Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 21
Текст из файла (страница 21)
ТЬеге жеге гЬои8Ьс со Ье песеяагу со асЬ1ече ьасшаип8 Ргогосо! 10: Риг()зсагзоп о)г С!олег( С(гси!аг Е7ХА| Соп6пиоиь бгаг!зепгь 1.67 Ь|пйп8 оЕ сЬе г)ги8 со с!оьег) с(гси!аг РХА аиз) 1шеаг РХАь. Ноизечег, Ьз8Ь сопсепсгацопь оЕ шзЬоипс) ей|йшп Ьгоп|Ые и|ау оЬьсиге Еашс Ьапс(ь оЕ РХА со ьпс!з ап ехсепс сЬас РЧ 01шшпасюп Ь гег(шгез) Еог Ныла!|ааПоп. Кесепс!у, 1о|чег сопсепсгас(опь оЕ есЬ(дшсп ЬгогпЫе Ьаче Ьееп пьес( ьиссеьь(иПу, аПочбп8 Ьапй оЕ 11ХА со Ье ьееп |п ЫяЫе ПВЬ| (е.8., р1еаье ьее бооз( апг) Хаааг 1995).
Нозчечег, ргоЫегпь сап апье |Е 8газ)(епсь сопсаш|п8 !озчег сопсепсгасюпь оЕ есЬ~йшп Ьгоп|Ые аге очег1оаг(е|! |чПЬ пис!ек асЫь. 1п й|ь сазе, сЬеге пзау пос Ъе ьиЕПс!епс с(ги8 со асЫече ьасигаПоп Ь~пеПп8 со с!пьес) с|гси1аг РХА апс( Ппеаг РХАь. Весаые пюя оЕ йе есЫсПшп Ьгоп|Ые |п СьС1-ейЫшпз Ьгоп|Ые ВгагПепп Ъ|пс(ь пос со РХА Ъ|зс со Ьассепа! КХА ргеьепс ш сЬе сги|1е ргерагаПоп оЕ р!аяпЫ РХА, сЬ(ь ргоЫепз сап Ъе ьойеП Ьу сгеацп8 |Ье ргерагасюп зч(сЬ РХаьеЕгее КХаье Ье(оге и!сгасепспЕи8ацоп. ТЬВ сгеасшепс В пос шиаПу песеяагу !Е сЬе сгиг)е р1аьгиЫ ргерагаПои Поги а 50-ш! Ьассепа! си1шге В гесопьцсисед |п -3 гп) оЕ ТЕ (рН 8.0) апс( меП со ргераге а яп81е 5-ш1 С|С1-ейЫшш Ьгоп|Ые Вгайепс. госог) Еог 5 пцпспеь ас гоогп сеизрегасцге.
!Е с))ьроьаЫе ро1ургору1епе сцЬеь аге пьес), сепСпрц8е аг 1100|7 (3000 грпз (и а 5огча11 55-34 гоСог) Еог 10 из!пцгеь. ТЬе з)аг)с гег) ьсшипзу ргес|р|сасе йас Паап со йе сор оЕ |Ье сепсп(с8е спЬе сопяьсь оЕ согпр1ехеь Еогшег) Ьепчееп йе есЬЫипи ЬгогпЫе ап|1 Ьассепа! ргосе|пь. ТЬе реПес ас сЬе Ьоссопз оЕ сЬе сиЬе сопяьп оЕ !аг8ег сЬип(сь оЕ Ьассепа1 г)еЬ|(ь, геьийп8 (гоп| йе 1уяь оЕ сЬе Ьоьс Ьассепа Ьу 5Р5 аиз(зог Ьеас. ТЬеье ипаррес|аш8 г(е!кас(еь аге сопппоп!у епсоипсегег( |чЬеп йе Ьоьс Ьассепа аге 1уьег( Ьу ВР5 ог Ьу сЬе ЬоП!п8 ргосез)иге. 5|паПег а|поппи оЕ г)еЪ|!ь аге яяЫе (и аП|а!ше 1уьасеь.
