Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 175
Текст из файла (страница 175)
1997) аупсЬес!с ъепаеасгапс$ сетр1асев сЬас сап Ье йхбп8шаЬе6 Пот сЬе епбо8епоиа саг8ес Ксъ)А Ьу яхе. ° Оиапс$аагсче ИТ-РСК !Р1еаае аее СЬарсег 8, Ргососо! $5) оЕЕел аечега1 аиЬасапс!а! адчапса8еа очес осЬег тесЬоъ)я ТЬе Ксъ)А пеес1 пос Ье Ьс8Иу рипПед, оп!у япаП апюипь оЕ сепср!асе аге пеейей апъ$ сЬе тейос$)а Еаг гпоге зепя6че сЬап погсЬегп ЬуЬг!6!гас!оп ог НЪопис1еаае ргосессюп ааъауя КТ-РСК 1а йе оп!у тесЬос1 сЬас 1п сЬеогу !а сараЫе оЕ Песесс!п8 а яп8!е сору оЕ а Саг8еС хеоиепсе !п а ргерагабоп оЕ К)ъ)А. !и ргас6се, Ьоъчечег, йь 1ече1 оЕ аепя6чКу ь Ьеуопс1 геасЬ, пюя1у Ьесаиае оЕ псеЕПс!епс)еа спЬегепс сп йе Пгас аса8е оЕ йе геасс!оп — сЬе сопчегяоп оЕ К)ъ)А со $))ь)А.
ТЬе аиЬзес)иепс агпрППсасюп асер, ъчЬ!сЬ епс1оиь с)иапс!сас!че РСК ъчсй якЬ ехс!шясе аепябчКу, сап а!ао Ье $ь АсЫПеа' ЬееЬ 5таП 6$ЕЕегепсеа !п сЬе еЕЕсс!есссу оЕ атрППсасюп Ьесъчееп аатр1еа сап с1гатаскаПу аЕЕесс сЬе хсгеп8сЬ оЕ сЬе я8па1 оЬсашей ТЬеае ргоЫепь сап Ье пип!т)ген Ьис печег сотр!есе!у е!пп)пасеь$ Ьу йе иае оЕ тсегпа! сои!го!а т йе РСК.
!п ашптагу, ъ)иапс)са6че КТ-РСК ь йе Ьеас ачас1аЫе гпесЬос1 со теааиге гаге сгапаспрь ис япаП-аса1е ргерагассопа оЕ тК)ъ)А. Ноъчечег, НЬопис!еаае ргосесссоп ь ргеЕеггес1 ъчЬепечег сЬе апюипс оЕ саг8ес Ксъ)А ЕаПа ъч!сЫп сЬе гап8е оЕ с)есесс!оп, ятр1у Ьесаиае оЕ сЬе!спеагКу оЕ йе аааау. $ъ)огсЬегп ЬуЪпйхасюп гетапь еасЬескаПу сЬе тоя р1еаяп8 оЕ сЬе сЬгее сесЬп!с)иея ИВО!ъ)с)С$.ЕАЬЕЬ $)ЬЕ0 $!ъ) В!ВО)ъ)1.)С$.ЕАЬЕ РКОТЕСТ$О)Ч А%АЙ ТЬе ог18)па1 пЬопис1еаае ргосесс!оп тесЬос$ (Ме1соп ес а1. !984) ге1сес$ ехс1ияче!у оп рапсгеаск К)ъ)аае $К)ъ)аае А) со с$е8гас1е йе а!п8!е-асгапс)ес$ К)ъ)А гегпа!тп8 айег йе ЬуЬпйхасюп асер. Ноъчечег, тоге сотр1есе 6!Пеасюп тау Ъе оЪса!пес1 ъч)сЬ а пихсиге оЕ К)ъ)аде А ап6 Ксъ)ахе Т1 ('ъч!псег ес а!.
