Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 179
Текст из файла (страница 179)
(1986) аиг! НаЬи ес а!. (1989). 13. 14. Кеточе йе сиЪеа сопсалп!п8 сЬе оП8опис1еосЫе ргипег апс1 К!ч)А 1гот йе ъчасег ЬасЬ апс1 с)ерояс йе Пи(6 (и сЬе Ъаае оЕ сЬе сиЬеа Ьу сепспЕи8(п8 Еог 2 аесопсЬ (и а т!сгоЕи8е. 15. АсЫ 24 )л! оЕ вирр!етептес( рптпег ехсепяоп ппх со еасЬ сиЪе. Сепс1у ипх сЬе тю1и6оп ш 1Ье сиЬеа апс1 а8аш с(ерояс йе!и!иЫ ас йе шЪе Ъоссотх Ъу септпбл8асюп. 16. !псиЬасе сЬе сиЬеа Еог 1 Ьоиг ат 42'С со аПочг сЬе рптег ехсепяоп геассюп со ргосеей 11.
АсЫ 2.2 )л! оЕ 1.25 ьт КС1. Ъогсех йе аатр1еа 8епс1у апс1 йеп с(ероа!с йе ЙиЫ ш сЬе Ъаае оЕ йе СиЪеа Ьу септп6л8!п8 Еог 2 аесопс!а ли а ппсгоЕи8е. 7.80 СЬаргег 7: ЕхсгасНоп, Риту|гас|оп, апс( Апа!уз|с и)' тКНА)гот ЕиИагуог|с Се!!г ! 7. Тегиииасе |Ье ргииег ехсеияои геассюиз Ъу |Ье айд!с!ои оЕ 200 р! оЕТЕ (РН 7 6), 100 р! оЕ ес!ш1!Ьгасед РЬеио! (РН 8.0), аид 100 р! оЕ сЫогоуопи. Ногсех Еог 20 зесопдз. 5ерагасе ас)иеоиз аид ог8аи|с РЬазез Ъу сеисп6|8айои Еог 4 гпнш|ез ас гооги сешрегасиге !и а ш|сгоуи8е. ТЬеге ь ойеп а сопяйегаЫе агпоипс оЕ гасооасисй|у геша|пш8 |и |Ье чгеН оЕ |Ье ро!уасгу!агпЫе 8е! аусег е1ессгорЬогеыз (5сер 22 Ье!огч). |п оиг Ьапйз, |Ьеге Ь гаге!у а сопе1асюп Ьеспееп сЬе а|паап| оЕ сЬЬ гасаоассеасу |п сЬе пеН апй йе апюипс оЕ йе йеыгей рп|пег ехсепяоп ргойисс.
ТЬе а88ге8а|ей гпасеиа! |п сЬе зчеН и|ау гергезепс |оп8ег ехсепяоп ргойись йепчес| Ьу зриг|ось рпгпш8 оЕ |Ье о88опис1еосЫе оп попсаг8ес шВХАз ог сопсапппадп8 8епопие Р)з)А сеп|р1асез. Ваге!у, сЬь Ьас)|8|опий сап гергезеп| а88ге8асез оЕ |Ье йез|гей рп|пег ехсепяоп ргойиес ъ!сЬ пю1еси!ез о( ВХА. |Е |Ьеге Ь а я8п|йсапс агпоипс оЕ гасооасйч|су сгаррей ш |Ье пеН оЕ йе Не|, сгу сгеас|п8 сЬе рпп|ег-ехсепйей ргойись айаг 5сер |6 п|сЬ КЫазе: Айй ! и! оЕ 0.5 хс ЕРТА (рН 8.0) апй ! и1 оЕ Р)з)азе-Егее рапсгеаис КНазе (5 ш8/ш!) (р1еазе зее Аррепгйх 4) со еасЬ и|Ъе апй шсиЬасе сЬе геас|!опз Еог 30 пшпиез аг 37'С. А|Ы |50 р! о(ТЕ (рН 76) сопеа|пш8 О.! М Хас! апс| 200 и! о| рЬепоЬсЫого(опп.
