Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 171
Текст из файла (страница 171)
Р1асе йе ънес пу!оп шегпЬгапе оп йе Ъопосп ог" сЬе аашр!е сче11а сис шсо йе иррег аессюп о! сЬе гпап!ГО1й Ко!! а р!Репе асгоаа сЬе хи!гасе о! йе шегпЪгапе со апюосЬ асчау апу а!г ЪПЪЫеа сгаррес! Ъесънееп сЬе иррег аесНоп о! сЬе шапЬО18 апс! сЬе пу1оп гпешЬгапе. 5. С1агпр йе с!но рагса ог" сЬе шап!го!6 соаесЬег, апс) соппесс сЬе ипи со а часишп 1ше. 6. Р!11 а!1 ог сЬе а!Оь)с!Оса сч)сЬ 10х %С, апс) арр1у аепс1е еисбоп ипо! сЬе Яшс) Ьаа раааес! сЬгоиВЬ сЬе пу1оп гпешЬгапе. Тигп ой. сЬе часишп, апс! ге8!1 сЬе а!оса ън!сЬ 10х %С. Ргерага1!оп оЕ 1Ье К)а!А Яагпр!е5 7. М)х еасЬ о! сЬе КХА аашр!еа (с!!аао1чес) ш 10)с! о! Н,О) нн!сЬ 30 )с1 о! КЫА с1епасигасюп 5О!ис!ОП.
8. 1псиЪасе йе пихсиге !Ог 5 ш!пи!ее ас 65"С, апс1 йеп соо! сЬе аагпр1еа оп 1се. 9. Ас!8 ап ес)иа! чо!шпе ог 20х %С со еасЬ аашр!е. 10. Арр1у еепс!е сшсНоп со сЬе шапЬО!8 ип01 сЬе 10х %С !п сЬе к!оса Ьаа раааес! сЬгоицЬ йе гпегпЪгапе. Тигп о)Т йе часишп. В!оЖпд о1 1пе В!ЧА Ьагпр!еВ апг! Е!ха1!оп о1 1пе В!ЧА 1о 1Ье Мегпсигапе 11. 1.оас1 а11 ог сЬе аашр1еа !псо сЬе а!оья апс! йеп арр!у Вепс1е аисс)оп. Агсег а1! о! сЬе аашр1ек Ьаче раааес) сЬгоидЬ сЬе шешЬгапе, Нпзе еасЬ о! сЬе а!оса ссч!се нн!сЬ 1 ш! Оу 10х %С. 12.
Ассег йе аесопс! г!Пае Ьаа раааес! сЬгоиаЬ сЬе пу1оп шегпЪгапе, сопНпие аисс!Оп гог 5 пипи!ее со с!гу йе шешЬгапе. 13. Кешоне сЬе гпешЪгапе ггош йе гпапсго!й апс! Вх сЬе КХА со сЬе гпешЬгапе Ьу еЬЬег !Л' !ггас!!ас!Оп, Ъа)с!П8, ог ш!с!осеан)П8, аа с1еасПЬес1 !п 5сер 16 о! Ргососо1 7. ВеЕоге ее!с!па пр сЬе ргеЬуЬгссСсгасюп апс! ЬуЬгссСсгасюп геассюпа, р!еаае аее Ргососо! 8. 750 СЬарсег 7с Ехсгассюп, Ригс)ссассоп, апг) Апа!уссс нутК)с)Аусот ЕиИагуос!с Се!Ь НуЬгсс!гта1!оп апс! Юа5Ь|пр о1 1гпгпоЬ!!нес! сс!ЧА 14. 1пснЬасе сЬе гпетЪгапе гог 2 Ьопга ас 68"С ш 10 — 20 гп1 01 ргеЬуЪпйхасюп 50!ос)оп ш а ЬаЫп8 йаЬ ог ЬуЬпйхасюп сЬатЬег. АсЫ сЬе с)епаснгес! гайо1аЬе1ес) ргоЪе с!!гесбу со сЬе ргеЬуЬгЫ)хас)оп ао106оп, Соп6ппе йе !пспЬапоп 1ог 12 — 16 Ьопга ас сЬе арргорпасе сетрегаспге.
То с)егесг !осч-аЬнпс)апсе юКЬСАс, нае аС 1еааС 0.1 р8 оС ргоЬе счЬоае арес!Ес асгппеу ехсеес)а 5 х 10а српь/08. атосе-асг!п8епсу ЬуЬпйгапоп, сп счмсЬ йе ргоЬе Ь пос Ьогпо!охот со сЬе саг8ес 8епе, ь Ъея сагг!ес) от ас 1осчег сепсрегасогес !37 — 42'С) сп а ЬуЬг!4!гас!оп Ьоугег сопса!п!па 50% с!еюпсгег! СоппагпЫе, 0.25 м сойшп рЬосрЬасе !рп 7.2), 0.25 м схаС1, апс! 7% Я35. 15. 16. Айег ЬуЪпйха6оп„геточе йе псегпЬгапе 1гот йе р1ааск Ъа8 апс! сгапьуег 6 аа с)н!сИу аа роаяЫе Со а р!аапс Ъох сопгаш!08 100-200 т! 01 1х 55С, 0.1% Ю5 аг гоот СетрегаСнге.
