Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 28
Текст из файла (страница 28)
КеьггЕс))оп епг)опис)еаьеь Ое!5 Гон -те)Гупи-ГетрегаГиге аВагоье Ве1 Р!еаье ьее СЬаргег 5. Нос!е1с Ас)еЬ апг! О!коппс!еоГЫе5 ЕогеЕВп РАЕА Рlаьтуг) РАЕА Г-)00 нВ/т), г)ерЬоьрЬогу)аГесЕ) Арргохннаге!у )00 пд оЕВерЬоьрЬогу)агент )7)4А Ь ге9шгег) Еог еасЬ !)Ваг)он. 1.103 1.104 СЬарсег 1: Р1аятЕгГя апгЕ ТЬегг Г7яеуи1пеяя т Мо!еги!аг С!опте Ьресса! Ес!сясрстсепГ НеаСЕпа Ыое7г ргеяег Со 70 С Исгач107ес Еагпр, ЬапгЕ-ЬеЕЕЕ, Гопа ччачеЕепасИ Г302 лпс) (1> Яасег бас!с ргеяес со 76 С сч!ЕТНО0 1. Ряе сЬе арргорпасе геяспссюп епгугпе(я) со 6!аеяс ап аспоипс оЕ сагаес Р)чЕА яиЕЕс!епс со усеЫ -250 па оГ йе деяге6 Ггаашепс. РегГопп сЬе 61аеяс!оп сп а чо!шпе оГ 20 Сс! ог 1еяя.
2. Яерагасе сЬе Р)ч)А Егаашепся Ьу е1ессгорЬогеяя сЬгоиаЬ а 1осч-псе16па7ае11!пц-сегпрегасиге ааагояе ае1. 3. Ехапипе йе ацагояе ае1 ипг1ег 1опа-ччаче1епасЬ ЕЛ' 71!шшпасюп. Егогп сЬе ге1асгче Е)иогеясепс !псепябея оГ сЬе с!ея)гес! Ьапс!я, ея6гпасе йе ашоипь оГ Р)ч)А сЬас йеу сопса)п. 17яе а с!еап гахог Ыаде со сис оис йе 6еяге6 Ьапс!я ш йе япа!1еяс рояя!Ые чо1шпе оГ ааагояе (ияиа1!у 40 — 50 171). 1.еаче а яша!! апсоипс оГ еасЬ Ьапс! гп сЬе ае) со гпаг1с сЬе роя16опя оЕ сЬе РХА Егаашепся апг) сЬеп рЬосоагарЬ сЬе 61яяессес1 ае1. 4.
Р1асе сЬе ехсйег1 апс1 сппипес! я1кея оЕ ае! ш яерагасе, !аЬе1ег1 гпссгоЕиае сиЬея. !Е песеяяагу, йе ааагояе я11еея гпау Ъе ясогеа Гог а Ееж гСауя ас 4'С т с!ояегС сиЪея. 5. Ме!с йе ааагояе Ьу Ьеас!па сЬе сиЬея со 70'С Гог 15 пиписея !п а Ьеас!пд Ыос1с. Ея6гпасе йе чо1шпе оГ сЬе гпе!се6 адагояе !п сЬе сиЬе апд са1си1асе сЬе чо!шпе йас ччои16 сои!а)п -200 пц оЕ РЪСА. ТЪе апп Ь ю Ъагчеяс -200 п5 оЕ Гоге!ап 775!А !и а чо!шпе оГ 10 р1 ог !еяа ТЪ!я са1сея ргасбсе. Носчечег, Наасюпя счогсг, а!Ъеа 1еяя ейю!епс1у, Еог Ъапдя сои!а!и!па ая Нсс1е ая 10 па оЕ Гс74А йас аге оп1у !ии ч!6Ые !и сЪе ае!. 6.