Чогсех Еог 30 зесопдз, апй сепсиЕиае ас гпахитиип |реей Еог 5 |шише| ас гооп| сеп|регасиге |п а ш)его(и8е. Сопс|пие сЬе ргососо! ас 5сер |8. А|сегпас|че1у, сЬе рпгпегехсепдей ргойись йо|п 5сер |6 сап Ье сгеасей и!|Ь )з)аОН |о Ьуйго!ухе сЬе КХА сегпр1асе рпог со е!ессгорЬогеыз: А|Ы !.0 ф оЕ |О и )з)аОН со |Ье зо|идоп апй шеиЬасе Еог |О ппписез ас гоо|п сегпрегасиге. )зсеисгаНсе сЬе )з)аОН Ьу йе а|Ы|сюп оЕ опе-сепсЬ чо1шпе оЕ 3 м зосошп асесасе (рН 5.2) апй сопешие йе рго|осо! аС 5Сер |7.
Рог!Йса6оп апе! Апа!у818 ог йе Ргшег Ех$еп5!оп Ргог!оса Со11есс |Ье ргес|р|сасед иис!ек ас!дз Ьусеиспй|8апои Еог !0 гишшез а| 4"С ш а ш|сгоЕи8е. Саге6|!1у пизе йе ре!!е|з зч!|Ь 400 р1 оЕ 70% е|Ьаио!. СеиспЕи8е аца!п Еог 5 иииисез ас 4'С аид геиюче йе 70% е|Ьаио1 пизе сч|сЬ а р|репе.
5соге |Ье ореи сиЬез ас гооги сешрегасиге ии61 а!1 ч!яЫе сгасез оЕ е|Ьаио! Ьаче ечарогасед. 19. Иззо!че йе иис1е!с асЫ ргес!Рпасез !и 10 р1 оЕ ЕопиашЫе 1оад|и8 ЪиЕЕег. Р|регсе |Ье заш- р1ез ир аис1 досчи со аззьс гезизреиыои. 20. Неас йе зашр1ез Еог 8 иииисез а| 95"С. ТЬеп р1ии8е йе сиЪез ш|о аи ке-гчасег Ьай апд |шшед!асе!у аиа)ухе йе рпшег ехсеияои ргос1ись Ъу е1ессгорЬогеяз йгои8Ь а деиасипи8 ро1уасгу1ашЫе Не1. Епй! аЪ с|ей РЫА Ега8шепсз оЕ)спогчп а|хе зЬои|й Ье изей аз шо!еси!аггее!8Ь| спаг1|егз оп |Ье 8е! (р|еазе зее сЬе со|егьа!оп оп Орсип|х|пх ргппег Еяепз|оп Кеасиопз |п сЬе |псгойиесюп со й|з ргососо!).
21. Айег сЬе ггасЫи8 дуез Ьаче ш|дгасес1 аи арргорпаге с1|зсапсе |ЬгоиНЬ йе 8е! (ТаЫе 7-7), сиги оЕЕ йе розчег зирр1у апд д|зшаис(е |Ье е!ессгорЬогеяз зесир. Сеп|1у ргу ир оие ед8е оЕ |Ье 1агцег 81азз р1асе аид з!огч1у геиюче |Ье р1асе Его|и йе Не1. Сис оЕЕ оие согиег оЕ |Ье Не! Еог опеи|асюи ригрозез. я чЧАН)ЧНЧС Ъчеаг еуе ргогесдоп зчЬеп ргу|п8 |Ье 8|азз р1асез арагс.
1Е а ро1уасгу!ашЫе Не! 1.0 иии ш й|с1|иезз зчаз изей, йх йе Не1 |и ТСА. Тгаизуег йе 8!азз р1аге соига|ши8 йе Не! Со а Сгау соига!и!и8 аи ехсезз оЕ 10% ТСА. Сепг!у гос)с ог гога|е йе Сгау Еог 10 ииишез а| гоош Сешрегагиге. ТЬе 8е! чдН иы|аау Яоа| оЕЕ сЬе 8|аь р|асе йипп8 |Ыз |псиЬасюп. Ро пос аооп сЬе 8е! со ЕоЫ ир оп |ье|Е. ТЬ|з |сер Ь пос песе||агу |Е а сЬ|п 8е1 (0.4-пип сЬ|с1|пея) счаз изей. |п дг!з сазе, ргосеей со 5сер 26. 23. 18. Ргес|рйаСе йе иис1ек ас(дз Ьу йе асЫЬюи оЕ50 р1 оЕ 10 Ы апииошши асеСаСе ап|1 700 01 оЕ ейаио1. М|х ъче11 Ьу чогсех|и8 аид шсиЪасе ейаио1 ргес|р!|айоиз Еог ас 1еая 1 Ьоиг ас -70'С.
