Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 109
Текст из файла (страница 109)
!Е ЕЬе гесотпЬгпапс диез пот епсоторая тЬе епдге сод!о5 ге5!ов оЕ йе сР!чА, адйт1опа! гесопт- Ь!пап!а ьЬоо!д Ье Ьо!атед Ьу зсгееп!п5 тЬе сРт!А !тЬгагу Ьу ЬуЬпйгадоп ас Ь!5Ь тгт!п5еосу, иа!п5 сРЬЕА Ьо1атед Еготп ЕЬе Его Ьо!ате аз а ргоЪе. Рго1осо! 3 Ехоп Тгарр~пц апд Агпр! Йса6юп Реаппа М. СЬигсЬ ЛЕаг(опа1 Етг(|и1еи оЕ НеаИЕ|, ВеЕЕ|ехгЕа, Магу1апгЕ Е хон лмеияслтюн хегест5 еох тнг Рхгхенсг ог гинстюнлг ар!ке г)опог апс! ассер|ог а(геа чбй|п а ЕгаКшепг оЕ цепоппс РЪ)А. ТЬ!ь ргосея Ьаь Ьееп иаес) аиссеааЕи11у |ч(гЬ аепош)с РЫА Егош а чапе|у оЕ ьоигсея )пс!ийпд сояпЫЬ Ьас|епа! аг6Е|си1 сЬгошоюшея уеаьг аг66с!а! сЬгопюяошея ап|1 со|а1 депош!с РЫА (Ыог|Ь е| а!.
1993; СЬигсЬ е| а1. 1994). Ап ипЕогеьееп 61ЕКси1|у чч!ЕЬ гЬе ог!е)па! чес|ог (р5Р1.1) иаег! Еог ехоп ашр!|Кса|юп )а гЬе ргос)ис6оп оЕ ап ипассер|аЫе 1ече1 оЕ а раг|ки!аг шКЫА агбрас| йа| оссигь 6ие |о |Ье ргеяепсе оЕ а сгур6с ьр1)се я|е чч)гЬ(п |Ье (и!гоп оЕ |Ье чес|ог. ТЬгее а|Ы||юпа! РгоЫешь апре аь а геы1| оЕ |Ье ые оЕ РВР11 апс! |Ье сиггеп| ехрепгпеп|а! с(еяцп. Р(ганг, |Ье ша)оп|у оЕ депош(с ЕгаВшепга с1опе|1 шсо йе чес|ог с)о пог соп|аш ап ехоп; |Ьы, |Ье |па)ог ар1ке ргодисг ъч111 Ье ап егпр|у чес|ог.
5есопй геыпс|юп епхугпеь ые|1 Еог 11Ьгагу ргог!ис6оп сап ш|еггир| |Ье вес)иепсе оЕ ап ехоп, |Ьы ргечепг!па ог |п|егЕеппц чбй ар!к)пц. ТЬ|г|1, ггапьсг)рг!оп ип)га сопяягше оЕ 1еаа |Ьап |Ьгее ехопь ч611 по| Ъе Ыепбйей |п |Ь(а хсЬеп|е. ТЬе ые оЕ ап ппргоче|1 чес|ог, р5РЪ3, агпе1югагеь ог е1)ш!пагеа |Ье Еггаг |Ьгее оЕ |Ьеье ргоЫешя Ногчечег, ггапьсг(рг(оп ипКь сопяа6пц оЕ1еха йап йгее ехопа пшя аг!11 Ье Ыеп66е6 ияпц а1|егпа6че шеГЬосЬ (СЬигсЬ е| а1. 1993; СЬигсЬ ап|1 Вис1|!ег 1999).
ТЬе |пс)ыюп оЕ Вз|Х! ягеа |ч)гЬ!и йе гпи16Р1е с!оп)пи я|е оЕ|Ье чес|ог (Р(Виге 11-16) а11оъча Еог |Ье е1|пппа|юп оЕ шок! оЕ|Ье сгур|к ьр1(се рго|1ис|я ТЬе ргеьепсе оЕ а пш16р!е с!оп!пи яге ехрапсЬ йе сЬо!сея оЕ г)!ЕЕегепг епхугпея |Ьа| гпау Ье ые|1 Еог 11Ьгагу с)еяцп, йы гес)ис!па йе 1|Ке!|Ьоо|1 оЕ си|6пВ |ч)гЬш ап ехоп. Р!па!1у, |о е1ип(па|е |Ье чес|ог-оп!у яр!!се рго|1ис|, Вз|Х! Ьа)уягеь по|ч Кап)с йе чес|ог ьр1ке я|ея Чесгог-оп!у ьр!к)пц |ч|!1 гесопь6|иге гЬ(а геяпсбоп яге, ап|1 аиЪзе|)иепг 6!аеьг!оп чч)гЬ Ва|Х! гч!1! гбг|иа1!у е!пп(па|е |Ь(я ргодисс (Р)риге 11-16).
