Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 177
Текст из файла (страница 177)
!псиЬа!е йе геасПоп пнхгиге Еог 30 гшпигез аг 37'С. 12. АсЫ 400 Ет! оЕ РЛепо!:сЫогоЕогш, чоггех !Ье пнх!иге Еог 30 зесопс18, апс1 зерагаге ЕЬе РЬаз- ез Ьу сеп!ЫЕицапоп аг шахнпшп зреес1 Еог 5 пипшез а! гоош !ешрегагиге !п а писгобгце. 13. Тгапзуег 1Ье иррег аПиеоиз РЬазе го а ЕгезЬ гиЬе, саге6г11у ачо! сПпц йе шсегЕасе Ъе!и ееп йе огцапк апс1 ас1иеоиз РЬазез. АсЫ 20 !гц оЕ сагпег КЫА апг1 750 Ег1 оЕ ке-соЫ ейапо1.
М!х ЕЬе зо1ипоп гче11 Ъу чог!ех1пц, апг! 1Ьеп з!оге йе зо!нпоп Еог 30 пипи!ез а! — 20 С. Кесочег ГЬе КХА Ъу сеп!НЕицаПоп аг шахнпшп зреес1 Еог 15 пипи!ез а! 4"С ш а шкгоЕице. СагеЕн!!у гегаоче !Ье егЬапо1 апс1 ъчазЬ !Ье ре11е! ъч11Ь 500 Ег! оЕ 70% ейапо1. СепгНЕнце аз ЬеЕоге. СагеЕи1!у гепточе а!! оЕЕЬе е!Ьапо!, апг1 йоге !Ье ореп !иЬе а! гоош !ешрегагиге ипЕП !Ье 1аз1 ч!яЫе ггасез оЕ е!Ьапо1 Ьаче ечарога1ес1. 17. Апа!у515 оЕ ЕЬе 14!Маце-гец!51ап1 НуЬг!415 Ьу Се! Е1ес1горЬоге515 Кезизрепг! !Ье ргесгрнаге ш 1О Ег! оЕ це!-!оайпц ЪиЕЕег. 18. Неаг !Ье пис1ек асЫз Еог 5 пппи!ез аг 95'С, апг1 ЕЬеп тпнпееПа!е!у ггапзЕег йе 1иЬе !о ап ке ЬагЬ. Сепгйблце !Ье !иЬез Ьпейу 1п а пнсгоЕнце го сопзо!Ыаге йе загпр1ез а! 1Ле Ьопош оЕ 1Ье 1иЬез.
Апа1ухе !Ье гайо!аЪе!ег1 КХА Ьу е!ес!горЬогеяз !ЬгоицЬ а "йш" ро!уасгу!аш1тЕе18 м шеа це1. рог итог! арр!кагюпз, а 5-8% ро!уасгу1апиг1е/8 хз шеа це1 оЕ 15-тгп Пис1гпея сПП зиЕ6се. Аз аппо!еси!аг-тче18Ьг гнат!гегз, ые а Ет14А зет!иепс!пц 1асЫег ог епд-!аЬе1еа Егацтпепгз оЕ !5ЫА оЕ 1гпокп яхе !е.ц., ап Мзр! йцезт оЕ РВК322, епг1-!аЪе1ег! тч1гЬ !и-пр!ПСТР ог ап Нае!П йцезт оЕ фХ!74 епг$-1аЬе!ет! сатЬ [и-'тр!ПСТР!. !9иг1пц е!есггорЬогеяз, епоицЬ сиггепг зЬои18 Ъе тип йгоицЛ йе це! го !геер йе 81ая р!агез тчапп го йе гоисЛ.
ТЛе таабче гпоЪт16у оЕ КЫА апг! ЕтЫА йгоицЛ ро!уасгу!агпЫе!8 я игеа це!з ча6ез ассогтПпц то гЬе соптПгюпз ыеП Еог е!естгорЬогезтз. 1п цепега!, тЬе Еазтег гЬе це! ь тип, гЬе! ея йе гПЕЕегепсе тп гпоЬПиу Ьегитееп КЕ4А аптЕ Ет!хА пто1- еси1ез оЕ Ыепттса! яге.