1п а ясеп!е писгоЕиае сиЬе ччагшес! со 37"С, сошЬ!пе йе Е011очч!па: дерЪоярЪогу!асей р!аятЫ 7!ХА 60 Гпю1ея Гоге!ап РЪСА Егаатепг ! 20 — 240 Ето!ея Еп а чо1ыпге оГ 10 р! ог 1еяя) М)х сЬе сопсепся оЕ йе ыЬе с)шсИу чч)сЬ а ясеп!е 61ярояаЫе р!Репе 6р ЬеГоге сЬе ааагояе яо11ЙЕ)ея. ТЪе то1аг габо оЕ Гоге!ап Е774А со р!аипЫ чеьог !и йе Наасюп геасс!оп яЪои16 Ъе по 1еяя йап 2:! апгС по тоге СЬап 4: !. 7. 1п яерагасе сиЬея, яес ир сччо асЫЬюпа! 11аасюпя ая сои!го!я, опе сои!а!п)па оп!у йе г!ерЬоя- РЬогу!асе6 р1аяш!6 чессог ап6 сЬе осЬег сои!а!и!па оп1у сЬе Ггарпепс оЕ Гоге!ап Р!чЕА. СЕ.
!псиЬасе сЬе сЬгее сиЬея !ог 5 — 10 пнписея ас 37"С, апс1 СЬеп асЫ со еасЬ сиЪе 10 01 ос' !ее-соЫ 2х Ьассег!орЬаце Т4 Р!х)А 1Еааяе ппхсиге. Мпс йе сопсепся оЕ йе сиЬе с)шсЫу чч)сЬ а ясег!1е 61ярояаЫе р!Репе сср Ьеуоге сЬе ааагояе яо1ЫЕТсея. !псиЬасе сЬе геасс!опя Еог 12-16 Ьоигя ас 16'С. ТЪе гесотЪ!папеп ргоаигь оЕ йе Наас!оп геассюп, сап посч Ъе шее гагесс1у Еог сгапяГогпсабоп Еая Неясг!Ъед сп Ргососо! 23, 24, ог 25 ог Еог е!ессгорогасюп ая гСеясг!Ъеа !и Ргососо! 26) саго Е. со!Ъ Нате!с сЪе ааагояе !и йе Наас1оп пнхсигея Ъу Ъеас!па йе яеа!еа т!сгобхае сиЪея со 70'С Гог ! 0 — ! 5 пбпшея сп а Ъеас!па ЫосСг ЪеЕоге сгапясогтас!оп ог е!ессгорогас!оп.
Тур!саНу, ! — 5 р! оГ еасЪ Наас!оп хаасс!оп !я ияег! со сгапяЕопп сЪеписаНу ргерагегС сотресепс Ъассепа1 сеНя. Оп1у О. ! — !.0 Сс! оЕ сЪе Ноас!оп геасс!оп !я гегСшгесс Еог сгапГоппабоп оЕ ЪассепаС сеНя Ъу йе гпоге еЕНс!епс тейос! оГ е1ессгорогас!оп. АгЫссюп оЕ а агеасег чо! итие оЕ сЪе баас!оп ппхсые М11 спсгеаяе йе яо1ше сопсепиасюп т сЪе е1ессгорогас1оп сеН со йе ро!пс счЪеге агс!па Ъесотея а сС!яг!псС рояя!Ь|НСу. Рго1осо! 23 ТЬе Напапап Мейод аког Ргерага6оп апд Тгапйоггпа6оп о1 Согпре1еп1 Е сой: Н ~цЬ-ей~оепсу Тгап Моггпайоп нгн Ооссс Нлнлнлн вАх л салстссАтс хтссогнт ас Со1д Ярдп8 НагЪог 1аЬогасогу апс1 Нагчагд с)псчегассу 1п йе 1асе 1970а апд еаг1у 1980я Ье асЬ]ечед сгасьЕоппадоп е61с)епс)еа сЬас счете ипЬеагд оЕ ргеч!оиа!у, Ъис сЬеп Ьесате асапдагд. НапаЬап дгоче а Гаас саг, счог)сед тиас!у ас т8Ы апс1 ччссЬ аоте аесгесу, печет сеП]п8 йе ш8гегПепь оЕ сЬе сгапаГогтасюп ЬиГЕег йас 8аче Ьсгп стсЬ арессаси!аг гехи)ся Носчечег, Ье 6ее1у апд 8епегось1у гПяпЬисед йе Ъийег со апуопе счЬоае ехрепгпепс пеедед Ьс8Ь еЕГсссепссеа оГ сгапаЕогтасюп.