4. (3ье а раьсецг р)репе ог а г)(ьроьаЫе ьупп8е Езссес) зч!(Ь а 1аг8е-Пац8е пеес1!е со сгапьЕег сЬе с1еаг, ге|1 ьо106оп цпс)ег сЬе ьсшп ап|1 аЬоче йе реНес со а сцЬе ьц(саЫе Еог сепсг(6л8асюп (и ап ц1сгасепсг(6|8е госог. Тор оЕЕ йе рагс|а!1у Ез!!ес! сепсг)Ец8е сцЪеь ко 1!8Ь( рагаЕ6п оП ог геЬапсбп8 ьо1цсзоп. Ма1се ьцге сЬас йе зче!8Ьсь оЕ сцЬеь орроьбе еасЬ ойег зп йе госог аге ег!ца1.
5еа! йе сцЬеь ассогсбп8 со сЬе пзапцЕассцгег'ь !пьсгцсс!опь. Ма)се а посе оЕ сЬе РХА ьа|пр1еь 1оаг(ес( |псо еасЬ пшпЬегес( р1асе |п |Ье госог. Еог сЬе госог: Еог 6 Ьоигь Еог 16 Ьоигь Еог 48 Ьоигь Еог 24 Ьоигь Еог 24 Ьоигь 5. Сеп(г)бл8е йе с)епьз(у ПгасбепСь а( 20 С аь арргорпаге ВесЬпап ХЪ'Т 65 госог 366,000г (62,000 грги) Вес)спзап Ъ'Т|65 госог 194,000г (45,000 грш) ВесЬпап Туре 50Т( госог 180,0008 (45,000 грп|) ВесЬпап Туре 65Т| госог 314,000е (60,000 грш) Вес!пиап Туре 70. 1Т( госог 331,000е (60,000 грш) 6.
Ас сЬе епс) оЕ йе сепсПЕ08е гцп, Пепс!у гепюче (Ье госог Егози (Ье сепспйл8е ап|1 р1асе П оп а Нас ьцгЕасе. Сагеуц!1у гегпоче еасЬ сцЪе апс) р1асе П |п а сеьс |цЬе гас)с сочегес) ъч!й 6п ЕоП. 1п а сбгп!у 1!с гоогп (|.е., зч(сЬ (Ье очегЬеас! Пцогеьсепс 1|ПЬ!ь сцгпес) оЕЕ), июцпс опе илЬе |и а с1агпр ассасЬес) со а пп8 ьсапс) аь ьЬо|чп |п р(8цге 1-8. Тзчо Ьапс)ь о( РХА, !оса!ее) Ы йе сепсег о! йе Вгаз))епс, йои!П Ье чп|Ые ш огйпагу ПВЬ| (р1еаье ьее БВиге 1-8). ТЬе иррег Ьапй зчЫсЬ иьпаПу сои|а|из 1ея шасепа1, сопя|се оЕ Ппеаг Ьассепа) (сЬгошоьоша!) РХА апс( пк(гег( с(гси!аг р!аяиЫ РХА; сЬе 1озчег Ьапг( соппьп оЕ с!пьес) скси!аг р1аьшЫ РХА.
ТЬе с)сер-гег) реПес ои сЬе Ьоцош оЕ йе шЬе сопяьп оЕ есЬЫшш ЬгошЫе/КХА согпр1ехеь. ТЬе п|асепа! Ьесзчееп сЬе С|С1 ьо1ипоп апз) |Ье рагаЕПп оП 'ы ргосеш (и саьеь зчЬеге йе у1еЫ о( р!аяиЫ РХА ы !озч, а ЬапйЬе!й!ои8-|чаче1еп8|Ь Р'ч' 1ашр сап Ье пьес) со ч|ьиа1гее йе РХА айаг сепспЕи8асюп. ТЬе !агпр В гиоипсе|1 зч!й а с1агир оп йе хаше пп8 ьсапг) тес! со ьиррогс йе сепсг(Еи8е сиЬе сопса|п!п8 сЬе ьерагасег) РХАь. 5Ь(п(п8 Рч' ППЬ| ои йе ш!зе чНП саше сЬе е|ЬЫшгп Ьго|иЫе-РХА согпр1ехеь со й|огеьсе а ЬпВЬс огап8е, йегеЬу Еас81- сацп8 сЬе(г зч|йдга|ча! зчКЬ сЬе пес|По)ьуг(п8е.