1Упг!ег гЬе сопгППопз поппаПу шее !40 — 45 Ч/стпЛ К14А гипз -5-10% тоге з!оит1у !Лап Его оЕ гЬе затпе яге. ТЛы, а 90-пис! еотЫе КХА тчтП и 1цгаге аг арргойтпаге!у тЛе занге гасе аз а 100-пис!еотЫе Ет14А. 1Е аЪзо!иге птеазигеитепг оЕ гЬе яхе оЕ йе К!4А ь 20. Ртогосо! 11: ЯтЬопис!сазе Ргогесг1опт Марртпц ЯМА итЕЕЬ КтЬопис!сазе апгЕ Яагуто!аЬе!егЕ КХт! РгоЬез 7.73 7 74 СЬарсет 7: Ехстаес!оп, Ритусеас!оп, апт( Апа1уз(з о)т тпйсз(А этот Еи!сотуо6г Се!1з 21. 23.
25. 26. 27. ге~)и!тес(, йе ые оЕ а зепез оЕ гайоасс(че Р.ЬСА ргоЪез оЕ с(еуспед !епасЬ !з гесошшеиз(ес(. ТЬезе зтае зсаизсагс(з сап Ье цеиегасес( Ьу ш чСсго сгапзспрноп оЕ а с(оиЫе-зсгзис(е4 РЬСА сесар!асе аусег с)!еезс!оп и!й гезспснои епхугпез йас с!еаче ас зиез ргоагезз(че1у изоте йзсз) со а ЬассегюрЬаае ргошосег. А1сегпанче1у, йе зсаис(агс(з саи Ье ргойисес) Ьу еш( !аЬе!!ие сопипегс!а!!у ача!!аЫе йсзл шагссегз ч ссь (ие оР)сопсусер!и апд ро!у(А) ро!ушегазе. Айег йе стас!с!па с1уез Ьаче пнцгасес( ап арргорпасе г!(зсапсе сЬгоиаЬ сЬе ае! (р1еазе зее ТаЫе 7-7), снгп оЕЕ сЬе роччег знрр1у апс1 сбяпапс!е сЬе е1ессгорЬогез!з зес ир. Сепбу рту ир опе согпег оЕ сЬе !агз(ег а1азз р1асе апс! з1осч1у гегпоче сЬе р1асе 6..огп сЬе ае1.
Снс оЕЕ опе согпег оЕ сЬе ае! Еог опепсассоп ригрозез. А ЪССАСС!зСс!зСС ЧЧеаг еуе ргогееноп зчЬеп рту!па СЬе а!азз р!агез аратг. ТгапзЕег ЕЬе а!азз р1асе сопса!и!па сЬе ае! со а сгау сон!а!п)па ап ехсезз оЕ 10% ТСА. Сепс1у госх ог госасе сЬе сгау Еог !О пнпшез ас гоопс сепгрегаснге. ТЬе ее! ич!! ыиз!!у йоас оЕЕ сЬе е)азз р!асе <Ьзг!иа сЫз (исиЬаиои. Ро иос а!!озч сЬе Ноас(исс ае! со Ео!г( ир ои !ье! Е. Роиг оЕЕ сЬе 10% ТСА зо1и6оп апс1 гер1асе сч!сЬ ап ехсезз оЕ 1% ТСА. Сепс1у гос1с ог госасе сЬе сгау Еог 5 пнпшез ас гоогп сегпрегасиге. Ронг ой'сЬе !% ТСА зо1и6оп апс1 Ьпейу ппзе сЬе бхес1 це! ъч!ЕЬ с(!зс)!1ес( с!е!оп!хес1 Н О. Е!6 сЬе а)азз р1асе соаесЬег чч!сЬ йе це! онс оЕ йе сгау апс1 р1асе сЬегп оп а 6ас ЬепсЬ сор. АРР1у рарег сочче1з ог Кппчч!Рез со сЬе зЫез оЕ йе ае1 со гегпоче ехсезз Н,О.
