Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 174
Текст из файла (страница 174)
ТгапвЕег (Ье ЕгаВшепс оЕ де1 го а ЕгехЬ яеп!е шкгоЕице гиЬе апд адд )ия епоиВЬ Пе1 е1шюп Ьийег со сочег йе ЕгаПшепг (250 — 500 р1). 1псиЬаге йе с!оаед шЬе оп а го(адпц ъчЬее! очегп(ВЬ( а( гоош гешрегагиге. 760 СЬаргег 7: Ехггасг|ап, РипЯсаг|оп, апс)Апа!узЬ о~тЯМАГгот ЕиЕагуопс Се!Ь 14. Сепгпри8е йе гиЪе аг гпах|шцш среес! Гог 5 пппи1еа ш а ш!сгоГц8е. 15. ТаЫп8 саге го ачоЫ йе ре11ег оГ ро1уасгу1ашЫе, иве ап ашошаск ргре11ш8 с)еч!се го ггапя Гег 1Ье сирегпагапг го а ГгеаЬ писгори8е сиЬе. ТЬе 1аЪе1ес1 ргоЬе аЬои16 ешп -1 х 104 срш!|г! аа шеаацгес) Ъу!к)ц|6 ссш611апоп арес1гоасору, Оргюпа1: То тах|т|ге гееочегу ос КМА, ааг|200 а! ос Ие1 е|исюп Ьиссег со сЬе Ие! рейес |и 51ер | 5, |псиЬасе сйе с!осев сиЬе оп а гога!!п8 мйее! очегп!861, апд гереас 51ерз |4 апй |5.
16. йоге 1Ье ргоЬе а1 — 70'С. НуЬгсйеаГ!оп ЬеГсчееп ГЬе Те5Г гсМА апд ЕЬе Кайо!аЬе!ес! РгоЬе 01ЧА 1 7. Тгапауег 0.5 — 150 Сс8 а1щиоса оГ КМА (сесг апс! агапс)агг!) шго яеп1е ппсгоГц8е шЬея АсЫ ап ехсеы оГ ипгТогш1у 1аЬе!ес1 яп8!е-ягапс1ес1 Г)МА ргоЬе со еасЬ сиЪе. 18. Ргесгрйаге йе КМА апс1 )3ХА Ьу ас)йп8 0.1 чо1шпе оГ 3 м аос!!цш асесасе (РН 5.2) апс1 2.5 чо!шпеа оГ !се-со!д ейапо1. Айег яога8е Гог 30 пипигеа аг 0'С, гесочег 1Ье пис!ек асЫа Ьу сепгпГи8асюп ас шахппшп ареес) Гог !5 пиписеа ас 4"С ш а писгой8е. Г)|асагс) 1Ье е1Ьапо1к аирегпасапг, ппае йе ре!1е1 сч!й 70% ейапо!, апс) сепспГи8е 1Ье аашр!е. СагеГи!1у гепюче а11 оГ 1Ье ейапо!, апс1 яоге 1Ье ре!1ег соп1агшп8 КМА апс) Г)МА аг гоош 1ешрегагиге ип61 1Ье 1ааг ч|с)Ые сгасеа оГ ейапо1 Ьаче ечарогагес1.
|3о пос а!!осч сЬе рейес со Ьесогпе г|ес|ссасег|, ойгегъч|се й ъчй! Ье 6!Гйси!1 со г||еао!че. О!55ОЕММС МЕ)СЕЕ!С АС!О РЕЕЕЕТ5 й ь ойеп 6!6)си!1 1о оЫа|п согпр|есе с)ьао!ийоп о!Иге реИег ос пис|е|с аскс !и ЬуЬпсИгайоп Ьийег (51ер 19). ТЫс ргоЫегп Ь ехасегЬасед И гЬе реИег 'ь с)г!ес) |и а с)еа!ссасос 5отег!тес 1Ье реИе1 сап Ье дьсю|чед Ьу а сотЫпаг!оп ос И8огось р|рерйп8 апс) Ьеайп8 со 60'С.
