Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 172
Текст из файла (страница 172)
ТЛе Зоса6оп о( (Ье 5' апб 3' гегпппг о(ЗЛе гагце( КМА сап Ье бебисеб Ьу теавиг)пд (Ле 5)ге о! (Ле пие)еаве-геявгапг (гацгпепгв о( РАЗА апб евбтаг(щ (Ье 6)5(апсе Ьепъгееп гЛе гайо)аЬе) апб гЛе 5' апб 3' геггп)п) о( (Ле гпРМА. ((апе а) 55(аЬе)ег( ргоЬе Ье(оге 6)де56оп ъу)(Л пис(еаве 51; (Запе Ь) 55)аЬе)еб ргоЬе айег 6(девгюп ъу)1Л пис)еаве 51; (Запе с) 35)аЬе(ег) ргоЬе Ье(оге 6)цевбоп ъу)(Л пис)еаве 51; (Запе г() 35)аЬе)ег( ргоЬе а((ег 6(девбоп ъу)(Л пис(еаве 51.
Мо(еси)аг-ъуе)5Л( вгапбагбв аге гергевепгег( гп ЗЛе оигви)е Запев. Зп еи)гагуо6с вувгегпв, 1Ле 5' епб о(ЗЛе гпйЧА бегег тнпед Ьу пис)еаве 51 терр)п5 сапега()у гергевепгв (Ле в(ьгг рони о( Згапьг.прбоп, ъъЛегеав 1Ье бе(гпеа(еб 3' епб гергеъепгв 66 яге о( ро)уабепу)аг(игг. А япи)аг 5(гагру сап Ье ивеб го тар (Ле ров)гюп о! 35 апб 555р(гсе ягев. РКОВЕй 1)йЕЕА!Зъ) ЗПЗ!ЗСЕЕАйЕ Ы РКОТЕСТ!ОЗЧ АЫАУЯ РгоЬев оГ Згпоъуп ро!ап(у апг( Ь)цЬ вресИк ас((у)(у аге таг(е Ъу верага((пд 1Ье 5(гапг!5 оу а !гацтет оГ г1оиЫе-вггапг(егЗ Р)ъ)А ог, тоге (гег)иеп(1у, Ъу 11е поуо вуп(Ьеяв еЬЬег ог ръ)ь)А сотр1егпеп(агу Го опе 5Ггапд оГ а г(оиЫе-5Ггапдег! Р)ъ)А Гетр1аГе ог о1 Р)ъ)А сотр1етепсагу Го а япфе-5(гапс1ег! (епър!аге ((ог (иг(Ьег бе(а(15 оп ргоЬе ргерага6оп, р!еаве вее СЬаргег 9). ° 5(гапг(-верагагегЗ ргоЬев аге ргерагегЗ Ьу ив(пц гуре 11 гевгпсгюп епкутев, 5(пд1у ог ш сотЪгпагюп, го еепегаге а Р)ъ)А (гацтепг оХ вшгаЫе яге (ивиа11у 100 — 500 пис1еогЫев) ъч(Ь а 5' 754 Осаргег 7: Ехсгасдоп, Ригфсас1оп, аид Апа1уяз оЕ тКХА Егот Еи)сагуо6с Се)!з ехсепяоп ас опе епс) апд а 3' ехсепяоп ас йе осЬег.
Опе зсгапд оЕ сЬе Ега8шепс сЬегеЕоге сч11! Ъе ир со е)ВЬс пис1еосЫез 1ои8ег сЬап сЬе осЬег. ТЬгз д!ЕЕегепсе ш яге Ь зиЕВсс)епс со а!1осч зерагабоп оЕ сЬе сччо зсгапдз Ьу е!ессгорЬогеяз сЬгоицЬ а ро1уасгу!агпЫе Ве! ипдег депасиг)п8 сопд16оиз. ЕКЬег ЬеЕоге ог аЕсег е!ессгорЬогеяз, сЬе 5' сегиипиз оЕ йе зсгапд оЕ шсегезс Ь дерЬозрЬогу1асед апд гасВо1аЬе1ед 1и гдсго Ьу сгагьЕег оЕ сЬе !аЬе1ес) РЬозрЬасе геядие Егош !у-згр]АТР, а геас6оп саса1угед Ьу ЪассепорЬа8е Т4 ро1упидеос!де Ыпазе 1Р1еазе зее СЬарсег 9, Ргососо1з 13 — 16.