Ро иос р!асе созче!з ои сор оЕ йе ае1. Сис а ргесе оЕ ЪСсЬасгпап ЗММ 6!сег рарег (ог ес!шча1епс) сЬас !з ! спс 1агаег сЬап сЬе ае! оп а1! яс1ез. ТгапзЕег йе ае! со сЬе 61сег рарег Ъу 1ау(па йе рарег оп сор оЕ сЬе ае! апс! шчегс!па сЬе и1азз р!асе. Кегпоче сЬе р1асе апс1 с!гу сЬе ае! оп а це! с!гуег Еог !.0 — 1.5 Ьонгз ас 60'С. ЕзсаЫ!зЬ ап ансогас!!оагарЬ!с (гпаае оЕ сЬе с16ес1 ае1. 5еап йе ппаае Ъу с1епясоспесгу ог РЬозрЬог!спарил, ог ехс)зе сЬе зеагпепсз оЕ сЬе ие! сопсаш!па сЬе Егаашепсз апс) соипс сЬепс Ъу )щи!с! зс!псс1!а6оп зрессгозсору. ргош сЬе зашр1ез спаса!и!ии з(сЕЕегепс ашоипь оЕ зсапз(ап( КгСА, а сигче оЕ шая челы гайоассйсу сап Ье сопзсгиссез(.
ТЬе апюиис оЕ сагаес зег(иепсез !и сЬе сезс ргерагзноиз оЕ КС СЛ саи сЬеп Ъе езсииасес! Ьу спсегро!асюи. Рго1осо! 12 Апа!уыил о1 КМА оу Рпгпег Ех1епьюп р х!мех кхтгк!яоск ь сскео сн!еегч то млр тнг 5' техм!м оЕ шК)ъ)Ак. А ргерагас!оп оЕ ро1у(А)' КЬ)А !к Вгкс ЬуЬг!Йхег) ъч!й ап ехсекк оЕ а к!п8!е-ксгапь!ег) о1!8ог)еохупис1еосЫе рПшег, гайо1аЬе1ес! аС Кк 5' Сегш!пик, чгЬЫЬ !к сошр!ешепгагу Со СЬе Саг8ег К)ъ)А. ТЬе епгусне гечегке сгапксПрсаке !к сЬеп окей со ехсепгс сЬе рПгпег. ТЬе геки!с!п8 сР)ь!А гк сошр!егпепсагу со сЬе К)ъ)А сепср!асе апд гк ег)иа! сп!еп8сЬ со сЬе с !ксапсе Ъесъчееп йе 5' епд оЕ йе рПпнп8 о1!8опис1еосЫе апг! сЬе 5' сегпнпик оЕ йе К)ъ)А.
!п сЬе ракс, рПшег ехсепяоп Ьак аЬо Ъееп икег! Еог агЫКюпа! ригрокек: со шеакнге йе аЬипдапее оЕ рагсйи1аг саг8ес шКХАк, со ъсесесс кр1ке чаПапск оЕ шКХАк, апг) со гпар ргесигкогк апд ргосекк!п8 !псегшег))асек оЕ гпК!ъ)А (Еог геч)еъч, р1еаке кее Воогксе!и апг) Сга!8 1989). Ноъчечег, ПЬопнс1еаке ргосесс!оп апг! пис1еаке 51 аккаук аге поъч ргеЕеггег) Еог сЬеке сак)гк Ьесаике оЕ йе!г 8геасег кепяйчЬу. )ъ)ечегсЬе!екк, ргнпег ехсепяоп гешашк йе Есгш сЬоке Сог йе шарр!п8 оЕ 5' сегпнп! оЕ шК)ъ)Ак. Опсе !и!с!асег) Ъу а ргнпег, сЬе ехсепяоп геассюп ВепегаПу ргосеедк со йе ехсгепсе 5' сеян!пы оЕ ап К)ъ)А сешр1асе апг) !ск к!хе сап Ье шеакнгег) ъчссЬ КгеаС асеигасу.