Но|чечег, Ъесаиье |Ье рго|осо1 )пчо1чеь РСК акр!!Егсагюп оЕ ьр1кег! депе рго|1ис|я апу пю!еси1еь йа| геьи1г Егош аЪеггапг ьр!(с!пц ччК! Ье ашр!16е6 апс) соп|пЬше |о |Ье Ъас)сцгоипй ТЬ!ь рго|осо) ргезепй а гпегЬод |о агпрВЕу ехопя иа(пК |Ье шапипа!(ап ьЬигг!е чес|ог р5РЪ3, ап|1 )а с!!чЫес) !псо Вче аадеа аь 1!агег( Ъе1о|ч (р!еаае атее Р(аиге 11-15). ° 5гаае 1: Сопьггисг(оп оЕ йе НЬгагу ° 5|аае 2: Е1ессгорогагюп оЕ йе 1(Ъгагу |п|о С05-7 Се!1ь ° 5|аде 3: Нагчеь|!пК |Ье гпКЪ)А ° 5|аВе 4| Кечегъе Тгапьспр|аье — РСК ° 5гаце 5: Апа!уыил оЕ С1опеь 11.
79 11.80 СЬаргег11: Ргерага11ап о1'сР1'1А й1Ьгаг1ез аий бене 1йепгфсаг1оп НС0КЕ 11-15 Г!огееЬагг о11Ье Ех егЬпеп1а! Яе е!и Ехоп Агп Нка6оп (Ас3аргед, ъи1Ь реггпььюп, ггогп 0.М. СЬигсЬ.) 17.82 СЬарГег! 74 Ргерагаггоп о7 с727НА йгБгаггез апй Бепе Тдепг|(гсаггоп ан4о р Е!С1)ГГЕ 11-7 6 5РГЗ ТЬе ВН40 ргопсо1ег дг(неь ГЬе 1гапаспрбоп о( а Ьесего)опоиа т(п)Вепе. Тио ехопа аге |п1еггир1ед Ьу ап (о(гоп дег(нед (гогп ГЬе Н|Н Гас пепе. А ти)1(р(е с(оп(па а(се (МС5) Ьаа Ьееп (паегсед )псо 1Ье п|1гоп.
ТЬе нес|ог саге(еа ГЬе 5Н40 ргогпо1ег апд ГЬе ог(а(па о( гер||садоп Ггогп р()С (р(7С оп) апд Ггопс 5Н40 (5Н40 оп). Ап еп(агаед иеи о1 1Ье МС5 генеа)а роаа|Ые с(оп(па а)сеа (ог ||Ьгагу сопасгис()оп. ТЬе ргеаепсе о( ЬаИ айеа о( ВаГХ! (ВаГХ! [772]) десгеааеа ГЬе Ьас(спгоипд (гот с|опед аес(иепсеа 1Ьас до пос сои(а(п ехопа. Ап ехрапдед н|еи о( ГЬе т(п(пепе нд1Ып р5РГЗ )а аЬосэп |и Пдиге 7 7-78. (Адарсед, и41Ь реггп(аа(оп, (госп (З.М. СЬигсЬ.) Мео!а ГВ аеаг р)а(ей сопга|п(пВ 50 рот( атрю(7|п Р|еаае аее 5гер 8 Со дегегпппе ГЬе арргорпаге яге р|аСеа Со пае.
ГВ ЬгоГЬ соп(а(п(пд 50 РВут) атр|сг()гп 5ОС гпесИигп прес!а! ЕГ!ГГ!ргпеп1 ИГагег ЬаГЬа ргеаеГ Го 75 С апд 65 С АГ!Г!!6опа! Кеаееп$5 51ер 7 оу ГЫа рго1осо! гег(шгеь ГЬе геадеп(а 7|а(ес( |и СЬаргег 7, Рго1осо( 20. 51ер 6 оу ГЫа ргогосо( гег)иггеа ГЬе геаВеп(а гег(и|гес( Гог Ггапауогта((оп 7(агег( т СЬаргег 7, Рго1осо! 23, 24, ог 25.