° Ре почо зупсЬеяз ь гьед со ргодисе епд-1аЪе1ед ог ип)Еогш1у 1аЬе1ед РХА ргоЪез ги гдсго (е.8., р1еазе зее ЪЧеачег апд Ч'еЬяпаии 1979; Виг1се 1984; Са!гопе ес а!. 1987; А1деа ес а1. 1988; 5Ьаггос1сз апс1 НогпЬу 1991; зее а1зо СЬарсег 9). Епс1-1аЬе1ед ргоЬез аге ргерагед Ьу РЬоз- РЬогу!а6п8 сЬе 5' сегпипгь оЕ сЬе о!18опис1еосЫе рпгпег; иш1опи1у 1аЬе1ед ргоЬез аге ргерагед Ьу гисогрога6п8 гасВо1аЬе1ед пис!еосЫез гисо йе 8гочч)п8 РХА зсгапд.
1и ЬосЬ сазез, сЬе песч1у зупсЬеягед зсгапс1 оЕ РХА сап Ъе зерагасед Егош сЬе сешр1асе Ьу д!8езс!оп чч!сЬ а гезсгк6оп епгуше сЬас гесо8пггез а ии)г)ие ясе !и сЬе песч1у Еопиед доиЫе-зсгаидед Р)з)А. ТЬе гасВо1аЪе1ед ргоЪе сап сЬеп Ъе зерагасед Егош сЬе 11пеапгед з)п81е-зсгапдед Р14А Ьу е!ессгорЬогеяз сЬгои8Ь а ро1уасгу1агпЫе Ве1 ипдег депасипп8 сопд!сюпз. ° Кад)о1аЬе!ед ргоЬез Ь)азед Ьеач)1у 1и Еачог оЕ опе ягапд оЕ Р)з)А аге ргодисед ги РСКз ш ччЬ|сЬ СЬе сопсепггабоп оЕ опе рпгпег ехсеесЬ йе ойег Ъу а Еасгог оЕ 20 — 200. Рипп8 СЬе иич 6а1 сус1ез оЕ сЬе РСК, доиЫе-зсгапдед РХА ь зуисЬеягед )и а сопчеп6опа1 ехропеп6а1 ЕазЬ- юп. Носчечег, счЬеп йе сопсепсга6оп оЕ опе рпгпег Ъесогпез!ипдш8, йе геасбоп Еепегасез яп81е-зсгапдед РХА сЬас ассшии!асез ас ап агКЬгие6с гасе.
Ву йе еид оЕ сЬе геасбоп, сЬе сопсепсгаиоп оЕ опе зсгапд оЕ РХА ь йгее со Вче сипез Вгеасег сЬап сЬе сопсепсгабоп оЕ сЬе ойег (5си11у ес а1. 1990). ° КагВо!аЪе1ед ргоЪез сопязсш8 еп6ге1у оЕ оие ягапд оЕ РХА аге зупсЬеягед ш сЬеппа1 сус11п8 геасбопз сЬас сопса)п а доиЫе-зсгапдед Р!з)А сегир1асе Ъис оп1у опе ргипег. РоиЫезсгапдед сешр1асе РХА 120 )с8) 8епегасез -200 )с8 оЕ яп81е-зсгапдед ргоЬе очег сЬе соигзе оЕ 40 сус!ез. ТЬе!еп8й оЕ йе ргоЪе сап Ье дейпед Ъу с!еачш8 йе сегир!асе Р!ч)А ас а гезспссюп ясе дозчпзсгеаш сгопс сЬе Ъ)пд!п8 ясе оЕ сЬе ргипег (5сйгг! апд КосЬ 1990а,Ъ).
° Е)и)Еогш1у 1аЬе1ед КХА ргоЬез ЕпЬоргоЬез) аге Вепегасед Ъу сгапзспЬ)п8 а 1шеаг доиЫезсгапдес) РХА сегпр!асе аиасЬед со а ЪассепорЬа8е ргоиюсег !Ме1соп ес а1. 1984). ТЬе Р)чА сегир1асе Ь Вепегасед еКЬег Ъу д)8ез6п8 а гесошЪ|иапс р1аяиЫ сч)сЬ а геяпссюп епгугие сЬас с1еачез сч)сЬш ог доччпзсгеаш Егош йе с1опед Р)з)А зециеисе ог Ъу ашр)1Еу)п8 йе сешр1асе ияп8 РСК. ТЬе 1гпеапгед сешр1асе ь сгапзспЬед сп йе ргезепсе оЕ !а-згР)ХТРз Ьу йе арргорпасе ЬассепорЬа8е Р!з)А-дерепдепс КЯА ро1ушегазе со ргодисе а гад!о1аЪе1ед КХА йас ехсеидз Егош йе сш6а6оп ясе оЕ сЬе ргогпосег со йе епд оЕ сЬе Р)з)А Ега8шепс.