1985), съчо япц!е-хсгапд-хрес)Есс епс1опЬопис1еааеь ъчКЬ 61ЕЕегепс арес1Есс)с!ея Рто|осо! 11| Вйопис!еа|е Ртогесдои| Марртц КИА гч(гЬ РНЬопис!еа|е аид Над(о1аЬе!ед МХА РтоЬе| 7.67 Вочйпе рапсгеа6с НЬопис(еаае А 8Ьо|ча а 8|гопц ргеЕегепсе Еог руг!ш!й(пе Ьааеа а| йе 3' роя6оп оЕ |Ье чп1пегаЫе рЬоьрЬой!еагег Ьоп|1 апй а ргеЕегепсе Еог риппе Ьааеа а| |Ье 5' роя6оп (Еог геч(ечт, р1еаае аее Хоцпеа е| а(. !995).
ТЬе епгуше Ьаа а с1еаг ргеЕегепсе Еог ро1упис(ео|Ые 80Ьягагеа га|Ьег |Ьап о)|цопис1ео|Ые аиЬ8(га(ея рйЪоппс1еаае Т1 оЕ |Ье 81ппе гпо1й Агретц!1(иг отчие (ъчЫсЬ |8 паей |и )арап ш |Ье Ьгечч(пц оЕ аа(се) с1еачеа чд|Ь Ь!ВЬ арес!Вс!(у |Ье 5'-РЬ08- рЬой!еяег Ьопй оЕ СрХ ае|)пепси оЕ 8!пц1е-8(гапйей ВХА (Еог геч(е|ч, р1еаае аее 5|еуаег| !997). Моа( НЪопис1еаае рго|есбоп ааааа поъчайауа аге сагпес1 ои| |ч(ГЬ а сошЪ|па6оп оЕ ЕЬеае Ичо епгушеа, |чЫсЬ еЕВс(епду с(еаче шоя япц!е-8(гапйей гец!опа оЕ ВХА |о а иих|пге оЕгпопо- апй о!!цоппс1ео(Ыея ЪЪоънечег, йеу Ьаче ||чо й!8айчап(ацея ТЬе е1шйпабоп оЕ ВХаае ас||ч(|у ас |Ье епй оЕ |Ье й(цеабоп гес(и!геа йех(гоу(пц |Ье епхугпе ъч((Ь рго(е(пахе К ш |Ье ргеаепсе оЕ ЯЭ5, апй |Ье сошЬ!па|юп оЕ ВХахе А апй Т! ппйег яапйагй й(цеабоп сопй!г!опа |пау п!сЬ А;У-г!сЬ гец!опе оЕ йоиЫе-8(гапйей ВХА. ЪЧЬеп апа(уг|пц ВХАв псЬ ги А|() аег)иепсеь (|.е., >6594 А+()), и |8 Ьеаг со пае оп)у ВХаае Т(, ъчЬкЬ саппо| а(гас)с |Ье 5'-рЬоарЬой!еа(ег Ьопйа оЕ АрХ ог ()РХ геяйпеа (п япц1е-ягапйей ВХА.
Моя !пчеаг(цагин до по| Впй (Ьеае й(еайчапсацеа |о Ъе шсарасба|шц. Хечег(Ье!е88, |Ьеу сап сег|а!п1у Ье Ъо(Ьегаогпе апй, 1ог |Ьа| геааоп, о|Ьег япц(е- 8(гапй-арес(Е|с ВХааеа Ьаче Ьееп паед Егош 6ше |о |иие |п НЪопис1еаае рго|ес6оп аааауя ВХаае Т2, ччЬ|сЬ с!еачеа 3' оЕ а11 Еоиг НЬоппс1ео|Ыея Ъш 8(гопц1у ргеЕега со Ыеаче 3' со А геа!йиеа (()сЬЫег апд Ецапи' 1967), Ьав Ъееп паей !и НЪопис1еаае рго|ес|юп аааауа (е.ц., р1еахе аее цассошаппо е| а1. 1992).
1п айй!(!оп |о |ь Ьгоай хрес!ВсВу, ВХаае Т2 Ьаз |Ье айчап|аце оЕ Ье(пц еая(у !пас6ча|ей а| йе епй оЕ йе й(цех((ои репой. А ша)ог й!8айчапгаце, Ьочтечег, га |Ье ЬгцЬ соя оЕ Т2. Весепду, ВХаае 1 оЕ Е. со!Ь ехргеааей Егогп |Ье с1опей цеие, Ьаа Ьесоп|е соиииегс|ацу ача!1- аЫе (ВХаае ОХЕ, Ргои|еца).