|Г сййкиИес регат ог И е9июа|епс я!8па!с аге по1 оЬ|а|пес1 йоги с)ирИсасе аагпр!еа ос ИЧА, 16е ГоИочч!п8 ргосес)иге !а гесопмпепс)ес): 1. Айег 51ер 18 ос йе ргососо|, с|ьш|че йе реИе1 |и 40-50 !г! ос Н О. Ечарога1е 1Ье сапер!е !и а го|агу ечарога1ог ипгИ |1 ь |сь1 с)гу. 2. АсИ 30 и! о! ЬуЬпсйгагюп Ьийес ТЬе Ьус)га1ес) реИес аЬоиИ 80 !псо ао!ийоп 90!с|с!у ага! еая|у апс! у|еИ гергог)ис!Ые геаи!1я 19. Г)|аао1че йе пис1е|с асЫ ре1!ес |п 30 р1 оГ ЬуЬпйгаг!оп Ъийег. Ргрегге йе со!01!оп ир апс1 с)осчп шапу 1|шеа со епацге 1Ьас йе ре11ес |а сошр1еге!у 61|ьо1чес). 20.
С!осе 1Ье !Ы оГйе сиЬег|8611у, апс! шсиЬаге йе ЬуЪпйгаг!оп геасгюп ш а чча1ег Ьай аес ас 85"С Гог 10 ш)пцгеа го с1епасцге йе пис1ек асЫя 21. КарЫ1у сгапаГег йе гиЬе го а ччасег Ьай сег аг йе с)еягег! ЬуЪпйгас|оп 1егпрега1иге (иша1- 1у 65 С). !3о пог а)1очч 1Ье гиЪе 1о соо1 Ье!оъч 1Ье ЬуЬпспгабоп сешрегагиге с)цг ш8 1гапасег. НуЬпйге йе Г)МА апс! КХА Гог 12 — !6 Ьоцгс а1 йе сЬосеп сегпрегасиге. !Мое!еа5е Я О)ее56оп оГ ГЬе 0ХА-Й!МА НуЬг!сЬ 22. ТаЫп8 саге го )сеер йе Ъос)у оГ йе гцЬе ацЬшег8ес), ореп йе 1Ы оГ йе ЬуЪпйгагюп гцЪе. КарЫ!у асЫ 300 р1 оГ ке-соЫ пис1еаае 51 с)!8есс)оп Ьийег, апг! )шшейасе1у гешоче 1Ье гиЪе Ггогп йе счагег Ьай. С |икЫу пих йе сопгепп оГ1Ье шЬе Ьу чогсех|п8 8епс!у, апс1 йеп ггапя Гег йе 1иЬе со а ъчасег Ьай сес ас йе 1ешрегагиге арргорпаге Гог с!!Кеаг!оп илй пис1еасе 51.
!псиЬасе Гог ! — 2 Ьоигя с)ерепг!|п8 оп 1Ье г!е8гее оГ с)18ессюп с!еягес!. 762 СЬаргег 7: Ехггаегсоп, РипЯгас1оп, апг! Апа1уаг3 оу тЯ11АЯот Еи1гагуог1с Се!сг 31. Ропг ой сЬе 10оЬ ТСА ао!пс!оп апг! гер!асе чч!сЬ ап ехсеаа ог" 1% ТСА. Оепс1у гос1с ог гоСасе йе Сгау Сог 5 пппШеа аС гоош СегпрегаСпге. 32. Рош огг йе 1оЬ ТСА ьо!шюп апс! Ъг!еС!у Ппае йе Яхес! ае! чч!сЬ с!!ас!11ег! де!оп!аес1 Н,О.