А 8оод гпапу оЕ йе сРй)А 1сЪгаПеа 8епегасед оп йе Еаас Соая гп сЬе еаг!у 1980а счете еасаЫсаЬед ъч)сЬ НапаЬап'а сгапа)оппадоп Ьийег, счЬ)сЬ счаа [лосчп аа "1щиЫ Оо!д" Ъесаиае оГ Па Ьеаидуп1 аЬспипепп8 со1ог. ЕчепсиаПу, йе Еогпш1а Еог 1сс!шд Со1д ъчаа риЫ)аЬед, со8есЬег чч[сЬ а с1есаПес1 деасПрсюп оЕ Ьоъч со асЬ[ече Ь18Ь еЕ6ссепссеа оЕ сгапаЕогтасюп (НапаЬап 1983). 1Е ГоПосчед скгири1оиа1у, НапаЬап'а ргоседиге сап гергодис[Ыу Пепегасе сотресепс си!сигеа оЕ Е, гоП йас сап Ье сгапя Еоппед ас Ьс8Ь Егес)иепссеа [5 х 1Оа сгапаГогтед со!опсеа))с8 оЕ аирегЬе1ка) р1аяпЫ Р)ч)А).
ТЬе 1сеу счогд Ьеге )а скгири1оиа!у. РоПосч НапаЬап'а 1паспкс[опа ехгкс)у апд аП мч11 Ъе счеП. Та1се а аЬогс сис, сье йгсу 81ааячаге, иприге счасег, ог а зса1е сЬетсса! апд д)харри)пстепс М11 ЕоПочч, счЬкЬ гпау ехр1а)п счЬу юте шчеас18асогз асги881е со гергодисе НапаЬап'з геаи!ся ТЬгее Гассога арреаг со Ье сгис)а1 Еог оЪсаш[п8 сопа]асепс!у Ьс8Ь Егес!иепс[еа оГ сгапаЕогпсасюп оЕ сотресепс сеПа ргерагед Ъу йе НапаЬап ргоседиге: ° ТБе рипсу оуйе геадепь ихед 1п йе стим)огтаг)оп Ьифегя 1с ь тиас ипрогсапс со ргераге йе сопсресепс сеПа ияп8 ъчасег апд гПгпесЬу1аи1ЕохЫе (ГсМ80) оЕ йе Ь~8Ьезс рипсу [НапаЬап 1985). 8оте геа8епЬ, спс1иоПп8 сотропепга оЕ Ъасгепа1 тегПа, десПпе чч)СЬ агога8е. чСгЬепечег роаяЫе, гье ГгевЫу ригсЬааед геа8епь апд 8госчсЬ тед[а. 1Е ргоЫепь агье, )пгПчЫиа! геа8епса (е.8., ГсМ80, гПсЬсойгепо1 [ГсТТ], 81усего1, апс1 2-[Аг-тогрЬоПпо] ейапеаи!Еопк асЫ [МЬ8]) аЬои!д Ъе аиЪадсисес1 опе ас а дгпе сп йе сгапзГоппадоп ргососо! со аскегсасп сЬе с)иаПсу оЕ а 81чеп ЪассЬ оГ геа8епс апд 1ь ейесс оп сЬе сгапаГогтасюп 6ес)иепсу.
° ТЬе агате оГегосчй оГйе се!!я Рог ип)спосчп геааопя сЬе Ь18Ьеьс Егег!иепссеа оЕ сгапаЕогтасюп аге оЬСа)пед иг)СЬ си!Сигеа йаС Ьаче Ьееп 8госчп гПгесС1у Егогп а таагег Яос1с агогед сп Ггеех!п8 гпегПшп аС -70'С. Си!гигеа СЬаС Ьаче Ьееп раааа8ед сопг[пиоиа)у ш йе 1аЪогагогу ог сЬас Ьаче Ьееп асогед ас 4"С ог ас гоосп сепсрегасиге аЬои!д пос Ъе иаед.