1Е а 1агир Ь изей йеп |Ье р1аяпЫ РХА ьЬои18 Ье гесс(ечез( аь з(икИу аь ром|Ые ыпсе ехсеьь ехроьше оЕ йе р1аяпЫ РХА со (З'ч' ПВЬс чНП |(а|иа8е сЬе РХА. !п адйсюп, |чеаг а Еасе ьЫеЫ со ргосесс сЬе еуеь Егопз |1аша8е Ьу РУ ППЫ. '|ЧЬегеаь 1оп8-|чаче!еп8|Ь Р'ч' (ггагПасюп самса 1еы г)апза8е со РХА йап йюгсег |чаче!еп8|Ь, и В росепс епои8Ь со а|01 саше шсигу со |Ье еуеь. 7.
Со!1есс сЬе Ьап|1 оЕ с!пьес! с|гсц1аг 1)ХА (р1еаье ьее р(8цге 1-8). а. Бье а 21-Пац8е Ьурос)егпз(с пеес1!е со гпа1се а япа11 Ьо1е (и сЬе сор оЕ сЬе |цЬе со а11озч а|г со епсег |чЬеп 6цЫ (ычпЬ|1га|чп (р(8цге 1-8А). 3. 1Е Согех 8!аьь сцЪеь аге пьес), сепсг(Ец8е (Ье ьо1цсюп ас 77008 (8000 гргп зп а 5огча11 55-34 РГО1ОСО~ 11 Рцппса6оп ог С!оьед С1гси!аг 0МА оу Еци~1~Ьпит Сеп1г~1ица6оп 1п СьС1-ЕЙМшт Вготйе Сгайепй: 0ьсопбпиоиь Сгайеп1ь ок сентк1гглсатюя тнкоглсн в15сонт1нглоглб ок Ркеюкмегл СаС! кгайепь, 80106опа сопга)п)пк с)1ГЕегепс сопсепггагюпа оГ СаС1 аге 1ауегег1 шсо ГЬе сепгг)Гике ГиЬе. ТЬе аатр1е сап Ье лп ГЬе ппгЫ!е 1ауег (ГЬгее-егер кгайепг) ог ГЬе Ьопогп 1ауег (глео-егер кгайепг). Риг)пк аиЪаег)иепг сепгг)Гикабоп, ГЬе РЬ)А Впс!а 118 Ьоруспк ро)пг г)иг)пк Гоппабоп оГ ГЬе кгайепг, леЬкЬ а11олеа ГЬе сепгг)Гика6оп гппе го Ъе кгеабу гег!исег).
Рог ГьггЬег шГоппа6оп оп сеа)игп сыогЫе, р!еаае атее 1Ье шЕоппабоп рапе1 оп СЕ5ШМ СНЕОК1ОЕ. Весаиае г!1асоп6пиоиа кгайепь г)о пог соте со гпле ег)и1!1Ьг)ит, ГЬе геао1ибоп оЕ с!обед слгси!аг р1аяпЫ РЬЕАа Ггот сЬготояота! РЬ!А ы пог аа Ь~ВЬ аа лп ае1Г-Готт)пк игал!!епь !Р1еаае бее Ргососо! 10). 1п лепета!, ГЬгее-егер кгайепь клее Ьепег гели!га Гп а 8Ьоггег 6гпе ГЬап Глеонаер дгайепла !Ропп апг) Вогпесг!ие 1995). МАТЕК1А15 САЕ)Т1ОЬ1: Р)еаае бее Аррепйх 12 Гог арргорпаге Ьапб!1пк оГ та1ена18 таг1гег) ле)ГЬ <1>. Войег5 апд йо!611оп5 Р1еаае аее Аррепйх 1 Гог сотропеп18 оГ а!ос!г ао!иоопа, ЬиГЕега, апд геакепга. Р!1иге а!ос!г ао!иоопа Го ГЬе арргорпаге сопсепГга6опа. С5С! Гао/Ес)) С5С! Гауегл Еог а ГЬгее-агер Жлсопьпиоиа ВгагГГепг Ргераге йе 1ауега Еог а ГЬгее-егер кгайепг ал г1еесг1ЬегЕ 1и ТаЫе! -У.
ЕГЬ1г)уит Ьготйе ГГО тд)т)) <1> ТЕ ГрН В.О) Мис1е!с Ас!Г15 апд О11еопос1ео6де5 Сгиг)е р)азгпу ргерага6оп 1Ле гиагегь! Егот епЬег Гаер 1б оГ Ргогосо! 3, 5гер 18 оЕ Ргогосо! 5, ог 5гер 19 оЕ Рюгосо! 7 оГ йы сЬарсег. Лз а ил1е оГ ЕЬиилЬ, йе сгигГе р!алплЫ ЕЛЬ!А ргерагелЕ Егопл ио гиоге ГЬаи 50 ги! оЕаи очеги18ЬГ си!гше еЬои14 Ье ивеб рег кгагкеис.