1лгс сЬе а1ааа р!асе соаесЬег чч!сЬ йе ае! опс оГ сЬе сгау апс! р1асе сЬегп оп а С!ас ЪепсЬ сор. Ие рарег сосче!а ог К!шчч!Реа со гешоче ехсеаа Н О. Ро пос р!асе сосче!а оп сор оссЬе аеС. 33. Спс а рсесе ог" 'чч"гсасшап ЗММ Е!сег рарег (ог ес!и!ча!епс) йас !а ! сш 1агаег сЬап сЬе ае1 оп а11 яс!ея Тгапауег йе ае! со сЬе 6!сег рарег Ъу 1ау!пК сЬе рарег оп сор ог" сЬе ае! апс! шчегс!па сЬе а1ааа р1асе.
34. Кешоче йе р1асе апс! с1гу сЬе ае1 оп а ае1 ссгуег сог !.0 — 15 Ьопга ас 60'С. 35. ЕасаЫ!аЬ ап ацсогайоагарЫс ппаае ос сЬе с!гсес1 ае1. 5сап сЬе ипаае Ьу с!епясогпесгу ог РЬоарЬог!шах!па, ог ехс!ае йе аеашепса ог" йе Ке! сопса!и!па сЬе Сгаашепса апс! соппс йеш Ьу 1!с!и!с! вс!пс!1!ас!оп арессгоасору. Ргогп йе аагпр!еа спаса!оспа сС!Ыегепг апюппга о1 асапдагсС йЬСА, а епгче о1 гпаы чегапа гасСсоасссчссу сап Ье сопасгпссесС. ТЬе агпоппс оссагаес аегСпепсеа гп сЬе сеас ргерагасюпв о! КЬСА сап йеп Ье еас!гоасесС Ьу !псегро!асюп.
Рго1осо! 11 ЙЬопис1еаье Рго1есбоп: Марр1пц ЮЧА ю1Й ЮЬопис1еаье апс1 Кайо1аЬе!ес1 КМА РгоЬеь !ВОССОСССЛВК ВКОГССт!ОМ Л55ЛЧ5 ЛКК О5НЭ тО МКЛ5ССКК СЬе аЪипс)апсе оЕ арес!6с тала апсс со тар йе!г соро!о86са! Ееасигея ТЬе тесЬос1 !пчо!чек ЬуЪгЫггасюп оЕ секс КЪСАа со сотр1еспепсагу гайо1аЪе!есс КЪСА ргоЪез (пЪоргоЪек), Ео!1оъчесс Ъу йцексюп оЕ попЬуЪп6!гесс аес)пепсеа сч!сЬ опе ог споге ып81е-асгапсС-прес)6с пЬопис!еакея Ас сЬе епсс оЕ йе йцеассоп, йе пЪопис!еааеа аге !пассгчасед, апсс сЬе ргосессес1 Ега8тепь оЕ гайо1аЬе!ес1 КЪСА аге апа1угес1 Ьу ро1уасгу1атЫе 8е! е1ессгорЬогеяа апс! аисогайо8гарЬу. Аа сч!сЬ ппс1еаае 51 ргосеспоп аааауа (р1еаае аее Р!8иге 7-4), сЬе ыге оЕ сЬе ргосессесс Ега8гпепь а!1осча йе тарр!п8 оЕ Ееасигеа епсЬ аа шсгоп-ехоп Ъогс)ега апс! ясеа оЕ сгапаспрсюп !п6!асюп апс1 сеппта6оп (р1еаае аее Р!8пге 7-6) (Еупп ес а1. 1983; 2:!пп ес а1.
1983; Ме1соп ес а!. 1984; Еог ге иечгя р1еаае аее Са!гопе ес а1. 1987; Ке)сп!е ес а1. !990; МЬсЬе!! апс1 РЫ8е 1996). Носчечег, !исегргесас!оп оЕ тарр!и8 с!ага ь пос а!счауа еаау ог ипатЬ!8иопя Рог ехатр1е, счЬеп апа1усбп8 ргосессес1 Ега8тепса Гостев Ьепчееп а Сеаг тКЪСА апсс а пЬоргоЪе с!епчес! Ьу Сгапзспрг!оп оГ а с!опес! ае8тепг оЕ Кепот!с 13ХА, 6 са пос а!счауз роаяЫе со сс!ас!п8п!аЬ Ъепчееп а ар!Ые )ппссюп 1у!и8 пеаг сЬе 5' сегт!ппа оЕ сЬе тИМА апсс сЬе сгпе 5' сегтспиа оЕ сЬе тКЪСА.