° ТЬе е1еап1спея оу сБе д1аиыаге апд р1ахсспмаге. Весагье стасе апюипь оЕ десег8епс ог осЬег сЬет)са1а 8геас1у гедисе йе еЕ6с)епсу оГ Ъассепа! сгапаЕогтас[оп, и ]а Ьеас со аес аяде а ЬассЬ 1.105 Е.!Об СЬаргег !| Р!аяпЫх апд ТЬе|г (/хе)и!пега т Мо!еси!аг С!оп!п8 оЕ 81аааччаге йа! ы иаед Еог по огЬег ригроае !Ьап !о ргераге согпресепг Ьасгепа. ТЬ|а 81ахагчаге ьЬои!д Ье |чааЬед апд ппзед Ъу Ьап|1, 6!1е|1 чч(й риге хча!ег (М1111-О ог ег!и!ча1епг), апд 5!е61(гед Ьу аигос1агдп8. ТЬе |ча!ег аЬои1д Ье йасагдед )иаг ЪеЕоге йе 81ааахчаге ь иае|1.
Кеер |п пипд йаг шалу п|апиЕасгигед р!аа6са апд 6!сеш иаед Еог агегРдга6оп сопсаш де!ег8еп!а йас сап ъечеге)у гедисе йе ггапаЕогшапоп Егег)иепсу. НапаЬап'а ргосе|1иге гчог(сх гче!1 шЬЬ Яга(пь оЕ Е. соЕ сопппоп1у иаед (п шо1еси1аг с1оп(п8, (пс1ид(п8 РН1, РН5, ММ294, 1М108/9, РН5а, апс( шапу огЬега.
Ногчечег, а Ее|ч 81гаша оЕ Е. соВ (е.8., МС1061) аге гергасгогу !о й|8 п|ейо|1. Рог ЕиггЬег де!а(18 ап|1 1Ье ехгепяоп оЕ йе шегЬо|1 го огЬег арес(ех оЕ Ьасгепа, аее НапаЬап ег а!. (1991, 1995). О1Ьег шегЬода Еог сгапаЕоппа6оп аге девспЬе|1 |п Ргогосо1 24 (ргерага6оп оЕ "и1сга-сотре!епг" се!18) ап|1 Рго!осо! 25 (ггапв1оппаггоп ияп8 са!сгип| сЫог(де). МАТЕ1с1А!.Ь СА()Т1ОЬ): Р!еаье аее Аррепйх 12 !ог арргорпаЕе Ьапдппд оЕ п|а(епа!а п|аг1|ед чч(ЕЬ <!>.
ВНЕЕег5 апе! Бо!66опь Р1еаае аее Аррепд)х 1 Еог согпропеп(ь оЕ 51ос(с ао106опя Ьипега, апд геа8еп!я Р!10!е а(ос(г ао!ипопа !о йе арргорпаЕе сопсеп1га6опа. РМ5О <! > Ох|даиоп ргодисга оЕ РМ50, ргеашпаЫу йше|Ьу! ги!Еопе апд йгпе|Ьу! аи18де, аге шЬгЬ~|ога оЕ !гала(огшаг)оп (НапаЬап 1985).
РпР (РМ5О апд РТТ) ао!и!/оп 1.53 8 оЕ йй|оГЬге1Го! 9 ш! оЕ РМ5О ! 00 )|1 оЕ! М рогам|шп асегаге (рН 7.5) Н ОГо10п|! 5|ее)1)ге йе РпР ао1идоп Ьу 81ггаг|оп гЬгоиВЬ а М|11ех 58 п|ешЬгапе ишг (М)1!)роге), гчЬ(сЬ ы дея8пед |о |ч||Ь||апд ог8ашс ао!чепга. Рьрепае 160-(г! а1н!иога оЕ йе РпР ао1ш|оп |пго агеп1е О/пп|! писгоги8е гиЬеа. С!оае йе шЬеа 68Ь11у апд |гоге гЬеш аг — 20 С. рог ргерагаиоп оЕ 1 М рогаЫшп асегаге (рН 7.5), р1еаае аее Аррепсах 1. Тгапх/огтаг!ол Ьи//егх (р!еахе хее 51ер 7) 5гапдагс1 |гапггоппадоп Ьи((ег (ТРВ) Ь мед |чЬеп ргерапп8 сошре|еп| сеП| Еог ипгпейаге ше.