р1асе сЬе с1оаес! Ьох оп а р1асГогт аЬа)сег апс! а81сасе сЬе 60Ы 8епс1у гог 10 ппппсея 4с 1МРОКТАМТ Ро пос а!!осч сЬе спегпЬгапе со с)гу онс ас апу аса8е с)нг!08 йе счааЫ08 ргосес!нге. !псгеаае сЬе сопсепсгапоп оК 5Р5 сп сЬе счаауап8 Ьнпег са 1% !у а!п8)е-с!ганс)ес! ргоЪеа аге наес!. ро!!осч!п8 !осч-асг!п8епсу ЬуЬгн!гаасюп сп СоппапсЫе-сопсаспап8 Ьнууега, ппае сЬе гпешЬгапе сп 2х 55С ас 23'С апс1 йеп снссеаяче!у счааЛ сп 2х 55С, 0.5х 55С ъчпЬ 0.1% 5Р5, апс) 0.1х 55С слй 0.1% 5Р5 Сос 15 пнин!ее еасЬ ас 23'С. А 6па! счааЬ сопсаспсп8 0.1х 55С апг) 1% 505 Ь сап!ес! осп ас 50"С. 18.
Кереас йе счааЬ!08 !и 5сер 17 ссчке споге Гог а соса! ос сЬгее счааЬеа ас 68 С. Угу йе спегпЬгапе оп 6!сег рарег апс! еасаЫ)аЬ ап ансогайо8гарЬ Ъу ехрояп8 йе гиетЬгапе Тог 24 — 48 Ьопга со Х-гау 6!т (Кос)а)с ХАсс-5 ог ес!шча1епс) ас -70"С сч)сЬ ап спсепя'- гуш8 асгееп (р!еаае аее Аррепйх 9). Тип8асасе-Ъааес) шсепягуш8 ьсгеепь аге псоге еКеспче СЬап СЬе оЫег гаге-еагСЬ асгеепя А1Сегпапче1у, ап нпа8е 01СЬе тетЪгапе сап Ье оЬСа!пес! Ьу асапп!08 !и а рЬоарЬопта8ег. 1 7.
Тгапьгег сЬе тетЪгапе со апойег р!аапс Ъох сопсастп8 100 — 200 сп1 ос 05х 55С, 0.1% Я>5, ргесчагтес) со 68"С. А81сасе сЬе йнЫ 8епС1у Тог 10 т)ипсеа ас 68"С. Рго1осо! 10 Марр~пи ЮЧА ЫЙ Мис1еаяе 51 Н8ЕЕ ОЬЕЕКЕХТ ХБСГЕА5Е5 — ЧОСГЕА5Е 51, 8!ВО!НОСсЕА5Е, АЧО ЕХОМОСГЕА5Е НП вЂ” Ьаче Ьееп гьег1 со с)иапг)гаге КЫАя со тар гЬе роягюп оГ гпггопя ап6 го 16еп6Гу гЬе 1осагюп5 оГ 5' ап6 3' епгЬ оГ тКИАа оп с!опег) Р)5)А гетр1агеа 1р1еаае аее р18игеа 7-4 ап6 7-5).
Мис1еаке 81 ь чье 1п ргогесгюп ааааа ннЬеп гЬе геаг К)5)А 15 ЬуЬг)г)1хег) го а РМА гетр1аге (р1еаае аее йе ш1оппа6оп рапе! оп йОСЕЕА5Е 5!); НЪопис!еаяе ь гьег1 нчЬеп йе ГеаГ К)5)А 15 ЬуЬг161кед Го ап К!н)А сору оГ а Р)н)А гегпр1аге (р1еаае аее ргогосо1 11). Ехопис1еаае Ъ'11 15 гьес1 Гог тоге 5рес)а!Гаем ригроаеа — го тар аЬогг 1пггопа ап6 го геао!че апота11ех апяп8 гп пис!еаве 81 ргосес6оп аааауа (р1еаае аее йе )пГоппа6оп рапе1 оп ЕХОгчОСЕЕА5Е Ч11).