ТЬе сеиде р1аеилЫ ргерагаиои !соил а 100-ил! си1гиге лЬоиИ Ъе гесоиеи- гилее! 1и -0.9 ги! оЕ ТЕ (рн 8.0), ъгйсЬ 1е еиоикЬ го Гогги йе ил1сЫ1е 1ауег о! гпо г11есоиг1ииоие кгайеиь. 1.69 ТАВЬЕ 1-7 ТЬгее-КГер О!агап!!пиоиа Сгаг!)епг Еауега Моеакггч СВСе (ВЧЧ/) !Ееекастгче ! !чпех РКЕЕАКАГтп!Ч~ ЕАчек Тор 1ауег 2.806 (35о6) 1.3670 МиЫ1е! ауег 3.870 (44о6) 1.3792 Болот 1ауег 6.!80 (59оуо) 1.4052 '!ч!о!оси!аг Ьго!оау Етаае СоС! В ачо!!айе ш оо!Ы топп ттогп оечега! сопппегси! тапиЕасвтсго. прес(а! Ее!о)ргпеп1 Нуродегт!с леед7е (27 Ваи8е) )2еугасГотеГег Гор!!ола0 А!йоиВЬ пот емеппа1, а гейастогпетег гь ехтгетпе1у шее! Гог еоптапп8 тЬе с)ели!у оЕ СоС1 ао!и!юла.
5упл8еь ГЗ сс, 5 сс, алд 5-70 сс) Е!ГГед чч!ГЬ 78-Ваи8е Ьоле таггочч Г70 слт) леедГех ТОЬегсиГт хупл8е (7 сс) Воед едй ал 78-Ваи8е Ьоле таггогч (70 ст) леедГе СепГг!Еоее8 апе! ГсоГог8 Иггаселгг(уи8е гогот алд ГиЬех Вес1стап Туре 70.1Тг ог 5огчаП 65.! 3 иг(ГЬ 5-гп1 ог 1О-тп1 ро!уа1!отег и!тгасептлри8е шЬеа (Вес)сгпап Г)и!с)с-5еа1 ог е9и!ча1епт). АЙЙ1!опа! КеарепЬ 5гер б оГ й!х ргоГосоl тес)и)тех йе геа8елгх Гидед гл Ргогосо! 72 ог 73 оГ й!а сЬаргег. МЕТНОО 1.
1)ае а 3-сс Ьуродегппс хуг(п8е ег)шррег) иг!й ап 18-Ваи8е Ъопе гпаггочч (10 стп) пеед1е Го ггапаГег 1.5 гп! оГ йе Гор 1ауег (35огЬ) СЕС! 8010!Еоп го а 5-т! ро1уа11огпег и11гасеп!пГи8е шЬе (ВесЬпап Е2шс)с-5еа1 ог ег)шча!епг). 2. ГЛе а 1-сс гиЬегси1тп вуг(п8е ес)и!рред чч(й ап 18-8аи8е Ьопе шаггочч (10 стп) пеес11е Го 1ауег 0.5 гп! оГ йе ш)ЕЫ1е !ауег (44оуо) СЕС! хо1игюп, сопСаппп8 йе р1аяпЫ 1ЭЬЕА, Епго йе Ъогготп оГ ЕЬе гиЬе илгlег йе сор!ауег хо)иг!оп. 3. ()Ее а 5-сс Ьурос1егппс хуг)п8е ег)и!ррес1 ъч(ГЬ ап 18-Ваи8е Ьопе тпаггоит (10 ст) пеед1е го тт!1 йе гиЬе Ьу 1ауепп8 ЕЬе Ьопогп 1ауег (59огЬ) СЕС! Ео!игюп илдег йе ппсЫ1е!ауег СхС1 501игюп.
4. Сепгг!Г08е йе хеа!ес) ШЬех а! 330,0008 (60,000 грп! тп а Весйпап Туре 70.1Т! го!от) Гог 5 Ьоигх. Ма1се апге ЕЬаг ГЬе чче18Ьгх оГ 10Ьех оррояге еасЬ оГЬег Еп ГЬе го!от аге ег)иа1. 5еа1 йе ГОЬех ассогд!п8 го йе тапиГасепгег*х Епхггис!(опя 1.70 СБаргег 1: р!агт!дх алд ТЬе!г с!Ее)ти!легг т Моlеси!аг С!огдп8 )3)аао1че 4.720 8 оГ СаС! !п 8 гп1 оЕ ТЕ (рН 8.0). Аг)!иаг йе чо1шпе то ехаст!ч 10 т!.