Ргогосо1 17х Апа!ухи о~ЯМА бу РПгпег Ехгепяоп 7.81 24. Ропг оСТ йе !Ос~а ТСА яо1п6оп апс! гер1асе п счссЬ ап ехсеаа о! !о о ТСА. Оепс!у гос1с ог госасе йе Сгау Сог 5 ш!ппгеа аС гоопс Сешрегаюге. 25. Ропг оК йе 1% ТСА хо!ос!оп апс! Ъпебу Нее сЬе 6хес! це! счссЬ йхс61есс ссеюпиес! Н,О. 116 йе 51аах р1асе соцесЬег ъч!сЬ йе це1 опс о! йе сгау апсс р1асе йегп оп а бас ЪепсЬ сор.
Арр!у рарег сочче1х ог Кппсчсрея со сЬе я!с!ех о! йе це1 со гепюче ехсеах Н О. Ро пос р1асе соусе!ь оп сор оС ае!. 26. Спс а рсесе оГ ЪгЬасшап ЗММ 61сег рарег (ог ес!шча1епс1 йас !х 1 сш 1агаег йап сЬе ае! оп а11 яс!еа. ТгапаГег сЬе Ее! со йе 61сег рарег Ъу 1ауша йе рарег оп сор о! йе Ее! апс! 1пчегсш5 сЬе ц1ахх р!асе. 27. Кешоче сЬе р1асе апс1 с1гу сЬе Ее1 оп а Ьеас-аахсасес! часпшп-с1пчеп це! с1гуег !ог 1.0-1.5 Ьопгх ас 60"С. 28. ЕхсаЫ1аЬ ап ипате о! йе це! папа апсогайоцгарЬу ог РЬохрЬогсшарп6. 7.82 С/таргет 7: Ехттасттои, Ритфсаг)оп, апт/Апа!уыз о/ шЯ)ъ/А /тот Еи/татуоттс Се//з НОЪЧ ТО Ъ$/! $5$ ТНЕ ВАТТЕЕ ЪЫ1ТН ЙМА5Е Маву ап ехрегниепс Ьаз Ьееп пеев!еы!у ги)пет$ Ьу сопсапипасюп чйсЬ ВХазе. Ноъчечег, ргоЫепь ъчтй ехоцепоть КХазе сап Ье епбге1у ачоЫей Ьу ч)цйапс тье оЕ ргорЬу1асис тпеазигез апт1 сЬе ргийепс аррйсасюп оЕ сопипоп зепзе, 1в оиг ехрепевсе, сопсапипа6оп ъчйЬ ехоцепоть КХазе тозс Егес)иепс1у агьез Егот съчо зоигсеы ° Сопташ!пасет/ Ъа/)тетзт Ву саге1езз гье оЕ азер6с сесЬп)с)ие, Ьийеь Ьаче Ьесотпе сопсат)пасет) ъч)сЬ Ьассепа ог осЬег т)сгоогцапыпз.
ТЬе цгоъчсЬ оЕ сЬезе пвсгоогцапЬпь Ь пос изиайу тйяЫе со йе па)сей еуе апй пеей пос Ье йогЫ со сатье ргоЫепь. Весаше КХазе саппос Ье геточет) Ьу аисос1алпц, зо!ибопз йас аге сопсапипасес$, ог аге зизрессет$ оЕ Ьешц ш, ппьс Ье сйзсагйес1. ° Аигошайс р/ретт!пц т/еч!сезт ТЬеге ь ытпр1у по ротпс тп иыпц сйзрозаЫе р)репе 6рз йас аге Егее оЕ КХазе тЕ йе аисотаск ртрессог Ьаз Ьееп тес! Ргечюиз!у со с)Ьрепзе зо1и6опз сопсатптпц ВХазе, Еог ехапър)е, диппц ргосезыпц оЕ япай-зса1е р!аыпЫ ргерагабопз ог, ечеп ъчогзе, тп пЬопис!еазе ргосес6оп аззауз. И сЬе Ьагге1 ог йе теса! е)ее!от оЕ сЬе ашоптабс р)рессог сотез тп сопсасс ъч!сЬ сЬе ят)ез оЕ сиЬез, сс Ьесотпез а чету ейксепс чессог Еог сЬе йззепивасюп оЕ КХазе.