ВХазе ОХЕ с!еачеа 3' |о а11 Еоиг Ъааеа чч((Ь по ргеЕегепсе апй 18 (пасбчасе|1 Ъу Я.б, е1ии(па6пц |Ье пеед Еог огцапк ехггасдопа ЪеЕоге це( е1ес|горЬогеяя 1!)се ВХаае Т2, ВХаае ОХЕ 18 |иисЬ |иоге ехрепяче ЕЬап а иих|иге оЕ ВХааез А апй Т1. Рог а11 |уреа оЕ ВХааея |Ье ейк(еису оЕ й!цеаг!пц япц1е-ягапйей ВХА апй |Ье арес(Всиу оЕ йе геас|юп аге а Еипсгюп оЕ епгугпе сопсепгга6оп. ТЬе репа1|у Еог ияпц |оо ишсЬ еихуше 18 а 1088 оЕ арес(ВсЬу, ге8016пц |и раг6а1 й(цеаг!оп оЕ йоиЫе-ягапйей ВХА. Тоо 1!|6е епхуше, ои |Ье о|Ьег Ьапй, гехи)п ш а Еа|(иге |о йецгайе япц1е-8(гапйей ВХА. МАТЕК1АЬ5 ,й, !МРОКТАХТ Ртерате аП теацеиь иьед )и (Ь(ь рто|осо! |М|Ь ОЕРС-|теа|ей Н,О (р(еаье атее йе (и(отп|ацоп рапе! ои НОЪЧ ТО ЪЧ(Х ТНЕ ВАТТЕЕ |67(ТН КХА88).
СА()Т!ОХ: Р!еаье аее Арреид!х 12 Еог арргорпа(е Ьапд!|пц оЕ и|а(епа18 шаг(еед |ч!!Ь <! >. ВоЕЕегь ап(1 5о16Е1оп8 Р!еаае аее Аррепй!х 1 Еог сотроиеи(8 оЕ 8(ос(» 80!06008, Ьи((его, аий геацеипи О!!и(е 8(оскс |о (Ье арргорпа(е ччог(е!иц соисеи(та(!оп. Аттпотйитп асега(е (70 м) <(> 0|йюйте||оl Ю.2 м) Ейапо( НуЬт(д(хаг(оп ЬиПет (Еот ВХА) 40 игм Р!РЕ8 (РН 6.8) | п|м ЕРТА (РН 8.0) 0.4 М ХаС! 809а детоптае|! |опиат|де <! > ()ье Йе д(еос$(иш ьаЬ о(Р)РЕ8 (р(регат(пе-)ЧХ'-Ь(е!2-ейапе|и!(опте аскЦ) апй ад)пег Йе РН |ч(гЫ и НС!. 768 Сйартег 7: Ехласт(оп, Риг!Егсат)оп, алг)Ала!уз(хо)тИТА)тот Еи)тагуоис Се1Ь Рйело1:сЫогоЕогт Г)т7, чй0 <1> КНА де)-!оатЕ!лд ЬОЕЕег 959ч т1еюпаед ЕогшапгЫе <! > 0.02596 (зч(ч) ЬгопюрЬепо! Ыие 0.025ча (зчГч) ху)епе суапо! РР 5 шм ЕЕ)ТА (РН 8.0) 0 0259о (зч)ч) 5()5 РигсЬазе а спзи!!ег1 с1еюп)аег1 ргерагатюп оЕ ЕолпатпЫе апс1 азоте тп япаБ а))т)иота ипг)ег пттго8еп ат -20 С.
А)тегпаВче!у, геа8епг-Всат)е ЕоппагпЫе сап Ье аеюпьед аз г)езсг!Ъет) тп Аррепспх 1. 5735 (70;4 ийр 5ос)!ит асегате ГЗ м, рН 5.2) ТЕ ГрН 7.6) 70х Тгалзслрпол ЬОЕЕег 0.4 м Тлз-С! (РН 7.5) 0.1 М ЫаС) 60 пзм МВС1 20 тпм зреггпЫ|пе 5)оге )п а))г)иота ат — 20'С. Тг!сЫогоасег!с ас)тЕ (7 гч алсЕ 7 07ч ТСА) <1> И)иге 10096 атос)с ш1иВоп 1710 апг) 17100 )изт Ье(оге ые, СЬт11 ЕЬе ччогЫп8 ш1итюпз ш ке.