1п агЫНюп, СЬе!еп8СЬ оЕ СЬе ргог!исг гк ипайесгед Ъу СЬе ъ!!ксг!Ьиг!оп апъ! яке оЕ !псгопк !п йе саг8ес Вепе, ъчЬЫЬ сап сопЕонпг) сЬе шарр!п8 оЕ шК)ъ!Ак Ьу ЬуЪПйхасюп со 8епош!с сегпр!асек. Ягогс ехопк ас сЬе 5' сегпнпик оЕ ап гпКХА аге еая1у очес)ооЪег) сп псесЬ- ог)к кнсЬ ак пис!еаке 5! апг) К)ъ)аке ргосесс!оп сЬас ге!у оп г)!8екс!оп оЕ ЬуЬг)сЬ. А1шокс а!1 рПгпег ехсепяоп аяаук аге сагг!ег) оис ик!п8 купсЬесЫ о1!цопис1еосЫе рПпсегя 20-30 пис!еоСЫек гп !епВСЬ (Еог Епгйег г)ега!1к, р1еаке кее СЬаргег 1О). ТЬе ЬекС геки1Ск аге оЬса!пег) ъчЬеп о!!8опис1еосЫе рПспегк аге икег) йас ЬуЬг!йхе со саг8ес кеъ)иепсек 1осасес! ъчсйгп 150 пис!еосЫек оЕ йе 5' сегпнпы оЕ сЬе гпК)ъ)А. Ргннегк йас ЬуЪПйге со пъоге йксапс ясек сап 81че Пке Со Ьегего8епеоик ехгепяоп ргойюгк Ъесаике гечегке СгапксПргаке гпау кгор ог раые ш ге8!опк оЕ Ы8Ь кесопг!агу ксгисснге ш сЬе септр1асе К)ъ)А.
ТЬе г)ек!8п оЕ сЬе рПгпег кЬоиЫ йегеСоге са)ге шсо агеоипс йе рок!с!оп оЕ ЬуЬг!йгас!оп )п агЫ!с!оп со сЬе ассиа! кес)пенсе оЕ йе рПпсег. ъчЬегечег рокк!Ые, о!!Копие!еоСЫе ргнпегк кЬоиЫ Ьаче а СС сопСепС оЕ -5098 апг! кЬонЫ Ьаче а С ог С гек!сЬле ас йе 3' сегпнпик. 1йеа!!у, съчо ргнпегк кЬон! В Ье икегс йас ЬуЪгЫЕхе Со ге8!опк оЕ йе шК)ъ)А керагагег) Ьу а )гпоъчп йкгапсе (е.8., 20-50 пис!еоСЫек), РПшег ехСепяоп ргог)исск йас йЕЕег сп к!ге Ъу ап апсоипс еъ)и!ча!епс со йе йксапсе Ъесъчееп сЬе съчо ргппегк ргочЫе сопйппасюп оЕ сЬе геки1ск.
1с гпау Ъе песеккагу со купсЬеяхе кечега1 ргппегк !п огг1ег со Еспъс а ра!г йас у!е10 с!еап ехсепяоп ргог)песк. 7. 75 7 76 Отартег 7т Ехпасгтои, Ригтттсаттоп, аптс Апа!ук!к о! тй)к(А!тот Еи)тагуоттс Се!!к ОРТ1М171й(С РК1МЕК ЕХТЕ!Х!Ь1ОЫ КЕАСТ1О!ч!Ь 1п птапу сакек, сЬе ехсепяоп геаспоп чч!!! Вепегасе стчо ргот(исск: ти11-1еп8сЬ сР!ч(А пю1еси1ек апд гечегке сгапкспрск сЬас аге опе со стчо Ьакек кЬогсег. ТЬеке тау гергекепс Ьесегоцепеьу ас сЬе 5' сегпипик оГ сЬе тК)ч)Ак геки1стп8 !тот ти1с!р1е ксагс ясек от" сгапкспрсюп.
