Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 176
Текст из файла (страница 176)
К!Ьолис)ео7!сЕех Ргераге а ю1шюп солса!п)п8 СТР, СТР, ап|1 АТР, еасЬ а| а сопсеп|гаиоп оГ 5 п|М. КХА, Еог ихе ах 61алгЕагг76 КЬ)А агап|)аг|Ь аге аупгЬеяхег) |и ч)|го Ьу |гапаспргюп оЕ |Ье арргорпа|е а|галс) оЕ а гесоп|Ь)пап| р!аа- |пЫ сопга|шп8 Е|Ь)А аес)иепсеа оЕ Епсегеаг апс) а Ъас|епорЬа8е рго|по|ег 1р!еаае аее СЬар|ег 9, Рго|осо! 6). Ву с1опш8 ап арргорпа|е ГгаВшепг оЕ |Ье Вепе оЕ |п|егеа|, В ь роаяЫе |о йаип8ш|Ь Ъу яке Ъепчееп аийепЬс шКНА |и |Ье |ее| аашр1е апг) йе я8па! Ггогп |Ье ВЫА агап|)агг) Ераре ес а!. 199 Ц.
Тех! КХА Ро!уЕА) ог соса! К)4А ргерагес) Ьу опе оЕ |Ье шегЬо|)в г)еасг)Ьес) ш Ргососо1| 1 гЬ|оиВЬ 4 оЕ йь сЬаргег. !и аогпе саге|, |геа|шеп| оЕ |о|а! ВЫА |ч)|Ь К)4аае-Ггее Е|Наве п|ау ипргоче |Ье ассшасу оЕ ВРЕаае рго|ес|юп ЕТ)иоп е| а1. 1997). 77ТР ЛОО )гм) РгоЬе5 К!ЬоргоЬе ТЬе пЬоргоЬе ь ргерагег) Ы 5|ера 1-7 оЕ й|а рго|осо1. Кае!!оас6че Согпроипе!5 1а=гаР)иТ 170 тС!Етl, 800 С|1ттоlе) <! > !а-||Р)УТР ыЬе гайо!аЬе1 оГ сЬо)се Ьесаиае и Ь арес!Вс со КЫА. Но|чечег, ао|пе |пче|ВВа|ога ргеЕег го |ье !а-"Р)СТР Ьесагье Ьас|епорЬа8е 5Р6 ВЬ)А ро1ушегаае го1ега|еа!о|ч сопсеп|гаиопа оЕ |Ыа пЬопис!ео|Ые 4118ЬВу Ъепег |Ьап || |о!ега|еа !огч сопсеп|га|юпа оЕ апу оГ |Ье о|Ьег |Ьгее. прес!а! ЕЕ!и!ргпеп$ МаГег ЬаГЬх ргеае7 Го 30 С, 85 С, апс7 95 С алс1 ЕЬе арргорла|е аппеа1!па ГетрегаГиге Ер1еахе хее 57ер 7 0).
РУЬаГтап ЗММ Г!17ег рарег Еог ег7и!на!ел!1 АГЫЖопа! КеацепЬ 57ер 7 оГ ГЬгЬ ргогосо1 тау гегЕигге ЕИе геадеп18 ЪЕег7 |и СЬаргег 8, Ргогосо! 7. 57ер 7 оГ ГЫх ргоЕосо! гес7и!гех ЕЬе геаееп76 116!ее! т Ргогосо) 70 оГ ЕЬ!х сЬаргег. 770 СЬартег 7: Ехтгасттоп, Рип(гсаттоп, апг( Апа!уьть от' тй)г(А)тот Еи1гагуопс Се1Ь МЕТНОО Ргерагабоп 01 ссапс!опс!у ЬаЬе!ет! Япц!е-51гапт!ее! тс)ЧА РгоЬе 1. Ргераге сЬе 1!пеапхег! сешр1асе Р!з(А. Театр!атея Гог тп зато тгапьспрЬоп сап Ье Вепегатег( Ъу с!оп!п8 йе 0Ь(А ьегтоепсе оГ штегеьт г(отзпьтгеаш !гого а ЪастепорЬа8е ргопютег ог Ъу ашр!т(угп8 тЬе 0ГГА оГ штегея Ьу РСК шш8 о!т8опос!еотЫе ргипеп йат соптагп а ЬастепорЬа8е ргопютег.
