Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 178
Текст из файла (страница 178)
1п спок! сакек, ъчЬеге тЬе рпптег Ь -50',гч СС апт! ь 20 — 30 пис1еосЫек тп!еп8сЬ, йе орйпшп аппеа1тп8 сетрегасиге тн!11 Ье Ьестчееп 40'С апт( 60"С. То де!ест!пе сЬе орсипшп сетрегасиге, кес ир апт( апа!уге а кепек от тЫепс!са1 ргипег ехсепкюп геасс!опк сЬас Ьаче Ъееп ЬуЪпт)!ген ас сетрегасигек т)!йег!п8 Ьу 5"С. Еисми-1аЬе! ет) Р)к(А тга8тепск от" )споннп яге тау Ъе икет1 ак то1еси1аг-сне!ВЬс тпаг1сегк чтЬеп апа1уг!п8 ргипег ехсепкюп ргос)исск Ьу Ве! е1ессгорЬогек!к. Ечеп Ьессег, Ьоъечег, ь а Р)ч)А кес)иепс!п8 !асЫег ексаЫ!кЬет) оп а Р)к)А септр(асе тч!сЬ йе кате о!!Вопис1еосЫе ргипег икет( ш сЬе ргипег ехсепяоп геасс!оп.
Ву геат)!п8 йе яге от сЬе рптег ехсепяоп ргодисс а8а(пкс сЬе кет!иепсш8 1атЫег, сЬе 5' епт) от" йе саг8ес К!к(А сап таррет( со а рагстси1аг Ьаке ратг. ТЬе то1!онч!п8 ргоСосо1 тчак с)ече1орет( Ъу ТЬогпак 5йт(Ьот" апт) корр!)ег( Ьу РарЬпе Рань (ЬосЬ от" сЬс Рптчсгясу о( Тсхак 5оисЬтчекссгп Мет!!са! Ссптсг, Ра!!ак). МАТЕК1А15 А сМРОКТА!к!Т Ртераге аП теа8епь икет) !и йь Ртотосо! тч!СЬ РЕРС-Стеатес! Н О (р!еаке кее йе !п(огтаВоп раое! оп НОЪЧ ТО ЪЧсН ТНЕ ВАТТ!.Е ЪЧ!ТН К!к!Акт).
САС)Т!ОН: Р!еаке кее Аррепт(!х 12 1ог арргорпаге Ьапт!!!пд о! птагепа1к таг!тетс чч!СЬ <! >. Вь0ег5 апс! Бо!ь6оп8 Р1еаке кее Аррептс!х С 1ог сотропепгк о1 атос!т ко1ипопк, Ьийегк, аптс геадепгя ОИиге к!ос(т ко1иоопк Со йе арргорпате сопсепггатюпк. Ргогого! 127 Ала!уь!ь о)' Л)гТА Ьу Рптег Ехгеляоп 7.77 Алнлогнипс асеСасе (7 0 м) <! > СЬ!огоуоггл < ! > О!Йюйге!Со! Л м) Ейало! Гогтат(г(е !оап(!лд Ьиууег 809о деюшхед Еолпапнде <! > 10 тм Е))ТА (РН 8.0) 1 т8(тс ху!епе суапо( РР 1 т8(т! ЬготорЬепо( Ыие РшсЬаье а спад!1ед деюп!сед ргерагасюп о( ЕогтатЫе апд ьсоге ш ьтаИ аИг)носа ипдег паго8еп ас — 20'С.
А1сегпадче1у, деюшге геа8епс-8гаде ЕоппагпЫе аь декпЬед !п Аррепйх 1. 5соге де!оп(сед ЕолпагпЫе ш япа11 а!хргоп нпг1ег шсго8еп ас — 70'С. КСI (7.25 м) РЬелоI <!> Рлтег ехсельюп т!х <! > 20 тм тгепс( (рн 8.4) (ас гоот сетрегашге) 10 тм МВС! 1.6 тм д)ЧТР ю!идол сопсашсп8 а11 Еонг дЫТРь 50 08)т! асс!потусш Р Ес!ььосче ассшотус!и )3 гп тесЬапо( ас а сопсепсгасюп оЕ 5 т8)гп1 Ье(оге ьнрр!етепсш8 йе рпгпег ехсепяоп пнх. 5соге сЬе асдпогпуст Ег ьсос1с юсшюп ас — 20 С гп йе даг1с. Р!еаье ьее сЬе шЕоппадоп ране! оп АСТ!ЫОМУСИЧ О.