ТЬеп агЫ 120 01 оЕ 1О ш8)ш! етЬттпшп ЬготЫе. Гг!аао1че 0.8 8 оГ СаС1 ш ехаст)у 1 тп1 оГ йе стиг(е )314А ргерагапоп. ТЬеп асЫ 30 р! оГ ! 0 гп8)т! етйспшп ЬготЫе. ЬП1аьо)че !0.4 8 оЕСаС! ш 7 гп1 оГТЕ. Ас()иот ГЬе чо!ите то ехасг!у 10 пт1. ТЬеп асЫ 120 р! оГ 10 гп8)гп) ейЫшгп ЬтотЫе. Ргогосо! !1: Ригг(гсаг(оп ос С1огег( Ссгси(аг РЬЕА: Р!хеопс!ииоиг Сгаг(!епсг 1.71 ТЬе ые оЕ а сепспЕоае апг! тсог сараЫе оЕ Ь!8!сег ареег!а сап гег!псе сЬе сепспЕо8асюп сппе асП! ЕпгсЬег. рог ехаспр!е, сп а Ъ Тс90 госог т а ВесЬпап Х1-90, оп1у 20 пппшеа оЕ сепсп(п8абоп Ь пеесСесс.
5. СоПесс сЬе Ьапс( оЕ с1оаес) ссгси1аг Р)х!А (р!8иге 1-8, р. 1.б8)с а. с)ае а 21-8аице Ьурос!епп!с пеес)1е со та!се а япаП Ьо!е !и йе сор оЕ сЬе сиЬе со аПоп асг со епсег счЬеп ПиЫ !а сч!ЕЬс)сахчи. Ь. СагеЕиПу счсре йе оисан1е оЕ йе сиЬе сч!ЕЬ ейапо! со геиюче апу 8геаье ог ос1, апс1 сЬеп апасЬ а р!есе оЕ 8соссЬ Таре ог Типе саре со йе оисаЫе оЕ ЕЬе сиЬе. ТЬе саре чп11 асс аа а аеа! со гегСпсе 1еассь апег пеес11е рппсспге, с. АпасЬ а 5-1О-сс с(!ароааЫе ауг!08е со а асеп!е 18-8аи8е Ьурос)еппк пеес(!е апс( шаегс сЬе пеесПе (Ьече1ес1 яс)е ир) спсо ЕЬе сиЬе йгои8Ь йе саре сю ЕЬас ЕЬе ореп, Ьече1ес( а!Пе оЕ йе пеесПе !а роа!с!опес! )иас Ъе1оъч сЬе 1оъчег РЫА Ъапс! (с1оаес) с!гси1аг р1аяпЫ РЫА).
д. Я!осч!у сч!ЕЬс(гасч сЬе р1аяпЫ РЫА, саЫпц саге пос со с)!асигЪ йе иррег ч!асоиа Ьапс! оЕ сЬгоиюсюгпа! Р)х)А. То ачоЫ сопсапппабоп ъчсй сЬе сЬготоаогпа! РЬЕА, до пос ассегпрс со геточе ечегу ЫяЫе сгасе оЕ с1оаег) сггсп1аг р!аяпЫ РЬСА Егогп сЬе Вгагс!епс. боте тчеаб8асога рге(ег со гепюче сЬе пррег РЫА ЬапсС Ьеуоге гепсояп8 сЬе 1огчег с!оаесс сггсп1аг р1аатЫ РЬ!А Ьапсс. ТЫа сап Ье сг!с!су, аа сЬе чьсоы Ь!8Ь-то!есп!аг-сче!8Ьс сЬготоьота! РЫА сп сЬе пррег Ьапгс сап ептеьЬ йе с!овес( ссгсп!аг р1аяпЫ РЬСА апсс Вга8 и Егосп сЬе спЬе. 6. Кешоче есЬссПшп ЪсоспЫе Егоис йе РЫА аа с(еасг!Ъес! ш опе оЕ йе шесЬосЬ ргеаепсес! ш Ргогосо1 12 ог 13.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