ТО РкеРАке темрсАте ГВОм РЕА5мс0 енчА Ь!пеапке 5-20 ГГВ оГ р1аыпЫ РХА Ьу ЙВеьСюп АСЬ а ГтчеГо!6 ехсеьь оГ ап арргорпаСе геяспсс!оп епкуше сЬас с!еачея епЬег тч!сЬ(п сЬе с1опет) РХА яег)пепсе ог с)отчпясгеатп Ггош сЬе Р)з(А яет)пепсе. ТЬе йьсапсе Гготп сЬе рготпотег со сЬе пезч1у сгеасес( сеппшпь ьЬоп1В Ье 200 — 400 Ьр. Ма)те ьпге пот со пье ап ептутпе сЬас ьерагатеь сЬе ргопюсег Ггош сЬе ьеЧпепсе оГ шсегеяс. Весапье ЪассепорЬаВе-епсог!ег! КС4А ро1ушегаьеь шау шптасе сгапяспрсюп ас 3'-ргоспк)ш8 сегппш, сЬооье а геяспссюп епгутпе йас Вепегасеь а Ыппс сегппппь ог а 5' ехсепыоп. Ас йе епт) оГ сЬе ЙВеьсюп, апа)ухе ап а!!г)пос (-200 пц) оГ сЬе геассюп Ъу аВагоье Ве! е!ессгорЬогеяя Хо стасе оГ стгсп1аг р1аяпЫ РЬ(А ьЬопЫ Ъе ЫяЫе.
1Г песеяяагу, асЫ тпоте геьспссюп епкутпе апс) сопс)птте т!18еястоп ппс(1 по тоге стгсп1ат р!аяпЫ Р)з)А сап Ъе т1есессед. РппГу сЬе!!пеаг 0Ь(А Ъу ехсгаспп8 стч(се зчссЬ РЬепоЬсЫогоГопп апс1 йеп гесочег сЬе РХА Ъу ясапс)агт! Ргес!Рпасюп зз(сЬ есЬапо1. АГсег зчаяЬ(п8 сЬе ргес(рпате зч(сЬ 70% еСЬапо!, йььо!че йе РЬ(А ш ТЕ (РН 7.6) ат а сопсептгабоп оГ 1 СтВГ(т1. СЧЬеп ргесгргтаВп8 ьгоаВ агпоштп (<с РВ) оГ!шеаг р!аьшЫ 0ЬСЛ, 8!усоВеп В тЬе рте(еггег! сагпег, япсе гт г(оеь пот штеггеге тзттЬ тгапьспрЬоп геастюпь. ТО РкеРАке темрсАте ВУ Амрпр!сАтсоь! ОГ тАксет 0(чА Саггу опс РСК со ьупйеяхе т!опЫе-ьсгапг)ет) Р!з)А сетпр1асеь, 100-400 Ьр ш 1еп8сЬ, (5сЬоъча1тег апт) 5опппег 1989; Ва1еь ет а1. 1993; Раль ет а!.
1997; р1еаье яее СЬартег 8, Ргососо1 ! Гог т(еса!!я). ТЬе тешр! ате ьЬоп!4 Ье еЬЬег!гпеагггегт р!аяпЫ 0)зА ог а 0ХА Гга8шепт епсогпп8 тЬе яецоепсе оГ тпсегеьт. Етйег опе ог ЪотЬ оГ тЬе о!!Вопит!еот!г(е рпшегь аге г)ея!Впег( го соптагп йе сопьепьпя яечоепсе оГ а ЪастегторЬаде ргошотег ат тЬегг 5' тепшш (р1еаье ьее сЬе штоппатгоп рапе! оп РкОмОтек 5е(20емсе5 кесосмхео Ву ВАстексорнАсе-емсооео кйА РОй'- МЕКА5Е5).