ТЬе гпейо65 гье6 гн)гЬ а)! гЬгее епхутеа аге е!аЪогаг)опа оГ йе с1ааяса1 пис1еаае 81 ргоГесГюп ГесЬп)с)ие беаспЬед Ъу Вег)с ап6 8Ьагр (1977). Ргерага6опа оГ К)н)А сопГашш8 йе тКМА оГ гпгегеаг аге шсиЬагег) чн)гЬ а сотр!етепгагу РМА ог К)5)А ргоЪе побег сопй)г)опа гЬаг Ганог йе Гоппа6оп оГ ЬуЬг16я Аг йе еп6 оГ гЬе геас6оп, ап епкуте ь гье6 го г)е8гаг)е ипЬуЬг)6)кег) яп81е-аггапг)ес) КХА ап6 Р)5)А. ТЬе аигч)н1п8 Р)5)А-К)5)А ог КМА-КНА ЬуЬгнЬ аге гЬеп аерагаге6 Ьу Ве1 е!есггорЬогеяа апс) чьиа1гхе6 егйег Ьу ашогасВо8гарЬу ог Ьу 8оигЬегп ЬуЬпйга6оп (рана!ого ег а1. 1980; Са!хопе ег а!. 1987). ччЬеп гЬе ргоЪе ь ргеаепг 1п гпо1аг ехсеаа гп гЬе ЬуЬпсВха6оп геас6оп, йе аггеп8гЬ оГ гЬе я8па1 15 ргороггюпа1 го гЬе сопсепггагюп оГ гЬе тКЫА оГ 1пгегеаг ш гЬе геаг ргерага6оп.
Ассигаге еагипагеа оГ сопсепгга6оп сап Ье оЬга)пег) Ьу сопаггис6п8 а агапдаг6 сигче 1п юЫсЬ ап ехсеаа оГ ргоЪе ь ЬуЬг)61кед со )спончп агпоипЬ оГ ГЬе Гаг8еГ аеииепсе. А та)ог ргоЫет ъчКЬ гЬе пис1еаке 81 ргогес6оп аааау 1п Ьь ог)8!па! Гогт (Вег)с апг) ЯЬагр 1977) юаа йе иае оГ г)оиЫе-аггапйег) Р)н)А аа ргоЬеа.
То ргечепг геаяюс)агюп оГ гЬе ргоЪе РНА 6иг)п8 гЬе ЬуЪг161аа6оп агер, К чгаа с)еягаЫе Ьиг пог аЬчаук роаяЫе со езгаЫьЬ ЬуЪг)с))гагюп сопс))!юпхт йаг Гачогед йе Гоггпагюп оГ К!5)А-РМА ЬуЬг)сЬ очег сотребп8 РЯА-РЫА ЬуЬНВя Весагье РМА-КНА ЬуЬ665 аге 51гВЬг1у пюге яаЫе йап РЫА-РМА ЬуЪП6я йе аппеа11п8 кгер и аа иаиа1!у регГогте6 гп 8098 Гогтат)с)е аг а гепгрегагиге аЬоче гЬе са1си1агес1 пге16п8 гегпрегагиге оГ гЬе г)оиЫе-аггапс$ег) Р!5)А (Сакеу ап6 Рач)бибоп 1977; Реап 1987). Ноннечег, ипс1ег гЬеае соп61г)опя гЬе гаге оГ ЬуЪг161каг)оп ь 51очге6 Ьу а Гасгог оГ -10, апс1 гЬе агаЬг16у оГ РЫА-КЫА ЬуЬг)сЬ ь ипрге61сгаЫе. ТЬеае ргоЫепь сои!с1 Ье с1гсшпнепгес1 Ьу йе и5е оГ яп8!е-ягапг)егГ ргоЬея ТЬе аппеа!1п8 кгер сои!6 йеп Ье сагпе6 оиг ипг)ег агапс)аг6 ЬуЬг161хагюп соп61гюпх Ъесагье гЬеге чои16 Ье по согпр1етепгагу аггапд ргеаепг со сотреге нч)гЬ йе гаг8ес КНА Гог ргоЪе.