5ог(!ит асега(е (3 м, рН 5.2) ТЕ (рН 7н5) Тг!ОЬ!огоаее(!е ае(г( (7 уа алд 709га ТСА) ТИ(исе 10098 ьсос1с ьо1идоп 17 10 апд 1ЛОО )ыс ЬеЕоге ые. СЫ!1 сЬе гчогмп8 ьо1идопь ш ке. Епкуепе5 апд Вссйеу5 Ро!упие!еоС(г(е (г!лаье Ргосе!л тЬ!Ь!Еог оЕ )2Хаье ТЬеье спЫЬссогь аге ьоЫ Ьу ьечега) гнали(асшгегь нпдег чалонь сгаде патеь (е.8., В)ЧАяп, Рготе8а, Роте 1пЫЬссог, 5 Ргнпе — г3 Роте). Рог тоге десай, р(еаье ьее сЬе сп(оппас!оп рапе1 оп ИЧН1В!ТОС(5 ОГ ВЬСА585. )сечегье Сгальелр(аье А с(олег! чегяоп о( гечегье сгапьслрсаье епсодед Ьу сЬе Мо1опеу пнглпе 1еи)гет(а Ыгиь (Мо-МЖ) Ь йе епгуте оЕ сЬоке ш сЬЬ ргососо1. Мисапп о( сЬе епаугпе сЬас !ас!г В)Чаье Н асдчау (е.8., 5сгаса5сг!Рс, 5сгаса8епе) Ьаче ьогпе адчапса8еь очег йе чд1д-суре епхуте япсе сЬеу ргодисе Ь!8Ьег у(е!дь оЕ Есд)-!еп8сЬ ехсепяоп ргоднсс апд ъчог(с ес)иа!!у арче!1 ас ЪосЬ 47'С апд 37 С (Еог гечсеы, р1еаье ьее Сегагд ес а1.
1997). Вечегье сгапьспрсаье ьирр!!ед Ьу д!Е(егепс тапи(ассигегь чапеь !п ссь асс(ч!су рег ип!с. 'ччЬеп иь!пВ а песч Ьа(сЬ о( еп~ггпе, ьес ир а ьепеь оЕ ехсепяоп геаедопь солса п(пе ее!на! агпои пса о( ро!у(А) е 8(ЧА апд о!!Волос!еоИде рпгпег, апд д!Иеген! агпоипсь о( епхугпе. В роьяЫе, йе рг!гпег ьпоиЫ Ье ьрес!Ею Еог а тВЫА ргеьепс ас пюдегасе аЬипдапсе !п сЬе ргерагасюп о( ро1у(А)" ВЫА.
Аььау СЬе ргодиссь о( еасЬ геасдоп Ьу ае! е!ессгорЬогеьВ аь с!еьепЬес! 1п йВ ргососо!. С)ье сЬе пинала! апюипс о( епхупсе гес(и!гед со ргодисе сЬе тах!тит у!е!с( о( ехсепяоп ргодисс. ТЬе ип185 иьед !и сЬВ ргососо! ягоде ъчеП смсЬ гпоьс ЬассЬеь о( 5(гаса5сг!рс. Се!5 Е)епасиг(пц ро!уаегу!ат!г(е де! <1> солса!л(лц В М игеа 1п спапу саьеь, а пншргосеш 8е1 аррагасиь (е.8., Вю-рад Мсш-Ргосеап) (13 сгп х 13 ст х 0.75 гппг) сап Ье ыег1 со апа1уге гагпо(аЬесед рлтег ехсепяоп ргодосся Р1еаье ьее ТаЫеь 7-8 апг1 7-7 апд сЬе пасе со йе етгу Еог ро)уасгусатЫе 8е1 е1ессгорЬогеьЬ 1п Ргососо! 10. ТЬе тесЬод иьед со ргераге а тгшдепасипп8 ро!уасгусатЫе 8ес В деьспЬед ш 5сер 1 о( Ргососо1 10.