51ерь 70 апс( 72 оК ГЬ(а ргогосо( гег)и|ге ГЬе геаВепса Ггагед т СЬар1ег 7, Рго(оси| 7 ог 9. Чес1ог5 апГ! Вас!ег!а! Юга!п5 Е. со|с ьгга(п НВ707, сотре1еп1 Тог (сапа(огтаг(оп Ргераге аа деасг(Ьед ш СЬарсег ), Ргососо|а 23, 24, ог 25. р5РГЗ ТЬе неесог РЗР13 ы анас|аЫе верагасе|у ог аа рагс оу а )с(с Тгогп 1(Ее ТесЬпо)о5|еа. Ртотосо! 3: 5саче 1: Сонзстист(оп оЕ йе ЕЕЬтату 11.83 МЕТНО0 1. Р18езс р5РЕЗ чч(сЬ а гекспсбоп ептуше(з) сЬас ъч111 репин (пкегдоп оЕ сЬе Вепош(с РХА (Гог сЬе шар оЕ сЬе р5Р1.3 пш!6р!е с!оп(пц ясе, р1еаке кее Р18иге 11-16). РерЬозрЬогу1асе йе епсЬ оЕ сЬе !исеагсхес1 чессог, апд рипЕу сЬе чессог Ьу Ве! е!ессгорЬогеяк.
сс Ь ннротсанс ЕЬас сЬе чессот РЫА Ье сотар!есе!у й8еяед лпсо а з!н8(е Ета8шенс оЕ -6 СсЪ. 2. Р18екс 1 — 2 р8 оГ Вепопис РХА ог гесосиЬспапс чессог саггу(п8 Вепоси(с саг8ес РМА ядсЬ а гекспсдоп ептуше(к) сЬас ь сошраЬЫе сч)сЬ йе епхупсе икес1 со ргераге р5РЕЗ си 5сер 1.
3. Апа1ухе !096 оЕ сЬе йцексед Вепопис РХА оп а 0.996 а8агозе Ве! сакс апд тип ш ТАЕ. ТЬе Венош(с РЬСА зЬон!д Ье сошр1есе1у с68езсед анд инде8гадед. СЧЬен ехашлн(п8 сЬе Веношсс Р)СА лн йе а8агозе Вес, аЬо соо)с Еот сЬе ртезепсе оЕ сопсанниадп8 Ьассепа! (от уеая) РЬСА, лчЫсЬ ч611 арреаг аз а Венета)!лед Ьаге (и сЬе Ъас(с8гоипд. 4. 1пасстчасе сЬе гексгтсдоп епхуше Ггош сЬе йВеяес1 Вепопис РХА Ьу Ьеадпд сЬе геасдоп пнхсиге со 65"С Гог 15 пиписез.
Ехсгасс йе геасдоп пихсиге сч)сЬ РЬепоЬсЫого(отти апд гесочег сЬе РХА Ьу ксапдагд ейапо1 ргессрЬасюп. Кезикрепд сЬе РХА ас а сопсепсгасюп оГ 100 рВ!гп! сп ТЕ (РН 8.0). 5. Е18ате йе Вепош(с РХА Со СЬе честог Ьу сош16п(п8 СЬе Г01!очт(п8с й8еяед Веноннс РХА 150 н8 д!Везсед, дерЬозр!шту!асед р5р!.5 чессог 50 н8 СОх !!ВаИоп ЪиЕЕег ! и! Ъастет!орЬаце Т4 РсзА !!Вазе 10 5уе!зз иши Н,О Со!0 и! 1псиЬасе сЬе геас6оп пнхшге Гог 2-3 Ьоигз ас гоош сепсрегасиге ог очегшВЬс ас ! 5'С.
АдсВп8 АТР аз а сотнропенс оЕ йе (Ох !с8адон ЪиЕ6:т \еачез лноге чосинле Сот чессог ог Гоге(8н Р)сА лп сЬе теассшп ннхсиге. !Е из!н8 а сонннегс!а! !!Вазе ЬиЕЬш сЬас сонса(нз АТР, с!ле адд!!!оп оЕ АТР Ь по !он8ег ге9и)гед. Ве ките со шс!иде а сопсто! синга!н!нц он!у сЬе чессог РХА.