ргогеп агога8е Ьи((ег (ГВВ) Ь ыед со ргераге а!ос)са оЕ соп|регепг се1!а йас аге го Ье агогед аг — 70'С. Мее1!а 5ОВ айаг р!агент соп!а/л/л8 20 таг М85Оа апд Яе арргорпаге апг!Ь/ог!с 51апдагд 5ОВ сап!а|па 10 гпМ М850 . 5ОВ тесоит сои!а!л/л8 20 гпМ М85О| 5|алба|а 5ОВ солса|па 1О шМ М85О< 5ОС тес/!ит Арргох)п|а|е1у 1 гп! оЕ й|а шедшп| ь пеедед Еог еасЬ !гала(огшаг)оп геасг)оп. ~Чос!е!с АСЫ5 апе! О!коппс!ео6е1е5 Р!аып!с/ РХА (гесотЬтапГ р/аат!д) Сот|гас| ияп8 опе оЕ йе шейода деаспЬед ш Ргогосо1| 17 йгоиВЬ 22 о! |Ь)а сЬар|ег.
Сеп$г!Ель апе! ЕсоЕог5 5огчаИ С5А гогог ог еди/ча!еп! прес>а! Ес!о!росео$ Нс!и!с( л)сгоаеп <1> Ро)ургору)еле СиЬеа (50 т!Ь сЬ!7)ес( т )се Ро(ургору(еле СиЬеь (77 х 700 тгл; Га)сол 2059), сЬ(7)егЕ гл гсе Яагег Ьай ргеаег Со 42 С 'суес1ог5 аос! Васгег!а! Ягасо5 Е, со!! йгат Со Ье Сгапауогтес) КУогел агос)с) ТЬе йгаш аЬоп10 Ье асогегС ас -70'С си Ьеегсп8 шесВшп (р!еаае аее АррепгВсеа 1 ап0 8). МЕТНО0 Кг 1МРОКТАЬсТ А!! асера !и й!а ргососо! аЬоиЫ Ье саге!ег( оис аьер0са!!у. Ргерагатсоо оТ' СеП5 1. Ргераге !гала(огшас(оп Ъийег.
ТГВ га ые0 счЬеп ргерапп8 сошресепс се1!а Еог шппесВасе пас. Г5В ь ме0 со ргераге а!ос)са о( согоресепс се!1а йас аге со Ье асоге0 ас -70 С. Ог8апгс сопсапппапса ш йе Н,О паегС со ргераге сгапаЕоипаиоп Ьо0ега сап гегСосе сЬе еЕВссепсу оЕ !сапа(огшассоп оЕ сопгресепс Ьассеиа. Н,О оЬсаспег) сВгесиу Егогп а чге!1-аегч(се0 М1111-О 61сгасюп ауасегп (М11!!роге) пеоа11у Вечеа Виола геао1са. !Е ргоЫегпа аЬоп1гС апас, сгеас сЬе гСе!опсгег) Н,О апй ас0часей сЬагсоа! Ъе(оге ые. ТО РВВРАке 5тА!9ОАко ткА195ГОкмАт!Оьс В(7ГГек а. Ргераге 1 М МЕ$ Ьу йаао)ч)п8 19.52 80ЕМЕ5 сп 80 гп! оЕриге Н,О (М1111-О, ог ее)шча1епс). Ас)!иас йе РН оЕ йе ао!исюп со 6.3 сч(сЬ 5 М КОН, апс1 асЫ риге Н,О со Ьпп8 йе 6па! чо1шие со 100 ш!.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