А тпапспс Ъейеу ш сЬе роъчег оЕ гиЪЪег ц)очез со ъчагй ой ргоЫепь чйй КХазе Ьаз са$теп гоос ш тпапу )аЬ- огасопез. 1п сгий, Ьоъчечег, зпарршц оп а расг ог съчо оЕ гиЪЬег ц)очез ь аЬош аз изеци) аз саггутпц а гаЬЬссз Еоос. Р)гзс, йе Ьа)г ог ЬеагсЬ оЕ Епчез6цасогз аге тпоге ПВе!у со Ье сЬе си1рпь йап йе Ьапйз, апд пюге яцшйсапс!у, ц1очез сап оп!у ргочк!е ргосессюп ип61 йеу соисЬ а зигЕасе сйас Ьаз Ъееп ш сои!асс ъч)сЬ зЫп. То Ье оЕ апу изе ас ай, ц1очез тиы Ье сЬапцед ечегу шпе а ртесе оЕ аррагасиз ь соисЬед, а геЕт)цеха!от орепес$, ап тсе-Ьис1сес ййес$, ап ешгу ъчппеп тп а 1аЬогасогу посеЬоо1с, а геацепс теашгес$.
ТЬь ь пе)сЬег ъч)зе пот ргасбсаЫе. ъътеаг ц!очез, Ьис с1о пос Ье!тече сЬас сЬеу ойег ргосес6оп ацатпзс КХазе. Моте зепяЫе тпеазигез шс1ис)е сЬе Еойоъчшц: ° Кеер а ареста! зес оЕ аисотайс ртрессогз Еог ше ъчЬеп Ьапсйшц КХА. ° цес азЫе йепь оЕ ц1аззъчаге, ЬассЬез оЕ р1азбсиаге, апй Ьий:егз сЬас аге со Ье изет) оп1у Еог ехрегпвепсз чйсЬ КХА. ° йоге ъо!и6оп/Ьийегз ш зтай айииосз ап<$6Ьсагй еасЬ а!нрюс айег изе. АчоЫ тпасепаЬ ог зсос1с ш1исюпз сЬас Ьаче Ьееп шей сот апу осЬег ригрозез ш сЬе!аЬогасогу.
° цес аяс$е ареста! е1ессгорЬогеяз йеч)сез Еог изе ш сЬе зерагасюп оЕ КХА. С!еап сЬезе с$елсез ъчпЬ т)есегцепс зо1исюп, пизе ш НтО, с$гу ълсЬ есЬапо1, апт$ сЬеп ЕП1 ъч)сЬ а 3% зо1исюп оЕ Н О . Айег 10 пиписез ас гоотп септрегасиге, пизе сЬе е1ессгорЬогезЬ сап1с йогоицЫу ъчйЬ НтО сЬас Ьаз Ьееп сгеасес$ ълй РЕРС /р)еазе зее сЬе шсогтасюп рапе1 оп Р)ЕТНУЕРУКОСАКВОХАТЕ). ° Ргераге ай зо1исюпз апд Ьийегз ъчтй КХазе-Егее ц1аззъчаге, РЕРС-сгеасей ъчасет, апй сЬеписа1з гезегчес$ Еог ъчог1с ъчйЬ КХА сЬас аге Ьапсйет$ ълсЬ сйзрозаЫе зраш1аь ог сйзрепзед Ьу сарршц йе Ьосс1е гасЬег йав иыпц а ъраси1а. ъ!/Ьетечет роьгЫе, сгеас зо1ипопз ъчйЬ 0.)сй РЕРС Еог ас 1еаы ! Ьоиг ас 57'С авс$ сЬеп аисос!аче Еог 15 пшшсез ас 15 ры $1.05 $сц/стп') оп Пс)шс$ сус1е. ° Аисос1алпц ц!аыъчаге апй р1аз6съчаге тпау пос Ье зиЕйс)епс со )пас6часе КХазе. Ва1се ц1аззъчаге Еог 4 Ьоигз ас 300'С.