ТЬе ргерагаиоп оЕ 1аг8ег 8е1ь Ь деьспЬед ш СЬарсег 12, Ргососо! 8. 778 СБарсет 7: Ехгтасс(оп, Рит())сас(оп, апг(Апа1ухЬ оГтЯ5ТАГтот Еи)сатуос(с Се!1х )х)ссс1е1с АС1ЕЬ апд О1фопссс!ео$1с1е5 Сатг(ет )сХА (уеахг Я!)А) (3)ЧА тат(сета, тао5о!аЬе!ег), Еот Ке! е!ессторЬогеж < ! > Р!саве атее Орсншхш8 Ргппег Ехсепяоп Кеасбопз (ЙЬ ргососо1) апс( Аррепйх 6, !прис КА)А Ео Ье апа!ухег) Ргерагас!опх оЕ ро1у(А)' КЬСА аге рте(еггей еврее!а!!у стЬеп сесбп8 пр рптпег ехсепяоп геасс!опс Еог йе Кгзс сапе ог реп рте ратас!паз о( соса! КЫА ргос1псе ехсеояоп ргос(пссь оЕ й(Еегепс 1епКЕЬя О!(Копие!еог(г(е рг!тег ТЬесе рг!шест зЬоп!с$ Ье 20-30 ппс!еоск1еь сп !еп8сЬ ап8 рте(егепс!а!!у рпг!Кеб йгоп8Ь 5ер-Ра1с сЬгогпасо8гарЬу апс( Ъу 8е1 е!ессгорЬогеяс (р!еасе сее СЬарсег 10, Ргососо! !).
Сгпс(е ргерагабопс оЕ о!18опос!еос!бей 8(че гЬе со 1щЬег Ъас1с8гоппсЬ оп сЬе апсогайо8га1п, еарес!а!1у сп сЬе агеа оЕ сЬе 01ш соггесропйп8 со сЬе !оъ-пю!есп(аг-схе!КЬс ге8!оп оЕ сЬе ро!уасгу1аспЫе Ке!. Кеыьреп8 сЬе рпгсгсе8 о1!Коппс!еосЫе ас а сопсепсгасюп оЕ -60 п8)сс! (5-7 рпю!ес)сс!) сп ТЕ (РН 7.6). Ка(11оасбче СопсросспсЬ (у-ххР)АТР (70 тИт), 7000 С!)тто!е) <!> Ярессса! ЕЕ1сс1рпсепЕ Пасет ЬасЬь ргеьес со 42 С апс( 95оС, апс( сЬе арргорпасе аппеаl)лд сетпретасите (р!еахе хее 5(ер 72) УУЬагтап ЗММ Г(!Сег рарет (от ес(ина!епС) МЕТНОО Ргерага11оп оГ 11се О1фопссс!ео111(1е РгоЬе 1.
РЬохрЬогу1аге йе о1(цоппс1еоСЫе рпшег ш а геасСюп сопгашшц: о88опцс!еосЫе рпшег (5 — 7 ршо!еь ог 60 п8) ! р! йсс!Пес( де!оп!хес( Н О 6.5 РС сох Ыпасе Ьп((ег !.5 Сс! ро1уппс!еосЫе Ыпые (-10 пшь) сФ (у-'ср) АТР (7000 Сйпшо!е) 2 Р1 1пспЬасе йе геасйоп Еог 60 пипи!ей ас 37'С. ТЬе Кпа! сопсепсгасюп оЕ гас(!о!аЬе!ед АТР сп йе геасбоп ьЬоп!0 Ье -30 пм. 2.