ТЬе рго- шосег апд сЬе РсчА зециепсе аге опепсед зпсЬ сЬас сЬе гези16п8 пЬоргоЬе и аибзеизе (сошр!ешепсагу) со сЬе шКХА со Ъе апа1угед. 1с Ь ргидепс, Ьш пос шапс1асогу, со рипЕу КЕ4А ргоЬез Ъу депасипп8 8е! е!ессгорЬогеяз. РипЕсасюп сап Ье сагпед оис еая1у апд г)и|сИу оп пдпг8е!з сазС чч)СЬ 558 ро1уасгу1ашЫе!8 М игеа апд гип ои а ипгдргогегп Ве1 аррагаСиз (е.8., Вю-Кад Мсш-ргосеап).
Ечеп счЬеп яп8!е-зСгаидед ргоЪез аге изед, пис!еазе 51 апа!уяз оЕ йе зггисгиге оЕ еи)сагуобс Коз ь пос Егее оЕ асс)Еассз. Рог ехашр!е, яиа11 иияпассЬез 1и РХА:КХА Ьесегодир1ехез аге ге1а6че1у геязсапс со сЬе ас6оп оЕ сЬе пис1еазе (Вег)с апс1 5Ьагр 1977). Сопчегзе1у, ге8)оиз оЕ регЕесс Ьесегодир1ех йас аге псЬ ги гав):дА зес)иепсез аге зизсерс)Ые со с!еача8е 1М111ег аид 5о11пег'ччеЬЬ 1981). А яп8!е шо!еси1е оЕ РХА Егег)иепс)у сап Ье ргосессес1 Егош сЬе ас6оп оЕ сЬе пис1е- Ргогосо!! О: Марр!п8 ЯМА и/г/7 Ь/ис!еаке 51 7.55 аке Ьу згпш11апеоик ЬуЬпйха6оп го пчо йЕЕегеп1 К)к(А пю1еси!ез (1.орага ег а1. 1985).
Р!па11у, пис!еаке 51 (пеЕЕгс!епбу йеачек 1Ье зе8тепг оЕ 1Э)к)А оррояге а 1оорейош ге8(оп оЕ К(к)А (5!506!а ег а1. 1987). Ману оЕ йеке ргоЫетк сап Ъе зо!че6 Ьу ияп8 а гап8е оЕ сопсепггабопз оЕ пис!еаке Ы, Ьу регЕоппш8 1Ье й8еяюп аг й1уегепг сегпрегашгез, Ьу ияп8 а 6!ЕЕегепг пис1еаке (е.8., пшп8 Ьеап пис!еазе), ог Ьу ияп8 а сотЪгпа6оп оЕ пис1еазез (е.8., КЫаке Н ап6 пис! еаке 51) (5(койа ег а!. 1987). Ноччечег, Ь !з ппроггапг со геа1(хе 1Ьаг с1еача8е Ьу пис1еаке 51 боек пог песекзап!у геЕ)есг а йчегВепсе !п зее)иепсе Ьегкчееп кггапбк оЕ гкчп пис1ек асЫз ап6 гЬаг геязгапсе го й8езгюп !к пог песеззап!у купопугпоиз чч!й Ыепгпу. Маррш8 ч61Ь пис1еазе 51 зЬои16 1ЬегеЕоге Ье ге8агбед аз а икеЕи!, Ьиг пог гпЕа1!!Ые, 80Ые 1о йе кггисгиге оЕ К)к(Аз.
ТЬы, ччЬеп ияп8 пис!еазе 51 го тар, Еог ехапгр1е, 1Ье 5' ап6 3' епбз оЕ а тВ)к(А, н ы ппрог1апг го сопуггт 1Ье геки11 Ъу ап !пг(ерепбепг гесЬп(е(ие кисЬ ак ргнпег ехсепяоп (Ргогосо! 12). Мип8 Ъеап пис1еазе сап Ъе знЪзбгшед Еог пис1еаке Ы ш тапу тарр!п8 ехрегнпепгк (р!еазе кее йе шЕогта6оп рапе! оп А((7(к(С ВЕАН Н()СЕЕА5Е). ЪАг!1Ь коте Т7)к)А ргоЬез, Еаг 1екк пшп8 Ьеап пис1еаке 1Ьап пис1еаке 51 !к пеебе6 го оЪгагп сотр1еге й8екбоп оЕ к!п81е-кггапс1е6 ге8!опз.
Рог ехатр!е, пис1еаке 51 гз ыес1 аг а сопсепгга6оп оЕ 1000 ип!ь/гп1 го оЬга!и сотр1еге йВекбоп оЕехсезз яп8!е-зггапбе6 РЫА ргоЪе соггезропйп8 го йе Ьшпап 1окч-депк(гу 1!Роргогеш гесергог, кчЬегеаз ап Ыепгка! гезн11 !к оЪга(пе6 ччКЬ ак 166е аз 10 ишгз/гп1 оЕ пшп8 Ьеап пис1еазе (!.А. СнйЪегг, регз, сопнп., ()и!чегягу оЕ Техак 5оийъчекгегп Мейса! Сепгег, Ра11аз).