Апгр!гВсасюп тп РСК уге1гЬ г!ооЫе-ягапг!ег! 0ЬГА Гга8шепть саггуш8 ЬастегюрЬа8е ргопютегя ат опе ог ЪотЬ епаь. Апа1ухе сЬе ргот(псся оГ сЬе РСК Ьу е)ессгорЬотеяь сЬгопВЬ ап а8агоье ог а ро!уасгу1атпЫе Ве) со епяпге сЬас а Р)з(А Гга8шепс оГ йе арргорпасе я(ке Ьая Ьееп ашр11Втет(. РппГу сЬе 1шеаг ашр!ГВтсас(оп ргос1псс Ъу ехсгасс(п8 сичсе тч(сЬ РЬепоЬсЫотосопп апс1 сЬеп гесочег сЬе РЬ(А Ъу ясапт1агт1 ргес(р)сат(оп тлсЬ еСЬапо1. АГсег тчаяЬ!п8 зч(сЬ 70% еСЬапо1, г)тььо!че йе РХА тп ТЕ (РН 7.6) ат а сопсептгатюп оГ 1 Гт8/ГГ1. 7.72 СЬаргег 7: Ехсгасс(оп, Риг(угсаг(оп, аидАпа!уз(з аутКМА~гот ЕиЕасуоис Се((з Ро!!осч)и8 сЬе спзсгиспопз 8(чеп ш 5(ерз 8-16 оЕ Ргососо! 10, риНЕу сЬе ргоЪе Ьу е1ес1горЬогегдз исдп8 (Ье ргеч(оиз!у ргерагед ро!уасгу!атсде/8 м игеа Ве1.
Н(ИЬ-зресгЕгс-асс(н(су ргоЬез зЬоц1д Ье цзед чдсмп а Еек дауа оЕ зупсЬеяз со ачосд ргоЫепь самед Ьу гайосЬепцса! дашаИе со сЬе КХА. НУЬРсйка6ОП О1 $4)х(А5 аП($ ИДЕ56ОП ОЕ НУЬСТЕЬ 14$11$1 сз)ЬОППС!Еа5Е5 СоспЪспе еасЬ оЕ (Ье сезс КХАз апд КХА зсапс1агдз цг)сЬ сЬе ЫЬоргоЪе (2 х 10з со 10 х 10' срт, 0.1 — 05 п8) (р1еазе зее 1Ье рапе! оп 5ЕТТ1ХС ()Р НУВИО17АТ1ОХ5 РОК ИВОХ()СЕЕАИЕ РКОТЕСТ(ОХ А55АУ5).
Адд 0.1 но!ите оЕ 3 м зойшп асесасе (РН 5.2) апд 2.5 чо!шиез оЕ ке-со1д е(Ьапо!. 5соге сЬе пихсигез Еог 10 пиписез а1 — 20'С апг$1Ьеи гесочег (Ье КХАз Ьу сеп(г)йлВаС(оп а1 спахипши зреес$ Еог 10 пипиСез аС 4'С ш а писгоЕиВе. Ъ(газЬ СЬе ре)1е1 ш 75% е1Ьапо1. СагеЕи)!у геточе а)1 оЕ (Ье есЬапо! аид зсоге сЬе ре1!ес ас гоопс сегпрегасиге ипс И сЬе 1азс ч(з(Ые сгасез оЕ есЬаио! Ьаче ечарога1ес1. $3о пос аПозч сЬе реИес со Ьесопге г$еяссасег$, осЬеплзе Ь кИ! Ье йЕИсц1с со йыо1че.
Л11 геасдопз зЬои!и сопсагп йе загпе апюцпс оЕ КХА со епзцге йас йИезиоп кЬЬ пЬопцс1еазе В сагпед ош цпдег пеаг Ыепска! сопйсюпз. 1Е песеяагу, ад)ия ЕЬе агпоцпс о( КХА сп йе ЬуЬийаадоп геассюпз Ъу адйп8 сагпег КХА. То В цап!((у сЬе саг8ес зе9иепсез (п сЬе ргерагасюпз оЕ КХА ипдег сея, зес цр а зепез о( ЬуЬпйгаиоп геассюпз сопсагп(пВ а сопзсапс апгоцпс оЕ гайо1аЬе!ег$ ргоЬе, а сопзсапс апюипс о( сопсго! И4Л (г.е., КХА )гпоъп со 1ас1с ЕЬе сагИес зе9иепсез), апд апюцпь (1 ЕИ со 100 РИ) оЕ а яапдагс$ ргерагасюп оЕ КХА зупсЬез(сед гп ч(сго; 1О Р В о(соса! сеИц!аг КХА чдИ сопса(п 10 ЕВ со 1 РИ оЕ а гаге шКХЛ апд -300 РИ оЕ а шодегасе1у аЪипдапс шКХА ысЬ аз В-асс(п ог СЛР)3Н.
Т)(ззо!че сЬе КХАз сп 30 р1 оЕ ЬуЬг(д(гас(оп ЪиЕЕег. Рсрессе сЬе зо)ис(оп ир апд донни пшиегоиз сииез со епзиге сЬас сЬе ре!1ес Ы сопср!есе!у д(ззо)чед. !с гз ойеп ййкиЬ со оЬсагп сошр!есе йьо!шюп оЕ сЬе реИес оЕ пис1ек ас(дз гп ЬуЬг(д(гас(оп Ьцйег.