5Сор йе Ыпахе геасС(оп шПЬ йе асЫ(С(оп оГ 500 Сс1 оЕТЕ (рН 7 б). АсЫ 25 Сс8 оГсагпег К)х)А. 3. АсЫ 400 р! ос ес)ш1(Ьтагес) рЬепо! (рН 8.0) апс1 400 р! оГ сЫогоГоггп (ог 800 р! оЕ сопппегс(а1 рЬепоЬсЫогоГопп [1:1)). Чогсех ч(цогопх1у Гог 20 хесопсЬ. 5ерагасе сЬе ас)пеоиа апс) остап(с рЬазез Ьу сепспй8асюп Еог 2 пнппсех (п а ппсгой8е. 4. ТгапхЕег йе ас)пеопх 1ауег со а ГгехЬ хсеп1е ш(его(п8е спЬе апс) ехсгасс ичсЬ 800 Сс1 оЕ сЫогоГопп. Чогсех у(8огопх1у Еог 20 хесопс)я 5ерагасе йе ас(пеоих апс) ог8апк рЬахех Ъу сепсп(08ас(оп Гог 2 шшпсеь сп а шкго(п8е.
АКаш сгапаГег сЬе ас)пеопх 1ауег со а Егер хсеп1е ппсгоЕп8е спЪе. 5. Кереас 5сер 4. 6. АсЫ 55 Сс1 оГ хгеп1е 3 М хойшп асегаСе (рН 5.2) аск1 1 ш1 оЕейапо! Со СЬе ас)пеопх 1ауег Егош 5сер 5. Мы Ьу уогсехш8 апс) хсоге йе ьо1пс(оп Еог ас 1еахс 1 Ьопг ас — 70 С. Ргогого/ 12: Апа!уяг оЕ ЯМА Ьу Рптег Ехгепяои 7.79 СоПесс сЬе ргеслрПасес1 оППопис1еосЫе ргииег Ьу сепспЕи8ас!оп ас тахипшп хреес( Еог 15 т(писеа ас 4"С ш а т!сгоЕи8е.
Реточе апс1 йхсаг6 сЬе гайоас6че аирегпасапс. ЪЧааЬ йе реПес ш 70% есЬапо1 апс( сепсг!Еи8е а8а!п. !3(хсагс! йе аирегпасапс апс( с(гу 1Ье ргес(РЬасе 1и йе алг. 13!аао!че сЬе ргес(рпасе (и 500 р1 оЕ ТЕ (РН 7.6). 8. Сопит 2 )л! оЕ гайо!аЪе1ес1 оПЕопис1ео6де рптиег (и 10 т1 оЕ ас(п6Па6оп Пи(д ш а !щи!6 ас(п6Па6оп соипсег. Са1си!асе 1Ье арес(6с асс(ч(су оЕ сЬе гайо!аЬе1ес( рпгпег аааштпп8 80% тесочету.
ТЬе арес(Еле асс(ч(су аЬои!6 Ъе -2 х 1Оа срти/ртпо1е оЕ ргппег. НуЬгЫиаЕ!оп апс! Ех$еп51оп оЕ ЕЬе О!!коппс!ео1!де Рглгпег М(х 104 со 10' сРтп (20-40 Ето1еь) оЕ йе ЕлХА Ргпиег чч(тЬ 0.5 — 150 !18 оЕ йе К)ч)А Со Ье апа1угес1. АкЫ 0.1 чо!шие оЕ 3 м тюйшп асесасе (РН 5.2) ап6 2.5 чо1итеа оЕесЬапо1. 5соге йе ао!ис(оп Еог 60 пбпшех ас — 70'С, апс1 йеп гесочег сЬе КХА Ьу сепспЕи8а6оп ас тпахлтшп ареес1 Еог 10 т(питеа ас 4'С !и а т(сгоЕи8е. 55гааЬ йе реПес ъч(й 70% есЬапо1 апс1 сепспбл8е а8а(п.