А 6!забчапга8е оЕ тип8 Ьеап пис1еазе (к 1Ьаг К сап сок! 20 гнпез тоге оп а рег-ипп Ьаяз йап пис!еазе 51. Мип8 Ъеап пис1еаке сап Ъе киЬз6Ш1ед Еог пис!еазе 51 аг 51ер 22 гп 1Ье ргососо1. Мип8 Ьеап пис1еазе й8ез6опз аге сагпе6 ош !п а ЬиЕЕег сопгашгп8 10 тм зойшп асегаге (РН 4.6)/50 тм НаС1/1 гпм 2;пС!/1 гпм (3-гпегсаргоегЬапо1/0.00198 (ч/ч'1 Т61оп Х-100.
ТЬ(з ргогосо1 ргекепп а тейо6 Еог пис1еазе 51 таррш8 оЕ гпВ)к(А ияп8 а ип!Еогт)у 1аЬе1ед, к!п8)е-зггапдед РЫА ргоЪе. Ргоседигек Еог тарр!п8 К(к(А ияп8 пЬопис1еазе апд В)к(А ргоЬез ап6 Еог тарр!п8 В)к)А Ьу ргнпег ехгепзгоп аге ргезепге6 ш Ргогосо!к 11 ап6 12, гезресбче1у. МАТЕК1А15 ~ 1МРОВТАНТ Ргераге аП геа8епгк икее( (п 1Ь(к ргогосо! кч(1Ь ОЕРС-1геагед Н,О (р1еаке кее 1Ье (п!оггпагюп ране! оп НОЪЧ ТО )А!1 Ч ТНЕ ВАТТЕЕ ЪИТН ЙЧАке).
СА()Т(О(к(: Р!еаке кее Аррепд!х 12 Еог арргорпа1е Ьапд1!п8 оЕ гпагепа!к гпаг(еед гч1й <! >. ВНЕЕег8 апг! Ьо!НЕ!оп8 Р!еаке кее Аррепйх 7 Еог согпропеп(к оЕ к1ос(е ко106опк, Ьи((егк, апд геадеп1к. О!1и(е к!оскс го 1Ье арргорпаге гчогЫпд сопсеп(га6оп. Атгпоп/игп регзи1/а!е (70 4) <1> 70х Аппеа/!па Ьи//ег 100 тм Тпз-С! (РН 7.5) !00 гпм МВС1, 0.5 М НаС1 100 гпм /ВйгогЬгеио! Ейапо1 Се/ е/ипол Ьи//ег 0.5 М апггпоп(шп асегаее <1> 1 гпм ЕНОТА (РН 8.0) 0.1% (ч/ч) 505 756 СЬаргег 7| ЕхласПол, Риг|Е|саггоп, алгЕ Апа!ух(х оу" тЛЖА Тгот Еи)сагуог!с Се!17 НуЬг(сЕ(хас(оп ЬиПег Пог ЮГА) 40 спм Р1РЬ5 (РН 6.4) 0.1 шм ЕРТА (РН 8.0) 0 4 М НаС) ! Ье сЬе йюсВигп аа1с оЕ Р!РВ5 (р(регаг!пе-)|Г,Х'-Ъ(а(2-есЬапеаи)Еоп(с асЫ]) со ргераге йе ЬиКег, ап|1 а6)ига йе РН со 6.4 |ч!й 1 $4 НС1.
)с(ис!еаае 57 х(ор т|хсиге 4 м апипоп!иш асс|асс 50 шм ВРТА (РН 8.0) 50 и8)ш! сагпег КХА йоге сЬе пис1еаае 5 ! асор шпхиге |и а1(с(носа ас -20'С. РЬепо1:сЬ!огоуогт (7|7, ч)ч) <1> К!)А Ве(-!оасЕ(пд ЬиПег 5осГ(игп асесасе ГЗ м, рН 5/2) ТЕ ГрН 7.6) ТЕАЕЕР ГА),ГЧ,ГЧ;Н'-сеСгатеСЬу!есЬу(еле сЕ!ат(ле) <! > Тг(сЬ!огоасес(с ас!е( ГТСА) Г7/ апис 7 О/) <! > Р!!исе $00ай гиос1| |о1исюп 1! $0 ап|$1ЛОО)|ьс Ьесоге иае. СЬг11 йе |чо|Ып8 ао1исюпа ш |се.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