ТЬЬ сонсго! Ь инропанс Еог аяея!н8 йе срла!Ьу оЕ йе !!Ьтагу. 6. Ттаикуопи 40 р1 оГ сошресепс НВ!О! се1!к сч(сЬ сЬе 118адоп геассюп. Ве ялте со (нс!иде рояиче (чессог а1опе РЫА) апд пе8адче (по РЕЗА) стапзсотшас!оп сонстоЬ со апет еЕ6ссепсу. ~ (МРОКТАЬСТ и !к )шретат(че йат НВСОС Ье икед Со ртора8ате СЬе БЬтату апд йе честит, Ьесаике р5р! 3 !к ипксаЫе (и ойет Ьассепа! ксташк (СЬитсЬ апд Вис!с!ет 1 999). 7. АЕсег сгапкЕоппадоп, адд 800 р! оЕ 5ОС шейши со сЬе се!1к апс1 (псиЬасе сЬе си1сиге Еог 30 — 45 пипшек ас 37'С со а1!осч ехргекяоп оЕ сЬе апВЬюВс геяксапсе аспас!сег епсодед оп йе р1аяп!д.
В. АгпрИу СЬе 1сЬгагу Ьу Вгочч(ЬВ йе ЬасСепа очепнВЬС аС 37"С (и йе ргекепсе оГ ашр(с!11(п. 1~из!пц а з!н81е созт!дг Р1асе 100 р1 оГ йе сгапкЕоппадоп пихсше опто ап ЕВ а8аг р1асе сои!а(шп8 50 )сфп! ашрсс(11ш. Сгосч СЬе геша(идет оГ йе СгапзЕоггпадоп ш а 2-ш! 1(с)исд си1- сите оГ 1.В ЬгосЬ сои!а(п(пВ 50 р8/гп! ашр(с(11)п. бголчсЬ оп йе янаП ЬВ р!асе а!!очлз йе станзЕоппадои ербслепсу со Ье аыеяес!. ЕЕ из!пд а ВАС, РАС, от роо!з оЕ созт(дз: Р!асе сЬе епссте сопсепсз оГ йе сгапкГоппасюп опто керагасе 150-пнп 1.В а8аг р1асек соп(а(п)пВ 50 рВ(ш! ашрссс!Вп. Р!ас(н8 сЬезе сонлр!ех!(Ьгапез он )50-тнтн р1асез Ье!рз е!итипаге сЬе ртесетепда! ВголчсЬ оЕ сетсаш с!опез Ьу гедислн8 сотнредсюн Еог ншпень, с!лы а11оччщ8 Еот сЬе сопзстиссюи оЕ а плоте тергезепсадче !лЪгагу.
11.84 СЬаргег 11: Ргера галоп о1 еРл ЕА РЬгаиел апд Сепе Едепсфгаг(олг 9. Васипасе йе ейк!епсу оЕ ПВасюп Ъу соп|радп8 сЬе пшпЬег оЕ гесошЪ|папс апд попгесошЬ~пап| с!опек (!.е., со!оп!ех адяпд Егош йе Сгапхуогпсаг!оп оЕ НВ!О! лч!СЬ СЬе 1фаг!оп пихсиге сопса!п(па оп!у р5Р1.3). ТЬе гесошЪ|папс есопел аьои)д Ье апуччьеге |топ| 500-Ео!д со |000-Ео1д ш ехсея оЕ |Ье попгесошьшапс с)опоя 10. 1Е йе ПЬгагу снах ашр!Бед оп а 150-пип ЕВ араг р1асе, ргосее|1 со 5(ер 11. 1Е йе цепошк ПЬгагу |чаи ашрППе|1 ш 1и!шд си! Сиге, рипЕу р1аяпЫ РХА Егош йе Ьас|епа ияп8 а хгапдагд аПса!ше !уяа ргоседиге (р!еаае хее СЬарсег 1, Ргососо1 1) ог иле а сопипегс!а1 р!аяпЫ риПВеасюп Ыс.
