогЕ), апс1 РТС 100 (М! КевеагсЬ). Терпел апд гегпрегагигел тау пееЛ го Ье аЛарсеЛ ло лшс ойег лурел оЕ е9и!Ршепс. ТЬе 5' епс)л оЕ гЬе ргипегл ыеЛ !п 1Ье лесоиЛ гоипЛ оЕ РСК агпр1л6са6ои сопгаш Л(УТР гасЬег йап ЛТТР. ТЫл Еасл!!гагел !)Ваг)оп-!пЛерепЛепг с1оп!п8 (ВалйсЫап 1995).
ТЬе 5' епдл оЕ В5Р-Р апЛ В5А-(У аге солпр!етепсагу го ЕЬе 5' епЛл оЕ 5АРР апЛ 5РР(У. !с 'ы Ьея со регЕопп гЬе игасл1 РУЛА 8!усолу!але геасгюп (5гер 15) йе лагпе Лау ак йе ашр6- 6сагюп. УЕ 1ЬЬ )ь пог роялЫе, рипЕу лЬе аплр!гбсагюп геасгюпл Ьу ехсгасгюп лч!й РЬепоЬсЫогоЕогпл, Ео!!оъчеЛ Ьу егЬапо1 ргеслриалюп, апЛ згоге сЬепл ас — 20'С ипг6 геаЛу Еог ые. ТЬе Л(У-ашр66еЛ чеслог (5гер 9) сап Ъе ысогед Еог лечега1 лчее)сл аг — 20'С. 12. Кип ап а1н)иос оЕ йе РСК оп а 1.5% а8агоае Ке! ш ТВК со аааеаа йе срла1Ку оЕ йе геассюп. ТЬеге аЬои1с) Ъе а япеаг гергеаепс)п6 ьечега! ашр1)глсал(оп ргос)исса (Р18иге 11-19). я о .о Р!СРКЕ 11-19 КергеьепсаОоп оЕ а Се) Региопа1га1!п8 РоаяЫе Ргос)исса 5ееп айег Асор))Е)еал!оп оЕ 1Ье Ехоп-1гарред Ргодис)а иалЬ 5АР(У апс) 500(У, ЬеЕоге С1оп)и Агпрй!са1юи о( иопгесоспЬ!пап1 р5рсЗ 'ь 56олчп !и йе п8Ы-Ьапс( !апе (чес1ог оп!у).
ТЬе !оиеа1 Ьапс) гергевепй 6ле чес1ог-ои!у ьрбсе ргос)ис1, счЬегеаа 1Ье ойег ичо ЬапсЬ аге Лейче6 Угаси абс66опа! сгур6с ьрбсе а!1еа !п йе чессог. ТЬе ойег 6лгее !аиеа (ВЬгагу 1, 2, 3) аЬолч гергеаеп1а6опа о( йгее сур!са! агпр66- са1юп геас1юпя ТЬе чессог-ои!у Ьаис( (а ргеаепс !и аИ ойег 1апеь, Ьис 6 'ь гес)исес) !и !плепясу, (Ас!арлед, лч!1Ь реггп!аа!оп, Егопл Р.М. СЬигсЬ.) Ргогосо! 3: 5/аде 5: Апа!уг!з о/' С!опт !Е95 СТАСЕ 5: Апа!уыил о1 С1опеь ТЬе Епа1 яа8е оу йга ргогосо1 оиг1шеа а ьггаге8у Тог йе 1п)г/а! апа1уяа оу агпр116ед апс1 ехопСгаррес1 ргодисГь (ЕТРа).
Ву апгр!/уу/п8 ГЬе ЕТРа гч)ГЬ ГЬе — 20 апе1 КЕЧ рдпгегз ог" РВВП, ргопюгега /ог Ьассег)орЬа8еь Т3 апд Т7 гепга)п 1пгасг. ТЬе ашр11сопа сап гЬегегоге Ъе вес)иепсед цяп8 о118опис!еогЫе ргппега согпр!епгепгагу го гЬе ргошогег ае9иепсея Вег)иепсе апа!уяа апс1 сошраг)ьоп го риЫ)с с1агаЬааеа ге!11 а!1ои с!шс1с е11пипаг/оп оГ с!опеа дег/чед !гош ар!к/п8 агйеасп йаг еьсаред Вг/Х! д18еаг)оп. Вес/пепси огЬег йап аигЬепгк ехопа йаг сап Ье саргцгед гп гЬра ауагегп, ацсЬ аь йе А!и, галие, апс! НЕИ ' гере!)г/че е!егпепгя сап Ье Ыеппйег1 Ьу согпраг/п8 гЬе ЕТР аег!иепсеа гч)гЬ гЬоае гп риЫгс е1агаЪааея 1п ас)д/гюп, сопгапппабоп оГ йе 8епош/с РХА гч/гЬ РЫА ггош Е.