Епууепе5 апд В))йег5 Вас)ег(орйаде-елсотЕес) Е))з)А-т)ерелсЕелг КА)А ро!утегазез ТЗ, 5Р6, ог Т7, т)ерепдш8 оп йе р1аяпЫ чессог апе) оп йе зтгапг) оЕ 77ХА то Ье ггапкпЬей )Е, аз ь оугеп йе сазе, )Ье ЬастегюрЬа8е ВХА ро!утпегазе зирр1ге6 Ьу йе лгали(асшгег ь ЫВЫу сопсептгатей ргераге ап арргорлате ВаиВоп оЕ йе ептугпе )п ро1угпегазе 61)итюп Ъи((ег. Е)7з)азе ! Г7 тфт), КГз)азе Егее ралсгеапс 07з)азе) ТЬь епхугпе Ь ача)!аЫе Егопг зечега) пгапиЕасиггегз (е.8., ВО) Егопт Рготпе8а). Ро!утегазе сЕЕ!иг(ол ЬОЕЕег Ргераге зо! шюп ЕгезЬ Еог еасЬ ые. РгоЕешазе К Г70 тдlт0 Рготет Глй!Ь!Еог оЕ Кмазе, сЬИ! !и тсе ТЬезе тпЬтЪттогз аге ю!6 Ьу зечета) гпапиЕастигегз ипг)ег чапоиз тгаг)е пашез (е.8., ВЫАяп, Ргопге8а; Рппге )пЫЬ|тог, 5 Роше — з3 Ролзе). Рог гпоге т)еса))з, р1еазе зее тЬе штоппайоп рапе1 оп )М Н)В! ТОВ5 Ор ЙЧА565. К(з)азе с)(дез)(ол т(х1иге 300 пзм ЫаС! 10 пгм ТггяС! (РН 7.4) 5 шм ЕЕГТА (РН 7.5) 40 08йп) ЙЫазе А 2 08йп) ВЫазе Т! Ргераге 1О тп8йп! пЬопис!еазе А (Ьочше рапсгеаЬс В)з)азе) )п ) 0 тпм Тгь-С! (РН 7.5), 15 шм ЫаС).
Ргераге ! шВйп1 лЬопис!еазе Т1 ш 10 шм Тпз-С1 (РН 7.5), 15 гпм ХаС!, АсЫ )Ье ВЫазез ЕгезЬ еасЬ Вше, )ия Ъе(оге 618езт)оп; 300 01 оЕ сВВезВоп шгхшге ь гет)и)гес) Еог еасЬ ЙВезтюп. Се!5 Оелагиг!лц ро!уасгу!ат!т)е де! <1> сол)а!л!лд д м игеа рог июзт 5'- апг) 3'-епг) тпаррш8 ехреошепгя а йепатиг)п8 8е! сошрозет) оЕ 59ч ог 696 ро)уасгу)аш!6е апт1 солта)п)п8 8 м игеа пке!у гезоЬез рготестет1 РЫА Ега8шептз, А турка! Ве! ь 15 пип йкЫ Нозчечег, "йш" ог "зег)иепсш8" Ве1з (О 4-тпгп йк1 шея) сап а1ш Ье ыеа (р1еазе зее СЬарсег 12).
1Е тйп Ве1з аге ше6 со геш1че рготессет) РЫА Ега8шептз, Ь Ь ыиа1!у пот песеяагу то 6х гЬе Ве! ш сгкЫогоасегтс асЫ (ТСА), аз т)езсг)Ъеа ш 5герз 22-24, Ье(оге г)гуш8 йе Ве). Бхтп8 зЬагрепз апг) шсгеазез ЕЬе гезо!шюп оЕ тЬтс)тег Ве!з. 1п гпапу сазез, а пишрготетп Ве! аррагагиз (е.8., Вю-)Ъи) МтшРготеап) (13 сгп х 13 спг х 1 пип) сап Ъе изес1 ЬотЬ со ргераге йе гаспо1аЬе1еа яп81е-зтгапс)ет1 РЫА ог Ргогосо! 11: К!Ьопис!еазе Ргогесиоп; МаррЕпц КХА |и!ГЬ К!Балис!еаге апгГ Ка|ЕЕо!аЬе!ес7 КХА РгоЬех 7.69 КЫА ргоЬе апг) со апа!уге йе ргос)исса оЕ пЬопис!еаае пис)еаае й8еяюп.