СлгЬегечег роаа!Ые, сопбппасогу ссаса аЬоп16 Ье оЬСашес! Егогп ап !пс!ерепссепг СесЬп!сспе, Еог ехатр!е, рптег ехгепяоп (РгоСосо1 12 оЕ йь сЬарсег) ог 5'-КАСР (СЬарсег 8, Ргососо! 9). чсгЬеп йе апссаепае пЪоргоЬе са ргеаепс сп спо!аг ехсеы, сЬе асгеп8сЬ оЕ сЬе апсогай- о8гарЬ!с я8па! !а ргорог6опа1 со сЬе агпоипс оЕ аесье КЪСА ш сЬе сеас аатр1е. С !паис!6сасюп Ь асЬсечесс Ьу сотрапп8 сЬе ягеп8сЬ оЕ сЬе я8па1а Ггоис аатр!еа сопса!п!п8 сеас КМА сч!сЬ йас оЕ я8па1а 6от аатр1еа сопса!п!п8 1спосчп агпоипь оЕ асапс1агсс КЪ!Ая йеае Ъе!п8 8епегасесс Ьу !и чбго сгапасг!Рссоп оГ ап арргорпасе 17ЪСА сетр1асе (р1еаае аее ТесЬп!Чиеа Еог С !паис!сас!п8 КЫА Ъе!осч). К!Ъопис1еаае ргосес6оп са ас 1еая сепЕо16 споге аепяссче сЬап погсЬегп ЬуЬпйга6оп.
ТЬь аепяспбсу ь ссие со а чапесу оЕ Еассогя !пс1ийп8 сЬе Ео11осчсп8. ° Моте сотр1есе ат1 греег11ег ЬуЬгсс11гаг1оп ь асЬ!ечесс Ъесасье сеас апс1 ргоЬе КЪСАа аге Ьой ргеаеис !и ао1ис!ои. ° Е1сттасюи о7" сЬе егер т счЫсЬ ЯХА Ь ггаифеггег17гот а Ке1 го а ю1Ы зиррогг. ТЬе еЕГсссепсу оЕ сЬь асер чапеа ассогйп8 со сЬе тесЬосс пасс! апсс сЬе пю!еси1аг чге!8Ьс оЕ йе саг8ес КЫА. ° Е1гттайои оЕрогсЬуЬга11гасюп счахЫпд егеря ТЬе асг!п8епсу апсс еЕГсссепсу оЕ сЬеае асера аЕЕесс йе!ече1 оЕ Ъас)с8гоипс) апс! йе асгеп8сЬ оГ йе я8па1.
