Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 85
Текст из файла (страница 85)
Носеелгег, (п ргасИсе, Геъч ргоЬ(епсн апае, регЬарн Ьесаияе СЬе "гс)гсу" епг1 о( ИЬе соосЬр(с)г иниаИу ссоеь пос согпе )псо сопгасг ъмСЬ ГЬе плес)(ипс. ТЬЫ псесЬогс гпау Ье инесс сеЬеп р(с(г(пд р)апиен ИсаС чг(33 Ье инес( 'нппзесИа(е)у (е.е., Со непегаге Сесар)аген Гог нег)иепс)пе), ЬиС И ь пог гесопмпепг(- ес( и Ьеп р)с(г(пц р(аг(иеь ГЬас чнИ Ье нсогег( Гог (опе репосЬ о( с(псе ог сЬас и !31 Ье инесс со гпа)се гпансег нсос(гн о( ча)иаЬ(е гесогпЬспапы. ° АиасЬ а нсегс)е 50-н! е(асс сар(Иагу сиЬе со а псои(Ь р)репе р)иеИес) сс43Ь со(!оп. Соге сЬе р3ас!ие ъисЬ ГЬе сар(3(агу сиЬе апс) иве Иенс)е нисИоп со с)35)ос)ее ИЬе р(ие сопсап(пд сЬе р)агсие Иопс (Ье р)асе.
Ехре! (Ье соге !пса ГЬе а)крлос о( 2х уТ гпегс!ипз спаса(п)пе Ьассег(а. ТгапаЕег СЬе си!Сиге Со а н(ег!1е гп!сгоЕиИе СиЬе апс( сепгг(ЕиИе аг шах!пшпс ареес( Еог 5 пиписеь ас гоогп сегпрегасиге. ТгапнЕег сЬе гирегпасапс со а ЕгеаЬ ш!сгоЕице сиЪе ьчсЬоис г335- сигЪ|пц ГЬе Ьассепа1 ре11ес. ТгапнЕег 0.1 гп1 оЕ сЬе аирегпасапс со а ьсеп1е ш(сгоЕице сиЪе. ТЬ(е ЫИЬ-сгсег лсое)г сап Ъе лсогег( )пгсеулп)се!у ас 4'С ог — 20'С ле(сЬоис )осе оГ (пуеес(ч(су. СЛе ЕЬе гегпасшпц 1 гп1 оЕ сЬе си1сиге аирегпасапс со ргераге а!пИ1е-асгапг)ес) Ъассег!орЬаее Е)Ь(А (Ргососо! 4).
ТЛе сЬе Ьассег!а1 се!1 ре!1ес со ргераге с)оиЫе-асгапс)ег) сер ЕТЬ(А (Ргососо! 3). АЬегпа6че1у, сЬе еи)сиге гирегпасапс гпау Ье есогегс ас 4'С Гог !агИе-еса)е ргерагасюп оГ М)5 (Ргососо! 5). Рго1осо! 3 Ргерага6оп о1 0оиЫе-~~гапдед (Кер! ~са6че Гоггп) Вас1епорЬаце М13 РМА лстев!л !ыгтстео чч!тн влствв!орНЛСВ М13 сопташ йе доиЫе-атгапдед КР оЕ тЬе ч(та! РЬ)А апс1 ехтгиде чтгть рагдс1еа сои!а(п(пВ япВ!е-атгапдед ргоВепу РХА 1пто тЬе гпет)пип.
ТЬе с1оиЫе-атгапдед КР Р)ч)А сап Ье )ао!атед Егош япаП си!тигеа оЕ 1пЕестед сеПа ттяпВ шейода япи1аг со тЬоае иаед то риНЕу р1аяпгд РХА. Зечега! ш(сгоВтагпа оЕ Кр РХА сап Ъе ьо1атед Еготп а 1 — 2- ш! си)шге оЕ шЕестед сеПя ччЬ(сЬ 1а епоиВЬ Еог аиЬс!опшВ апд геатПстюп епхуше шарр(пВ. М(п(ргерагаПопа ог писПргерагаПопа (деасНЬес1 ш СЬартег 1, Рготосо1а 1 апс1 2) Еог р1ая ш(д риНПсадоп шау Ъе иаед то ргераге КР РЬ)А. ТЬе гпетЬод деаст)Ъед Ьеге тчаа деч(аед Ьу В)гпЪоип апт1 Ро!у (1979) апс1 аиЬаес)иепс!у пюсППет1 Ъу 1аЬ-Ноготчкх апс1 Виг)се (1981).