СагеЕиПу геиюче аП оЕ сЬе есЬапо1, апс1 яоге сЬе реПес ас гоотп сетпрегасиге ип61 йе !аас ч(а!Ые сгасеа оЕ есЬапо1 Ьаче ечарога!ей ТЬе рпгиег аЬоо14 Ье 1и аЬоы геи(о14 ию1аг ехсеы очек сЬе сегир!асс КХА (р1еаае аее сЬе спасая яои ои Орссш(гси8 Ргииег Ехсеияои Кеассюиа ги йе (исго<4иссюи со йы ргососо!). 10. Кеаиарепс1 сЬе реПеса гп 8 )л! оЕТЕ (РН 7.6) рет шЬе. Р(рессе тЬе аатр1еа ир аис! с(обучи аечега1 с!тех со Йххо1че реПеис Р1асе сЬе оП8опис1еосЫе/КХА пихсигеь ш а ччасег Ъай вес ас йе арргорпасе апиеа1ш8 сетрегасиге.
1псиЬасе сЬе аатр1еа Еог 15 т(писеа ас йе орсипшп сетретасиге, аа «(есегпппес( 1и рге1ишпагу ехрептепса (р1еаае аее йе г(!асиаяоп оп Орсишгш8 Ргипег Ехсепяоп Кеасс!опа (и йе !псгос1ис6оп со сЬЬ ргососо1). ТЬе Ыиеиса о( аииеа1ш8 Ьеьчееи сЬе о! 18оиис!еосЫе рпгиег аиг( йе гиКХА сегир1асе аке гегиак1саЫу гарЫ иидег сурка! Рпгиег елссеияои соийиоия ш ччЬкЬ йе рпгиег ь ги ехсеы о( йе саг8ес шКХА.
Еог йь геааои, йе сиие о! аииеа1ш8 ш Яер 12 саи Ье 1ишсег1 со 15 иииисеа. 5оше ргогосо!а шс1иде е1аЬогаге Ьеаии8 аид соо!ш8 гоиииеа ас сЬЬ атер, Ьш ги ош Ьаиг1а, сЬеае Вугаи6ие чапа6оиа аге гаге1у иесемагу. 12. ТАкЬПе сЬе оППопис1еосЫе апс! КХА аге аппеа1лп8, аирр1етепс ап а1щиос оЕ рптег ехсепяоп пих чч(сЬ ййюйгеКо1 апс1 гечегае сгапаспрсаае аа ЕоПоччя ТЬалч а 300-)л! а!щиос оЕ рптег ехсепяоп гптх оп ке апс1 сЬеп акЫ 3 р1 оЕ 1 Ь! йсЬлойгепо1 апс) гечегае сгапаспрсаае со а сопсептга6оп оЕ 1 — 2 ии(са/)л1. АсЫ 0.1 ип(с/)л! оЕ ргоселп !пЬ!Ь!сот оЕ КХаае, 8епс1у пих Ьу (пчег6п8 йе сиЬе ьечега! !пиеа, апк) йоге П оп ке. 1с Ь роаяЫе со еасаЫЬЬ сЬе СлХА ае9оеисе о!а рксшск-ехсеиг!еа ргогтисс Ьу 1ис1ик!1и8 г!Ыеохуиос1еосЫеь (сегиииасога) ги йе геасиои гигх.
!и а 5'-еиг( гиаррш8 ехрегииеис, 1сиочаи8 йе ехасс аексоеисе о( йе рпгиек ехсеиг(ед ргойлсс аПочъ ркесье роясюши8 о( сЬе еи8 ги йе 5г-ЯаиЫи8 ге8(ои ог сЬе репе. ТЬЬ арргоасЬ Ьаа Ьееи аиссеааги1 ш гиаиу 1аЬа ъчЬеи ехаиаши8 шКХАа йас аге ге!аиче!у аЬииг(аис ги сЬе се!1 (с!ая 1 аисг8еиа, гас 1гчег асегоЫ 5о-гейгссаае шВХА, аиг! уеая а!соЬо! г!еЬуг(го8еиаае 2 шКХА). Рог ргососо!а ои рпилег ехсеияои аециеисш8, р!еаае аее бе1(еЬсег ес а!.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