ТаЫе 7-6 Ерго|осо! 10) |Ьочь йе регсеп|а8е оГ ро!уасгу1ашЫе иге|7 |о рипЕу РЫА ЕгаВшепь оГ чагю|ь яхея ТаЫе 7-7 Ерго|осо! 10) |Ьо|ча йе ехресгег) пюЬ~!|Веа оГ ггасЫп8 г)уеа оп йеае ВеЬ. ТЬе гпейо|1 мед |о ргераге |Ье ро1уасгу!а|пЫе 861 ь г)еасг!Ьес) |и Вгер 1 оЕ Рго|осо1 10. ТЬе ргерагайоп оГ 1аг8ег Ве!а ь г)еасг!Ьег) ш СЬаргег !2, Рго|осо1 8. йис!е!с Ас!е!5 апе! О!фопис!еобе!е5 Саге)ег КХА Л та1т11 Ргераге а а!ос)с оЕ сап|ег КЬ)А Ьу йаао1мп8 сопипегс|а!!у ача|1аЫе уеаа| |ВЫА а| а сопсеп|гаЕоп оГ 10 ш8!ш! )п яеп!е ТЕ ЕРН 7.6) соп|а|п!п8 0.1 М ЫаС1.
Ех|гас| |Ье ао1и|юп пч)се |ч|й РЬепо! Ге|)и)1)Ьгагег) ш Тпа-С! (РН 7.6)) апг) г|ч)се |чКЬ сЫогоЕопп. Весочег КЫА Ъу ргес|рааиоп и4|Ь 25 чо!ишеа оЕ е|Ьапо1 а| гоош |е|прега|иге. Е|!аао!че |Ье ргес)РЬа|е|1 К74А а| а сопсепсга|юп оЕ 10 гп8)ш1 )п агег)1е ТЕ ЕРН 7.6), йчЫе |Ье а!ос)с |шо ыпа)! а1|аиогя апс) яоге |Ьеп| а| -20'С. Рlаат!г7 0ХА ог!!леагЕаег! Гагае7 ОХА Гог ргераплК Гетр!а!ее 1Е а р1аяпЫ Е|Ь)А!а иаег) |о ргераге |ешр1а|еа Ер!еаае аее 5|ер Н, с1опе йе РНА ае8шепс оГ шгегеа| |п|о а р1аяпЫ чес|ог оЕйе РСЕМ !Ргоп|е8а) ог В!иеасг!Рс 75|гага8епе) аепеа.
РСЕМ р1аяп!|Ь соп|а|п ргогпосега гесо8п)хег) Ъу КЬ)А ро1ушегааеа Кош Ъасгег)орЬа8еа 5Р6 апг) Т7, |чЬегеаа В!иеаспрс р!аа- гпкЬ соп|а|п Ьас|епорЬа8е Т7 апг) ТЗ ргопю|ега ЕР1еаае аее |Ье !пЕоппагюп рапе! оп РКОМОТЕК 5ЕЕе!)ЕХСЕ5 КЕСОСХ!ЕЕО Вг' ВАСТЕК!ОРНАСЕ-ЕХСООЕО КЫА РО)ЛМЕКА5Е5). М|п|ргерагаиопа оЕ р!аяпЫ РЬ)А аге аг)ег)иаге Ъи| по| ор|ппа1 |еп|р!а|ее Гог |и |Него ггапаспргюп геас|юпа. Веиег ге|и!|а аге ия|а1!у оЪга)пег) поп| )аг8е-аса!е ргерага|юпа рипае|1 Егоп| а!)са!)пе !у|а|ее оЕ Ьас|епа! си1и|геа Ъу ргес|р||а|юп чч)ЕЬ ро!уе|Ьу1епе 8!усо! !Р1еаае аее СЬар|ег 1, Рго|осо1 8).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