ТЬЬ ргоЫепг ь ехасегЬасед !Е сЬе реИес ь г(пед цпг1ег часишп ог зсогед !п а деяссасог. 5опгесшсез 16е реИес сап Ье д)ззо!чед Ьу а сопсЬспасюп оЕ ч(8огоцз рсресдп8 апгс Ьеас(пИ со 60 С. !Е д(0)сц!с(ез регызс, ог сЕ е9шча!епс я8па!з аге пос оЪсагпед Сгопг дцрИсасе зашр!ез оЕ КХЛ, сЬе 1оИочдп8 ргоседцге В гесошшепдед: (0 Оиш1че сЬе КХА реИес (Егош 5сер 8) ш 40-50 Р) оЕ Н О. Ечарогасе сЬе зашр!е гц а госагу ечарогасог ипсс! (с ь ) мс дгу, (И) Адд 30 сг! о( ЬуЬийгадоп Ьц((ег. ТЬе Ьудгасед реИес зЬоц!д Ио (псо зо1шюп Ки(с)ду апд еая1у апг$ усе!д гергодисгЫе геш1ся 5ЕТТ1ХС ОР НУВК)О!7АТ!ОМ5 ЕОК К1ВОХ()СЕЕАВЕ РКОТЕСТ1ОМ АВВАУ5 ТЬе агпоипс оЕ ип(аЬе)ед сезс КХА гес)шгед с(ерепдз оп сЬе аЬипг$апсе о( ЕЬе зег)иепсез оЕ сгдегезс апс( СЬе зресИ)с асбниу о( СЬе гасИо(аЬе(ед согпр$егпепгагу КХЯ Ве(оге егпЬаг(с)п8 оп (аг8е-зса)е ехрепц гпепЬ, !С В адпзаЫе Со саггу оиг ргеИгп)пасу ехреппсегиз Со езгаЫ)зЬ СЬе гап8е о( сопсепггадогь о( КХАз 1Ьа1 у)е(д ассер1аЫе гизи)Ь.
Ъ(4СЬ КХА ргоЬез СЬа1 Ьаче Ьееп гасйо(аЬе)ес( 1о Ь)ВЬ зрес)Ис асгм'- су (>10з сргпги8), 10 РВ о( соса! КХА )з изиаИу зиИ)с)еп( 1о аИош с$есес6оп о( псКХА зрес)ез Иса( аге ргезеп1 аС СЬе )ене! о( 1-5 сор(ез!сеИ. То дегесг зег(иепсез ргезепг )п )оснег агпоипЬ (е.8., 'в КХА ехсгассег! (гипс Ьесего8епеом рори)аиопз о( сеИз), ир 1о 150 и8 о( КХА спау Ье изес! )п а 30-сг! ЬуЬгмсеаиоп геасдоп. Еог еазе оЕ псапсри)ас1оп сп зиЬзегулепс спера, $1 ь адчзаЫе со $сеер сЬе ЬуЬпгйхаИоп чо(ише 1о 30 Сс! ог (езз.
6 геаВепгз аге )п зЬогг зирр)у, СЬе ЬуЬг)д)лаС(оп геасгюпз сап Ье зса(ес$ доснп Со 10 и). 'нНЬеп согп ран п8 д(Е(егепс ргерагасюпа о( КХА, гпа)се зи ге ЕЬас аИ о( сЬе геас6опз сопсасп сЬе зяие апсоипс о( КХА. )п сЫычау, й8ейюп вчсЬ КХазе ь сагпед ои1 ипдег з(апдагд сопд)с)опз. И песеззяу, ад)изС 1Ье апюипС оЕ КХА сп СЬе ЬуЬпйгаиоп геас6опз Ьу адд(пВ сагдег КХЯ ОзиаИу, 1 х 10' со 5 х 10' срт о( ргоЬе аге мед рег ЬуЬпйхаиоп геасдоп. А з(п8)е (п ч1го 1гапзсприоп геас6оп изРй ЬасгепорЬа8е ОХА-дерепдеп1 КХА ро(угпегазе Вепега1ез епоиВЬ ргоЬе ( — 2 рпю(ез) Еог гпоге сЬап 200 ЬуЬг)д(ха()оп геассюпз.