соВ ог уеая сап Ье геай)у Ыеппйед Ьу аег!иепсе апа1уяя аа гЬе 8епошеа оу ЬогЬ ог8апыпа Ьаче Ъееп атее)цепсег! согпр!еге1у. Опсе Та!ье рояпчеа Ьаче Ьееп е1ип)па!ей ТцггЬег апа!уяа га гес)шгее) оу йе гес!исес! ЕТР ьег. А сНЕса1 8оа! 1а го с1егегпипе йе гпар !оса!)опа ог'гЬе ЕТРя 1Т ап ЕТР Та/!а го пгар со а ге8)оп оу 1пгегезг, и шау Ье Ьесацае йе ог)8!па! РЬ/А ъчаа сЬггпепс ог Ъесаиае сЬ|пгегаь Гогпгее) диг/п8 ашр11Всагюп. Айег йе 1п)г/а1 апа1уяа Ьаа Ъееп реггогшее! апе! а шшппа1 яег ог' ЕТРз Ьаз Ъееп ча1Ыасей гЬеье геа8епга Ьесоше Ыеа! яагпп8 гпагепа!в гог огЬег апа!умея гпс1ийп8 погйегп ЬуЬгЫ/галоп, КЫаае ргоГеспоп, апс1 ш яГи ЬуЪг/д/гаГюп !СЬигсЬ еГ а1. 1993; Р.М. СЬигсЬ еГ а1., цприЬ.). ЕТРа аге а!ао гЬе агагг/п8 ро)пг /ог йе Ыепг/Есаг/оп ог гц!1-1еп87Ь КЫАя ТЬеу сап Ье цаед го ргоЬе сРЬ/А 11Ьгаг/еь (СЬигсЬ ег а!.
1993), ог о118опис1еог)де рг/шега сап Ье ьупгЬеягед ггош йегг аес)иепсеа апд цаед ш ойег ргогосо)я ьисЬ аь гарЫ агпр!гпсагюп оу сР/чА епе)ь !КАСЕ; р1еаае атее СЬарсег 8, Ргогосо!ь 9 апд 10), ог РСК-Ьааес$ сРЬ/А ьсгееп/п8 (РгоЬгпап 1993; Мипгое ег а!. 1995). МАТЕВ!А15 Вооег8 апг! ЯоМ1оп8 р!еаье атее Аррепг)/х 7 !ог сошропепга о! а!ос!» ьо!игюпя Ьийегя апд геадепгя 011иГе ь/ос)с ао!ипопь !о йе арргорпа/е сопсеп/гаоопя 70х Атр//!!са/!оп Ьи!/ег Епгупге8 апг! Во1гег8 Таг! Р/чА риlутегаье Се!8 АВагоае Ве! !7 5%! сааг /л ТАЕ Ьи/Тег Р!еаье атее пер 7. Ь)ос!е1с АсЫь апс1 О! коппс!ео641еь д/ЧТР ао!иг!оп сопга!п7п8 аП /оиг д14ТРя еасЬ аг 7.25 т/а /хоп-ггарред ргодис/а с/опед т/о а рВ511 чес1ог С!опее аге 1п ГЬе !опп оГгесогпЬ!папе РН5о со1ошее ргерагее/ ш 5га8е 4.