1т тчаа ог)В(паПу иаед со ьо1ате с!оаед с(гси!аг р1аяпгд апд сояп(д РХАа Егош Ьастеда) си!!отея Вастег(орЬаВе М13 Кр РХА ргерагед тч(тЬ тЬ(а тпетЬос1 ВепегаПу 1а иаед 1п ттчо тчауя ° То сопйгш йе ргеаепсе оЕ а деягес1 1паегт 1п тЬе ЪассегюрЬаВе М13 честот Ъу геатПстюп апа!уа(а апд ЯоитЬегп ЬуЬНсПтатюп оЕ гесотпЬ(папт ЬассеПорЬаВе КР РХА. ° То гесочег доиЫе-атгапдед РХА 1гош гесотпЬтпапт Ьассет)орЬаае М13 с1опеа йас Ьаче Ъееп ятЬ)естес) то ятеиПгессед шитаВепеяа (СЬартег 13, Ргососо1 2).
ТЬе пштасес1 РХА сап тЬеп Ъе аиЬс!опед (пто а Ьастеда1 ог еи)тагуотк ехргеь(оп честог. Ргерагатюпа оЕ ЬастедорЬаВе М13 КР Р)ч)А аге гаге!у аа с!еап аа япаП-аса1е ргерагатюпа оЕ р!аяп(д Р)ч)А. ТЬе Еогтпег аге оЕтеп соптапипатед тч(тЬ япВ1е-атгапдед чгга1 РХА йат сап соп6ье тЬе раиегп оЕ РХА Етарпепь оЬтатпед Ьу д(Веат(оп тч(тЬ геатдсдоп ептутпея ТЬь ргоЫегп сап Ъе аПеч)атед Ьу апа1утшц тп рагаПе1 ап а!и!иот оЕ КР РЬ)А тЬат Ьаа пот Ьееп ЙВеатес1, 1шеаг апд с(гси1аг япВ1е-атгапдед ч)та! Р)ч)Аа (тчЬ(сЬ иаиаПу арреаг аа йтту Ьапда пивтаВпВ Еаатег йап тЬе доиЫе-атгапдед Кр РХА) аге пот с!еачед Ьу шоя оЕтЬе геатпсдоп ептушеа сопипоп!у тьес1 Еог с!оп(пц тп ЬастеПорЬаце М13.
ргаупепта оЕ доиЫе-атгапдед Р)ч)А тч(тЬ гесеьед 3' тегпипт сап а1ао Ье д(атшви(аЬед Ьопт яике-аттапдед РХАа Ьу епд-1аЪеПпа иа)пц т!те К)епоъч Егааптепт оЕ Е. соП РХА ро1утпетаае 1 (р1еаае аее СЬартег 10, Ргососо1 7). з.гз 3.24 СЬарсег 3: !слог/г/лП сч!/Ь Ваесег!орЬаПе М!3 Ъеесогз МАТЕВ!АЕП САС/Т1ОХс Р!еаье ьее Аррепгпх 12 Сог арргориаге ЬапдппП о/ псагеНа!ь тагЬег/ ииЕЬ <!>. Воггегь апе! По!обопь Р1еаье ьее Аррепепх С Еог сотропепгь о/ ьгоеЬ ьо1ипопь, Ьийегь, апс! геаПепгь. О!!исе ьсосЬ ьо1иВопь со ЕЬе арргориасе гопсепсгас/опь.
АПга/лле /уяь ю/ипол ! АВгаПле /уь/ь ю/ипол В Ргераге Егей Еог еаеЬ изе /гоги згапдагг/ злое/гз; гие аС гооги Сегпрегалые. А//га//ле !уь!ь ю/ипол П/ Е/Пало/ РЬело/кЫого/огт Е!:7, и/и/ <!> ТЕ ЕрН 8.0/ гол!а/л/лП 20 щ/т/ ВА/аье А Епеугпеь апе! Войегь Вез!его/гол елг/илие/еаьеь Се!8 АПагоье Ве! /0.8// еаьс гл 0.5х ТВЕ, солса/л!лВ 0.5 !лВ/т! е/ЬсгПит Ьгот/г/е <1> Р!еазе зее Есер 13. 'с/ес1огь апе! Вас1егга! Ягаспь Е. соП сипиге !л/ее!ее/ лч!СЬ Ьасгег!орЬаВе М!3 Ргерагелс аз г/езегсЪел/ !и Ргососо! 2 оЕ сЫз еЬарсег. МЕТНО0 Еуьсь о1 йе! п1ес$ед СеПЕ 1. Сепсп/иПе 1 т! о/ЕЬе М!3-1пЕеесес/ сеП си1шге ас шахппшп ьреес1 Еог 5 пиписеь ас гоогп сепсрегаспге ш а ппсгоПлПе со ьерагасе сЬе !пЕессес/ сеПь Егош сЬе шее!!шп. Тгапь/ег сЬе ялрегпасапс со а ЕгеьЬ ткгоЕиПе сиЬе апс! ьсоге ас 4'С.