Ноннечег, ннЬеп Вег)с ап6 гагр Й)с! йе)г нчог)с, гЬеге ннаа ятр1у по ге11аЫе тегЬод го ргераге а яп81е аггапг) оГ РЫА 1гее оГ Ъ согпр!егпепг. 8ггап6-аерагаг)п8 Ве1 е!есггорЬогеяа (Наухагд 1972) мчав йе оп!у ГесЬп)с)ие ача)1аЫе, ЬиГ 1Г чная а1ннауа а Гпс1су Ьияпеаа 1р!еаае хее 7.51 7 52 СЬартег 7: Ехтгастюп, Риг(!!тат(оп, апд Апа1уж о)г тКМА Ггот Еи)та густ(с Се!6 ехои 1 !П1гоп ехои 2 деполхс ОП!А 5' свр в!гис1ые рис!в!у !гаивслр1 З ро!у(А)! ! ! г врасеб игл!!А ПуЬпб !оггпеб Ье!чгееп !гвивсиоеб в!гаиб о1 с!опеб репою!с ОП)А аиб вресеб иглПА о~дев! чд1П пис!еаве 51 ~45'С ехои 1 ехоп 2 20ПС ехои 1 ехои 2 впа!ухе Ьу де! е1естгориогеав леи1га! де! вав!!пе де! пеи1гв! де! е)хе)!ие де! Е!СУКЕ 7-4 Ма гп ттП)А тч(тЬ П)ис1еаве 51 СЬартет 5, Рто1осо1 8). 5ератадоп тчав ровыЫе тч!1Ь оп!у -7058 оГ йе РХА Гта8тиептв апт1, ечеп ччЬеп виссеввГи1, тпечдаЫу теаи1тед ти ргерата6опв йат учете соптапппатед тч)тЬ йе соитр1егиептату Р)х)А в(твид.
Весаиве оГ йеве сН6си16ев, йе раттегпв оГ Ьапдв детестед абет Пе! е1естторЬотевтв учете вогиетппев согир1ех апт1 ойеи чапед Гготп опе ехрегипепт то йе пехт. ТЬеве д)ГГтси11!ев чуете во1чед !и йе 1ате 19805 Ьу йе дече!ортпепт оГ гиейода то ртот1исе ыи81е-вттапдед Р)х)А от КЬ(А ргоЬев !аЬе!ед то Ь!ВЬ врес!6с аст(ч(ту. тАгЬеп с)олег( ве8гпептв о( Пепогпгс 0)хА аге ивет( ав ргоЬев, йе 1осатюп о( !и(гола сап Ье пдеггет) (гоги тЬе в!те о( тЬе Ьапдв айег пис(еаве 51 д!Певтюп. НуЬг)дв (оггпед Ьетччееп йе тгапвспЬет( в(галс( о( Пепогп(с ОП(А апд гпКХА солтан!!оорв от' 5!п8!е-втгапдед ОП)А (!и(гола).
088евтюп о( йеве ЬуЬпдв чч!(Ь пис)еавЕ 51 а1 20'С Вепегатев ПЮ)еси(ев ъчЬовЕ КП(А гпо!едев аГЕ (п1аст Ьи1 ччЬовЕ ОМАв солта)п 8арв ат тЬе ытев от йе )и(гола. ТЬеве гпо)еси(ев пи8гате ав а ып8!е Ьапд ччЬеп апа)утед Ьу Пе( е(естгорЬогеыв илдег попдепатипл8 спид)т!опв (Ве! А).
(п адтаПпе Ве!5 (Пе! В), Ьоччечег, (Ье ПП(А !5 Ьудго!утед алс( (Ье !пдпддиа! тга8птептв о( ОП)А верагате ассогд!п8 то Фе!г ытЕ5. ЪЧЬеп д!Веет!ои ЪЧ1й пис)еаве 51 !5 СагиЕт) оит ат 45'С, Ьой йе ОНА апд РП)А в(галде о( йе рагепта( ЬуЬг)д аге йеачед то у!еЫ а велев оГ вгпаПег ОП(А-КП(А ЬуЬпдв тЬат сап Ье верагатет1 Ьу е)естгорЬогев!в ипдег попдепатипп8 спид)т)опв (Пе! С). ТЬе ОНА гпо)ет!ев )и йеве ЬуЬидв (Пе! О) аге тЬе ватле ыае ав тЬове детестед )и Пе( В.
Рт1ого( 10: Марр(пе 11НА пгг(Ь Хиг1еаге 51 7.53 ехоп 2 ехоп 1 гп1гоп репопг)с РВЗА 1 г г 5' сар в1гисгоге ргепагу 1гапвсбр1 3 ро(у(А) га)1 г г г вр1(себ гпй)ЗА ПуЬпбие й)ЗА го 5с ог 3'- ЗаЬе(еб депогп)с О)ЗА ргоЬев ))(. 5' габю1аЬег 3' габго!апег с Юрев1 ъъ(1П пис!еаве 51 апа)уге ргобис1в Ьу е)ес1горпогепв а Ь с б НСЗЗКЕ 7-5 Ма ш ГЬе 5'апб 3'Тегпнпг о( гпВЧАв НуЬг)65 гоггпеб Ьеьуееп тйПЗА апд Р)яА ргоЬев гайо(аЬе)еб а1 е)(Ьег ЬЛегг 5' ог (Легг 3' гегппп) аге д)еевгед ъу)(Л пис)еавЕ 51. ТЬе Зосагюпв О( Габю)аЬеЬ аге 5Лоъуп Ьу 1Ье 5(агЬиг51 вугоьО.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