11.100 СЬаргет 11: РгератаНоп аусРИА ЕлЬтат!ег апй Селе Иепг!7)саг!оп 5(аее 2). 11 !8 асЬ !ааЫе го зе!есг сРХА ргос!исга (Ьа( аге аг !еам 500 Ьр ш !елей(Ь Ьу е!йег со1шпп сЬгошагоагарЬу ог ае! е!есСгорЬогеяя, ЬеГоге адйпа 1ш1сепи ТЬе 1ш1сег саааег(еа соп(агп а 2-Ьр очегЬапа ас йе 3' епс1, гчЬ!сЬ Гогсез ГЬе саааегге !о Ъе 1(ааСес! гп оп1у опе опепгаНоп апс) а!80 ргечепга йе Гоппа(юп оЕ 1агае о!!аошега оГ гЬе саааегге. Р!гесг ае1есНопа аге оЕ(еп регГогтес! нч!й ши!1!р1ехед СОХА роо18 Егот ьечега! йЕЕегепг г!ааиеь. ТЬеье сап Ье ашр1)6ег( яерагаге1у Ъу РСК апс! с1опес) аЕ(ег йе гнчо гоипс(а оЕ ае!есг!оп аге сошр!егер (5(пппопа ег а1. 1995). ТЬ!8 ргогосо! с(еасг!Ъеа йгесг ае!есг!оп оЕ сРХА8 сошр1ешепгагу со а 500-1сЬ Ьшпап аепогп!с РХА сопг!а с1опес! гп а ВАС чес1ог, Ъиг Ь сап Ье ас)аргес! го апу а!ае оЕ аепош!с 1агаег. ТЬе сРХА гюигсе Еог !Ье ехагпр1е та галс)огп-рг!шес! сРХА, гчЬ!сЬ !а 1!аагес1 го ап ашр1!6саг!оп саааегге.
1Г а сРХА 1!Ьгагу !а ияес) !па(еас! оГ ргипагу сРХА, (Ьеп несгог рг!шега Еог РСК шия( Ье аиЬаг!гигес! !п гЬеае агеря. 11 !8 ппроггапг го сЬапае 1Ье ге!арче гаг!оа оЕ с1опес1 аепоппс РХА го сРХА аа гЬе гога1 1епагЬ оЕ 1Ье сои!!Е( сЬапаеа апс1 со геса1си1аге 1Ье Саги, оЕ (Ье геасгюп иа!па а11 оГ йе пис!ек ас!г) согпропепгз 1Ьаг аге ас!пес) го (Ье пах!иге.
МАТЕВЕАЕЬ СА()Т1ОХ: Р1еаае аее Аррепйх 12 Еог арргорПа1е Ьапг!1!пе оЕ гпа1епа!а шагЬегЕ аи1Ь <!>. ВНЕЕегь ап(Е Ьо!НЕ1оп8 апг! геаееп18. Р1еаае аее Аррепйх 7 Еог сошропеп18 оЕ 8(осЬ ао!01!ила, ЬиЕЕега, ОЛи1е 8(ос!с 801011008 1о 1Ье арргорПа1е сопсеп1га11опа. 70х Атр!ГГ(саг(оп ЬиГГег 1пс!ис(е 0.0)а (чг)ч) 8е1аип (п ГЬе Ьо(Еег. АТР (70 гпМ) 2х НуЬг(г)!ха!(оп ао!ипоп 1.5 М ЫаС! 40 пгм Гса рЬоарЬате Ьи((ег (рН 7.2) 10 пгм Е()ТА (рН 8.0) 10Х ЕгепЬагс(1'а ао1шюп 0.2ап 5Р5 Ь)аОН (0,7 м) <!> 70х НГс)с (галь!а(7оп ЬиГГег 500 п1м Тпа-НС! (рН 7.5) 100 гом МЕС1 50 п1м йгаюгЬге!го1 5О5 (70%) 20х 55С 5(гер(ан(г)(п Ьеас(-Ь)пс()лВ Ьипег !О пгм Тги-НС! (РН 7.5) 1 гам ЕОТА (рН 8.0) 1 М ХаС( Тг(ь-НС! (7 м, рН 7.5) Епкугпе8 апд ВНЕЕегь ОНА ро!утегаае)Омам ! (5 ил!78)и); ВоеЬг!пВег МаплЬе!т) Кехгпсбоп еле)опис!еааеь Т4 ОА)А !)Вахе ТЬегтоя(аЬ!е ОА(А ро!утегаье Се!8 АВагоае деЬ (7%) саьг )и 0.5х ТВЕ Р!саае зее 5гера 18, 19, 24, апс( 25.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