Ъ)о тассег Ьосч Й!1!Еи1!у сЬеае счааЬеа аге регСоппей йе тахппшп га6о оГ я8па1 со поье сп а погйегп Ыос гаге1у ехсеес!а а Еассог оЕ)0. 7.63 7.64 Огаргег 7: Ехгтасг!оп, Ритфсапоп, апд Апа!ув(в о( тНХА (тоти Еи)сатуос(с Сей ЗР6 ргопю1ег Т7 рюгпо1ег апеагпе ъубп гев1пс1юп епбопос!еаве 6Р6 ргогпо1ег Т7 ргопю1ег 1гапвспЬе чггсп Ьассег)орпаце Зрб ОМА-берепбеп1 ВМА ро|угпегаве Пупг)б)ге саЬе)еб гпЯМА ргоЬе 1о оп|аЬе)еб ВМА опбег 1ев1 бгаевс ВМА-ВМА ПуЬпбв мю рапсгеапс ЯМаве опаске в)ае ос ВМА-ЯМА ПуЬпбв а Ь с б Е|СО!ъЕ 7-6 Ма |п шКП(Ав иг!СЬ (Сад(о!аЬе!ед СС)МА РгоЬев апд СС)ъсаве Кад(о(аЬе(ед Юъ)А, вуп(Ьев!кед |и чдго Ггош а с|опед сору о( ТЬе еепогп!с ОП(А (спера А-С), 16 ЬуЬпд!лед со ии1аЬе|ег1 севс шКП)А (сиер О). А(сег гешоча| о( ГЬе игъЬуЬгсд(еед сасЬ Ьу сйцевдои иг!1Ь ЯП(аве (всер Е), 1Ье в|ге о( 1Ье гад(о(аЬе(ед ЮМА |Пас !в гев(всапс со ЮМаве 16 гпеавогед Ьу це( е(ессгорЬогев!в (всер Р) .
(5сер А) Тагеес ОНА 16 с|опед спсо а р!авш(д доигпвсгеаш (гоги а рго1сагуодс ргопю1ег (Ьассег(орЬаае 5Р6 ог Т7); (всер В) ГЬе гесогпЬ|папс р!авш(д 16 |шеагтеес! ип!СЬ а гев(г!сс!оп еплугпе ГЬа1 с1еачев ас 1Ье д(вга) епс! оГ СЬе Сагеес ОП)А; (в(ер С) 1Ье 1|пеаг ОМА 16 Сгапвег(Ьед ип1Ь сЬе арргорпасе О|МА-дерепдепс ЮМА ро|угпегаве (|и 1Ь|6 саве, 5Р6), апс1 Сепър|асе ОП(А 16 гепъочед Ьу д!аеас(оп ъи(Ь ЮЧаве-Ггее рапсгеадс ОП)аве; (всер О) гад(о!аЬе1ед КПГА (огапее вс(ощ!у 1|пе) 16 ЬуЬпд|кед со оп|аЬе|ед севс ЮйА (сю|Ы тес| 1|пе); (егер Е) КП)А-КП)А ЬуЬпда аГЕ д!аевсед ъч|ГЬ рапсгеа1к ЮЧаве; (в(ер Р) Кг(А-КАСА ЬуЬпда (Ье(оге апд а((ег д!еевс)оп ъи1Ь Юъ|аве) аге апа!умед иВЬ ее) е!есггорЬогев(в апд аисогадюцгарЬу.
(Гапев а,д) Мо1еси!аг-ъче|еЬ( 6(апдагдв. (Гапе Ь) Кад(о(аЬе!ед Юъ(А Ьесоге д|аевс(оп ип1Ь Юъ)аве; (|апе с) гад(о!аЬе)ед ЮМА а(сег д|еевс|оп ипсЬ Юъ)аве. Ву ов(иа ргоЬев сотпр|егпеп1агу 1о арргорг|а1е веагпеисв о( 1Ье 1егпр|асе ОП)А, Ь 16 роввгЫе 1о тиар 1Ье ров(С!опв о( ТЬе 5' апд 3' сегппп| оГ гпЮЧАв апд СЬе ров!Сюпв о( 5с апд Зс вр1ке 6!сев. 7 бб СЬаргег 7: Ехггскг)огс, Ригфгагсоп, апг$ Аиа1уг!г оЕгпКХА Етгп Еи)сагуог!г Се!!г 16пебсх аа а ъчау со теааиге сЬе сопсепсгасюпа оЕ пис1ек асн)я ТЬе ятр!кКу ап6 е!е8апсе оЕ сЬе ипс$ег1у!п8 сЬеогу апс$ сЬе еаау с1апсу оЕ сЬе ехрептепь 6езегчес$ а 8геасег регтапепсе.