Кеер йе /п/ессес! Ьассепа1 сеП реПес оп ке. ТЬе ялрегиасапс сопла/из М13 ЪаесепорЬаье Ьоияпь з/и81е-зсгапг/е8 Елс/А. 1Е Пеягегс, ргераге МЕЗ Ел/4А Егогп сЬЬ зирегиасапс ас а!асег яаье Ергосоео! 41. 2. СепсНПлПе сЬе Ъассег/а1 сеП реПес Еог 5 зесопс/ь ас 4'С апс! геспоче геь/с!иа! спееПшп сч/сЬ ап аиготагк рсрегйпП с1еч/се. 3.
Кезиьрепс/ сЬе сеП реПес !и 100 Сл! оЕ ке-со!а АПсаПпе!уяь ьо1ш/оп 1 Ьу чсПогоиь чогсех1пП. Ма/ге илге сЬас йе Ьассела! ре!1ес Ь сошр1есе!у гпьрегзе8 ли АПсаПпе 1уяз ю1исюи!. Сгогсехси8 ичо ииегойье сиЬез яиш!саиеоиз1у лч!сЬ йеЬ Ъазеь соисЫи8 лисгеазез сЬе гасе апг/ еЕЕле/епсу чай лчЬкЬ йе Ьаегепа1 реПеСз аге гезизрепг/ег/. ьоиле зсгашз о! Ьассепа йе8 сеП-лчаП согироиеии шсо сЬе гпейши сЬас саи !иЫЬлс сЬе ассюи оЕ геяпесюи еихугиез.
ТЫз ргоЫеш сап Ье ачоЫед Ьу геюзреиепи8 сЬе Ьассепа1 сеП реаес ш 0.5 ш! оЕ 5ТЕ !0.1 м С/аС1, 10 шм Тга-С! 1РН 8.0!,! шм ЕЕсТА !РН 8.0!1 Ье/оге Егер 3 аи4 сепсг/Еи8/п8 аьаш. А/сег гепюча1 оЕ йе 5ТЕ, гезизрепг/ сЬе реаес !и АПса!ше 1узи зо1исюп 1 аз г/езсгсЬел/ аЬоче. 5огпе ргососо!з Еог сЬе ргерагаПои оЕ ЬаесепорЬаье МСЗ Ер РС/А шс!иг/е гПЕезПои оЕ сЬе ее11 лчаПз чай!узохугие, ТЬЬ зсер Ь ЕеиегаПу иос иеееззагу Ьш г/оез ио Ьапп.
То спе!ассе сЫз зсер, агЫ 90 И1 оЕ АПсаПие!уяз зо/исюп! со сЬе Ьаесела! сеП реПес аисс гезыреи8 йе сеПз Ьу чогсехли8. То йе геюзреигсегс сеПз, алЫ 10 р! оЕАПсаПие!уяз зо!иПои! соила!иси8 ВезЫу ргерагегс СО ш8/ш! 1уюхуше. Мгх йе соилропеии Ьу саррш8 сЬе зЫе о/ йе сиЬе апд лисиЬасе оп ке Еог 5 иииигез. Сои!липе иЬЬ 5Сер 4.
Рго1осо! 4 Ргерага6оп о1 5~пц! е-~~гапдед Вас1епорЬаце М13 0МА В лстекгорнлсе м! 3 ягссге5тклгсоев Оп!А с5 Ркерлкео Егош ч(гиа рагс(с1еа аесгегес( Ьу (п(есгес( сеПа (пго гЬе аиггоипйп8 шейшп. ТЬе Ес1ашепгоиа цгиа (а Егаг сопсепггагес) Ъу ргес!РЬа6оп иг(гЬ ро1уегЬу!епе 81усо! (РЕС) ш гЬе ргеьепсе оЕЬ)8Ь за1г. 5иЪаес)иепг ехсгас6оп ъчгЬ РЬепо! ге!еаза ЕЬе а(п8!е-аггапс(ес1 ОЬ)А, ~чубсЬ га гЬеп со1!есгес! Ьу ргес!РЬагюп ичгЬ егЬапо!.
ТЬе геаи11!п8 ргерага6оп 1а риге епои8Ь го Ье иаес( аь а гегпр1асе Еог ОЬ(А аес)иепсш8 Ъу гЬе с1Ыеоху сЬа)п гегпппа6оп шеЕЬос1 (СЬаргег 12, Ргогосо1 3 ог 4), Еог о1!цопис1еог(де-6!гесгес( шига8епеяа (СЬарсег 13, Ргогосо! 1), ог Еог аупЕЬеяа оЕ гайоасг(че ргоЪеа (СЬаргег 9, РгогосоЬ 4 апс( 5). ТЬе Ео11оълп8 ргососо1, ас)аргес( (гоги 5ап8ег ес а1. (1980) апс1 Меаяп8 (1983), )а ЕЬе жпр1еас апс( пюаг иЫе1у иаес( гпегЬос1 Еог ргерапп8 ып81е-аггапс(ес( РЬ)А Егош а япа!1 пшпЪег оЕ ЬасгегюРЬаце М13 гао1агея А у(е!д оЕ 5 — 10 )г8 оЕ яп81е-аггапс)е6 ОЬ)Агш! оЕ шЕесгес1 се1!а гпау Ъе ехрессес( Егогп гесогпЪ!папс ЬасгепорЬа8ез Ьеапп8 !паегп оЕ 300-1000 пис1еогЫея ТЬра аспоипг !а епои8Ь Еог 10 — 20 сус!е-аес)иепсш8 геасг!опт ог 5 — 10 5ес)иепаае геасг!опа (СЬеп ег а1.