А)сегпастче!у, кЬогсег пю1еси!ек птау геки1с (тот ргетпасиге сегттпас!оп от" сЬе ехсепяоп геассюп ас йе тейу1асет) гекЫие пехс то сЬе сар ясе !п йе саг8ес тК)ч)А. ТЬе ксокЬтотесгу от сЬе сар-ге!асет( Ьапт)к сап чагу сгопт опе ргерагасюп от тпК)н!А со апойег Ьш ь ВепегаПу сопяапс сот а 8!чеп ргерагасюп. То т(!кс!п8и!кЬ Ъепчееп агйчась о( гечегке сгапксг!рс!оп апт( сгие ЬесегоВепеьу от 5' сегпиш, К ь а чету 8оог1 Ыеа (тт пос еккепс!а! со Вес йе геки1с риЫьЬет1) со саггу оис пис1еаке 51 апа!уяк чт!сЬ ргоЪек 1аЪе1ет( ас сЬетг 5' сегпипт (р1еаке кее Ргососо! 10). Ргерагат!опк от ро!у(А)' К!к)А утеЫ пшсЬ с!еапег геки!Ск сЬап ип)гас!(опасес) ргерагаВопк от' птатшпа!тап К)ч)А, ччЬкЬ ойеп у!еЫ ап ипассерсаЫу Ь!8Ь пшпЪег от" ргетпасиге1у сегпипасет) ехсепяоп ргот(исск.
ТЬтк агс!тасс сап Ье пиппшгет! Ьу регтогт!п8 йе геасс(оп тп сЬе ргекепсе от" Ь18Ьег (5 тм) сопсепсгасюпк о( т()ч!Трк апт) ияп8 а рптпег сЬас ь соптр1ептепсагу со кет)иепсек йас 1!е тч!СЬ)п 50 — 100 пис!еосЫек от йе 5' сегпипик от" сЬе тпК!к)А. Ас опе типе, К ччак таит!аготу со рипту сЬе о1!Вопис1еосЫе рпптегк Ьу ро(уасгу!аптЫе Ве! е!есСгорЬогеяк Со гепюче кЬогтег тпо!еси1ек (ВоогкСеш апд Сга!8 1989). ТЬеке даук, Ьотнечег, птапу !очек!!Васогк до пос Ьойег тчтсЬ рипйсаВоп ип1екк йе апа!уык ь сотр1!сасед Ьу йе регяксепс ргекепсе от а 1атЫег от" ехсепяоп ргот(исса.
ТЬе о1!8опис1еоСЫе рптег кЬоиЫ Ъе ргекепт !п аЪоит Сеп(о1д пю!аг ехсекк очег СЬе Саг8ет тК)к)А ш тЬе ЬуЬпт)тгастоп геасс!оп. ТЬе ргекепсе ог" !агат с!иапй4ек оу ргипег тау геки!с ш попкрестттс рпт!п8 апд СЬе арреагапсе от агт(тастиа! Ьапг(к. 1с Ь сЬегетоге адч!каЫе Со саггу оиС а кепек от" р11ос геассюпк йас сопсаш а сопксапс атоипс от" К)к)А апд т(!йегепс атпоипь от ргипег — икиа11у 20 — 40 тто1ек (- 104 со 10' срт). ТЬе аппеа1!п8 сетрегашге сап 8геас)у айесс йе т)иа1тсу от' йе геки!ск от рптег ехсепяоп ехрегипепь, апт( Ь Ь сЬеге!оге тногй !пчекВп8 коте итпе !п рге1иптпагу ехрептепь со т(есегпипе йе орсипа1 аписа!!п8 сетпрегасиге.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