Тобау, а пшпЬег оЕ ргосессигез аге иъес$ со теааиге йе аЬипбапсе оЕ а рагс)си1аг тК)ъ)А 1п а ргерага6оп оЕ соса1 ог ро1у(А)' К)ъ)А. ТЬе тиас рори1аг оЕ сЬезе аге погсЬегп Ыоь, НЪопис1еаае ргосесс)оп, апс1 ъ)иапс!сас!че гечегае сгапасПрсаъе-РСК $КТ-РСК). ЕасЬ оЕ сЬеае тесЬосЬ Ьах ъбгсиех ап6!игнсасюпя ° )Ъсоге)геггг Ег)оха геишге ге1а6че!у !аг8е апюипЬ оЕ таСепа1 апъ$ аге аечеге1у сотрготсае6 Ъу с)е8гас$а6оп оЕ сЬе К)ъсА. ТЬе!г аепя6чКу ь 1оъч ап6 сЬеу аге с!шпау $пасгшпепса Еог теааигсп8 сЬе аЬипъ)апсе оЕ 6!ЕЕегепс гпК)ъсАа сп сЬе хате затр1е. Ноъчечег, погсЬегп Ыосбп8 Ьаа сЬе ипи)ие ччгсие оЕ япш1сапеоы1у ргоч161п8 1пЕогтас)оп оп ЬосЬ яге ап6 аЬипс)апсе оЕ саг8ес тКЬ)Ая ТЬ!х <1иаПсу ь рагски1аг1у иаери1 ъчЬеп согпрапп8 ехргеаяоп оЕ ар1$ееъ$ чапапь оЕ а сгапгкпрс т 61ЕЕегепс ссахиея С сиап6Ессассоп Перепл оп геЬуЬг$6$хассоп ъч)сЬ а ргоЪе со а сгапаспрс Егот а Ьоиае)сеер!п8 8епе ог ап ехсегпаПу ас)с)е6 асапс1агс$ (р!еахе аее йе 1псгобисс!оп со $ъ)огсЬегп НуЪг!6!гас)оп ргесес$!п8 Ргососо1 5).
° ИЕЬогсис)еахе ргоСееВон 6оеа пос гес)шге !пСаес К)ъ)А; п 1а -20 — !00-Ео1с$ пюге хепяс!че сЬап погсЬегп ЬуЬпйхабоп апс1 ь сараЫе оЕ с1есесс)п8 -!О' сор)еа оЕ а арес!Пс сгапспрс, ТЬе тесЬос$ сап еая!у соре ъч!сЬ аечега1 саг8ес тК)ъ)Аз япш1сапеоы1у апд, Ъесаиае сЬе спсепясу оЕ сЬе я8па! ь еПгесс1у ргорог6опа! со сЬе сопсепсгас!оп оЕ саг8ес К)ъ)А, согпрапаопа оЕ йе !ече1 оЕ ехргеьяоп оЕ йе саг8ес Пепе $п 6!ЕЕегепс с!ааиеа ь еая1у ассотр1ьЬей Ноъчечег, пЬопис1еахе ргосесс)оп ъчог1са Ьеас ъчссЬ апс)аепъе ргоЬеа сЬас аге ехасс1у сотр1етепсагу со сЬе саг8ес тКЬ)А. ТЬ!а сап Ье а ргоЫет $Е сЬе ехрепгпепс Пепегасеа Ксъ)А-К)ъ)А ЬуЪпба сопсатт8 тсатассЬе6 Ъаае ра)га йас аге яьсер6Ые со с1еача8е Ъу К)ъсаъе, Еог ехатр1е, ъчЬеп апа1ух!п8 ЕапиПеа оЕ ге!асес$ тК)ъ)Ая С >иап66сас)оп оЕ саг8ес К)ъ)Аа !а Ьеас асЬ!ечес$ Ьу сопасгисс!п8 ясапс1аг6 сигчеа ъчКЬ опе !Раре ес а1. 199! ) ог пчо Есъач!а ес а1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