Тгеас р1аыкъчаге е)йег ъч)сЬ РЕРС ог сотпкчс)айу ачайаЫе ргодиссз сЬас шас6часе КХазе пров сопсасс !е.ц., КХазеЕар Егот АпъЪгоп 1вс.). ° $/зе сйзрозаЫе 6рз апс$ т)сгоЕице сиЬез сегйусеъ$ Ьу а герисаЫе тапиЕассигег со Ье Егее оЕ КХазе. То гет)исе с!ъе сЬапсез оЕ сопсаштпабоп, и Ь Ъезс со изе ыеп1е Еокерь ъчйеп иагьЕепшц йезе зпъай )сегвз Еготп сЬесг опц)па! Рас)сацез со 1аЬогасогу гас)сз.
° $/зе шЬтЬтсогз со зирргеы ВХазез с$иппц сЬе ьо!абоп оЕ ВХА !Р1еазе зее сЬе тп!огтпа6оп рапе! оп ПХН1В)ТОК5 ОГ КХАзгз). Тл)от|па!тол РапеЬ 7.83 !)ч)Н!В!ТОКАЯ ОГ !4ЯАВЕ5 КХааек аге гоЬгьс апй ро|чег6л) епгутеа йас аегюиа)у йгеасеп |Ье шсе8псу о! КЛ)А ас аП аса8еа о! |ь Ьо1а6оп апй сЬагассепга6оп. ТЬгее сурет оу шЫЬ)сота аге соттоп1у слей со )теер йе ас6ч)су оГ КХааез ш сЬес1о ° Ет!ет)ту!ругосагЬолате ()3ЕРС), а ЫВЫу геасбче аП|у!асш8 а8епс, ь и|ей со |пасбча|е КХааеа ш Ьи!уега апй оп 81ааатчаге. Весаиае 13ЕРС шсП|спиипасе1у июс66еа ргосеша апй КХА, П саппос Ье и|ей йипп8 ьо1асюп ап|1 рип6сасюп оу К!4А апй Ь шсоп|ра6Ые чйсЬ ютпе Ьи)Тета (е.8., ТгЬ). Рог 6|гсЬег йесайя р1еаае аее сЛе )пуоппасюп рапе1 оп О! ЕТНУЕР|КОСАКВОХАТЕ. ° Налайу! т!Ьолис!еоа!йе сотар!ехеа аге сгапясюп |саге апа!оЕь |Ьас Ь|пй со сЬе асбче ясса о! тпапу К)4ааеа апй шЫЬ|с |Ье)г саса1у6с ас6| Пу а!тпоас сотр!есе1у (Вег8ег апй В)т)тенте)ег 1979).
Веса|ье чапайу! пЬопнс1еааеа йо пос соча1епйу тпойуу КЬСааеа, йеу тпиас Ье нвей ас аП аса8еа от" КХА ехсгассюп апй рип6сабоп. Нотчечег, Ьесаые сЬеае согпр1ехеа |пЬ|Ьи КЛ)А ро!утегааеа апй |и чПго сгапа1а6оп, сЬеу тиас Ье геточей !тот сЬе 6па1 ргерага6оп от" КХА Ьу пш!6Р1е ехсгасс)опа тч)сЛ РЬепо) сои|а)п|п8 0.158 Ьуйгоху|!испо!ше. Напайу1 пЬопис1еояйе сотр1ехеа аге ачаПаЫе |тот аечега! сопипегс)а1 еиррПегя ° Ртотетл !л)л!Ыгота оу КХатея Мапу КЫааеа Ь)пй чету 68Ы1у, а1Ьеи попсоча!епс!у, со -50-)тЕт ргосе|па 1оипй |п |Ье сусор!аяп о! ч)гсиаПу аП тпаиипаПап сЬялеа апй сап Ье ьо!асей!п аЬип|1апсе !готп р1асепса (В1ас)тЪигп ес а!.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