Ргосеед со 5сер !3. 12. РипЕу сЬе р1аяпЫ РМА иа!пц а п|огППсадоп оЕ йе хсапдагд аПсаПпе 1уяа пип|ргерагасюп: сдр1е сЬе агпоипса о( АПгаПпе !уяа ао1иПопа 1 (300 р!), 11 (б00 )|1), апд П! (450 )|1) а|Ыед со йе Ьасседа1 реПес. То яп|рИу йе ргоседиге, ау(ел а|1гПдоп оЕАП|аЬпе 1ух!а хо!одоп 1, сгапя Еег йе Ъасседа1 а1иаЬ со а 2-ш1 пс!его(ице сиЬе.
ТЬе геас оЕ сЬе ргоседиге сап Ье сагпед оис !п 2-ш! сиЬея АЕсег адд!пи АП|аПпе 1уях |ю1шюп Ш ап|1 сепсг!Еирпц, гПчЫе йе гесочегед, сгиде пис1ек асЫ аирегпасапс |псо с|но !.5-ш1 сиЬея Вхсгасс сЬе гехи!дпц аирегпасапс сч!(Ь рЬепо!:срдого(огш ап|1 лч!(Ь сЫогоуогш. Ргес|р|сасе йе ялрегпасапс лч!(Ь !хоргорапо! ап|1 со|пЪ|пе йе ичо д!ахо!нед РИА реПеик А)сегпас!че!у, иае а сопппегс(а! р!аяпЫ ридйеасюп ЫС (СЬарСег 1, Рго|осо1 9). 13. Р!Вехс ап аПг(иос оЕ сЬе риНВед РХА лч!(Ь РчиП со десегпппе йе л)иаП(у оЕ |Ье ПЬгагу.
Рчи|С я(ел Паь)с йе пш!др!е е)ишь лпе ш йе чессог. ТЬе д(аеас)оп оЕ еи|рсу чеесог |чиЬ Рчи!1 ргодисел 4-1|Ь апд 2-КЪ Ъаьдя Песо|и!Пьапс с!опел аьоиЫ |ПП ргодисе а ргоппьепс 4-КЪ Ьапй Ъис!ис!е ог по 2-КЬ Ьапй А с)еаг!у ч(яЫе 2-КЬ Ьапд ли55елса |Ьа| йе ПЬгагу и оЕ роог |СиаПсу ог, !ея ргоьаЫу, сьас а 2-1|Ь Рчи(! Егацшепс Ь Ь(аЫу гергелеп|ед (и сье депош(е Р)4А (р(аиге с с-с 7). !Е |Ье ПЬгагу Ь оЕ аееерсаЫе л)иаПсу, П «ап Ье цлед Еог сЬе пехс лса5е.
и лл о о о Ю Ю лл о о а а ко РЕСС)КЕ 11-17 Кергеаепгаг!оп оЕ а Сес Оеп|опа|гаПп Соод ЕСЬгаг Сопаггиег!оп Р|и(! Й8ехсюп о( йе ПЬгагу сопасгиссед (и р5РЕЗ (х а 8оод )пд)сасог о( |Ье л)иаП(у оЕ |Ье ПЬгагу. (сапе |) РчиП д(8еас о( р5РЕЗ; поле йе 2-)|Ь апд 4-(|Ь Ьапдя (сапе 2) Ехагпр)е оЕ а роог ПЬгагу; посе йе асгоп8 2-)гЬ Ьап|1, (ойсадпц а хиьасапПа) чессог ге08ас(оп. (сапе 3) Ехагпр!е о( а 8оог! ПЬгагу; пасе |Ье гедиссюп )и йе агпоипс о( сЬе 2-)|Ь Ьапд, апд йе )аг8е пип|Ьег о( Ега8гпепга ге!еааед Ьу СЬе РчиП д(цехгюп. (Адар|ед, ъчПЬ регт)хлюп, (гоп| ЕЛ. ЧС. СЬигсЬ.) 11. !Е йе епПге ПЬгагу |наа р1агед оп|о а !агре ЕВ а8аг р1а|е, Поод йе р!а|е лн!СЬ!О гп) оЕ ЕВ Ъгой, апд цепс!у легаре йе со!оп(ез Его|п йе хиг(асе оЕ йе аааг. М!ппп!хе йе апюипс оЕ а8аг сЬас !а асгаред |псо йе ЬВ ЪгосЬ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