Носнечег, Ьесаизе Ьас(с8гоипс! )псгеазез аз псоге ргоЬе 'ь аддед Со СЬе ЬуЬпд)айаг)оп геас6оп, адд оп)у епоиВЬ ргоЬе Со асйече а згпаИ пю)аг ехсезя ТЬь апюипс 'ь изиа)!у десеггп(пес$ епср)псаИу Ьу КХазе д(8езс)оп о( а зепез о( ЬуЬпд)хасюп гпедигез сои!а)п(п8 д)Е(егепс гадоз о( ргоЬе КХА со саг8ес КХЯ И песеззасу, 1Ье зузсегп сап Ье саИЬга1ед Ьу зес, дп8 ир а зепез оЕ соп1го( геасбопз сопидгап8 а сопзсапс агпоип1 о( гагИо)аЬе(ес! КХА апс! )псгеаз)п8 агпоипь о( ип1аЬе)ед КХА сгапзспЬес) )п чсго Егопс (Ье оррсь(се пгапс$ о( ап арргорпасе с(оиЫе-пгапс)- ег! ОХА 1егпр)а1е (р)еазе зее СЬар1ег 9, Ргоиэсо! 6). !псиЪаге 1Ье ЬуЬНйгапоп пнхгиге Еог 10 пипи!ез аг 85"С со гЕепагиге йе КЫАз.
Е201сИу !гапзЕег йе ЬуЬНйха!юп пнхгиге !о ап 1псиЬагог ог ъчагег Ьа!Ь зе! а! !Ье аппеа!шц !ешрегагиге. 1псиЪа!е 1Ье пнхгиге Еог 8 — 12 Ьоигз. ТЛе органа! гегпрегагиге Еог аппеа!тпц чапез Егози К14А го КЫА, ргезшпаЫу ПерепгПпц оп зисЛ Еассогз аз 69С сопгепс апт! Ргорепяту то Еопп зесопг1агу зтгисшгез. 1п пюзг сазез, затицасгогу гези1ь аге оЪта1пег! иЬеп гЛе КЕТА 1з аписа!ег1 аг 45 — 50 С. Органа! соптППопз Еог йе ЛуЬпхПхатюп оЕ зрестбс ргоЬез сап Ъе сяаЫВЬед Ъу гесопзтгистюп ехрептпепгз, тп гчЛкЛ йе гагПо1аЬе!ед ргоЬе Ь ЛуЬптПхей ат гетпретатпгез гапцтпц Ьеттчееп 25'С апг! 05 С, го ип!аЬе1ет! КХА ггапзсг1Ьет! тп а!го Поти йе оррояге зггапт! оЕ ап арргорпаге т!оиЫе-зггапг$ег$ 15!4А теитр!ате !р1еазе зее СЛартег 9, Рготосо1 а; р!сазе а1ю зее йе рапе1 оп 5ЕТТ!ЫС 12Р НтУВК101ХАТ!ОХ5 ЕОК К!ВОЫ11СЕЕА5Е РКОТЕСТ!ОЫ А55АУ5Л 10.
Соо! ЕЬе ЬуЪг!г1!хат!оп пнх!иге го гоош !егпрегагиге, апг1 асЫ 300 !г! оЕ КЫазе сПцезпоп пнх!иге. Ег!Пезг ЕЬе ЬуЬг!с1!гаг!оп геасгюп Еог 60 пипи!ез а! 30"С. ТЛе типе апг! гептретагше оЕ гЛе йцезбоп тчКЛ К!сазе зЛои1г! Ье г!егегиипег1 ептр1псаПу 1НЬе яцпа!-го-поае гаио т!егесгег! айег аигогаг1юцгарЛу Ь ипассергаЫе. 1п ютпе сазез, йе зрест6сиу апг! зепяПчтгу оЕ г!егесгюп сап Ье тптрточец Ъу сооПпц гЬе ЛуЬгЫ1хаПоп геасиоп оп ке Еог 10 — 20 пбпитез Ъеуоге гЬе асЫ!тюп оЕ тЬе КЫазе т!1цезгюп пихтше. ТЫз сооПпц тпау зтаЪт!Ые йе епг!з оЕ КЕ4А-КЫА ЬуЬгЫз. АгЫ 20 !г! оЕ 10% ЯЭ5 апс1 10 Ег! оЕ 10 шцт'ш! Ргоге1пазе К го з!ор йе геас!юп.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