1991; На11огап ег а1. 1993). ТЬе агапс(агс( шегЬос) Еог рипйсагюп оЕ ЬасгепорЬа8е М13 ЭХА с!еасг!Ьес( ш гЬга ргогосо1 !а пог арргорпаге Еог !аг8е-аса! е аес(иепс!п8 рго) есп, игЬ|сЬ гур(са11у гес!и(ге шапу гЬоиаапсЬ оЕ ОНА гегпр!агея Рог а шегЬос! го ргос(исе гЬеае гешр1асеа 1п 1аг8е пшпЪегя атее СЬарсег 12, Ргогосо1 2. МАТЕИАЕ.Б САОТ1ОЬ1: Р1еаае аее Аррепйх 12 Еог арргорг(аге Ьапс)1(па о( шагепа1а шаг(сес( ипЕЬ <1>. ВпЕЕегь апс1 Во!01!опа Р(еаае аее Аррепйх ! Еог согпропепгь о( а!ос(с ао1и6опя Ьи((ега, апс1 геааепгя О!!иге а!ос(с ьо1ибопь го ЕЬе арргорг(а1е сопсепгга6опя СЬ!огоуоггп (1> Р!саге атее по!е ас 5сер 7, ЕЕЬапо( РЬепо! <1> Ро!уеГЬу!епе дlусо! 8000 (20'4 ггЕч РЕС ВООО) <1> т 2.5 лг й!аС! Р!саве кое сЬе сп(оппасгоп рапе1 оп РОЕУЕТНУЕЕМЕ С1ХСОЕ 3.26 Ртотосо! 4: Ртератапоп о~$тл~1е-ггталг)етЕВасгетторЬаче М13 РАЕА 3.27 5осбит асетате Е3 М, рН 5.2) 5истоае Ве1-)оас)тлВ ЬиЕЕет ТЕ ЕрН 8.0) Се15 АВатоие Веl Е1.2;4), сахг т 0.5х ТВЕ алт) солгатлтлВ 0.5 !тВ)т) егЬтс)тит Ьтоттс)е < ! > Р!еаае атее 5тер 13.
Мпс1е!с Ас!415 апд О1фопос1ео6де5 5тлВЕе-згталс)ег) Ьассет1орЬаВе М13 чесгот оЕ тесотЬтлалг Е))т)А Рае ргерагат!опт оЕ Ьастег!орЬа5е М13 РЕПА оЕ !споттп сопсептгатюп аь соптго!ь с!иг!п5 Пе! е1естгорЬогеяя Р1еаае аее 5тер 13. прес!а! Ецо!ргпеп$ Ми)ШиЬе чотгехтлВ тасЬтле (орбола0 ЧесЕог5 апд ВасЕег1а! Ягагп5 Е. соП сиИитех тлуесгес) пой ЬасгепорЬаВе М13 Ргераге ап шЕестес1 си! тите аа сгеьсг!Ьес$ тп Ргогосо! 2. ТЬеае си1тигеа аЬои14 Ье !пЕестес1 тч!тЬ ЬотЬ тЬе ЬорейЕог гесотпЪшапт ЬастеггорЬахе апс1 а соптго! си1гпге тпЕестес1 тч!тЬ попгесоптЬтпапг ЬастепоРЬахе. Р1еаье аее поте то спер 4.
То п тЬе роет!ЬП!ту оЕ ге!ест!п5 т)е1ет!оп птитапь, Пготч си!- тше !пЕестес! тч!тЬ гесотпЬтпапт М13 Ьастег1орЬахез Еог тЬе аЬогтеат роя!Ые ыпе гет!штата то асЬтече ап аггее!пате у)е18 1<3 Ьоига). Рог ЕигтЬег Петат1я р1еаае тес гЬе шуоппагюп раве! оп СКОчЧТН Т!МЕ5. Вас!ее!орЬа5е М13 а!п51е-атгаптгет) РЕЕА со Ье иаес! аа а тегпр!ате Еог сегта1п сурет оЕ оППопис1еогЫеоПгестет1 тпша5епеяа аЬои!д Ье ргорацатет! ш Е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
