Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 145
Текст из файла (страница 145)
Очеп, ргеяег Го 60'С ТЬе очеп яЬоп16 Ье сараЫе оЕ гпа1пга!гл1па а геплрегагше оЕ 60'С Еог 12-16 Ьошя. Кос)г1па р)агЕогт Тиррегччаге сопяатегя ТЬеяе сопгагпегя яЬоп!6 Ье аЫе го иЕЕЬягапг! ехсепг1егЕ ЕпспЬагюпя аг 60'С. Се!!5 апг! Т!55гяеь СеИя дгопггпд т 96-сеП р!а1ея Се11 сп!гпгея ш !пб5чЫпа1 Яаг-ЬоггогпегЕ гче1!я оЕ 96-лче11 11яяпе сп1гше р!алея яЬоп16 Ье агогчп го сап!!пенсе, ог с!ояе го Ь. ТЬеяе р!алея аге ача11аЫе Егогп гноя! япрр!гегя оЕ гпагепа!я пяегл гог г1яяпе сп1гше. ЕаЬе! ЬогЬ гЬе горя апг1 ЕЬе Ьоггошя оЕ гбе 96-лчеЕ р!алея гчЬеп лчогЫпа ъчггЬ гпоге Ебап опе р!аге.
МЕТНО0 1. Кешоче йе шейшп Егопл сопйиепГ си11игея оЕ се1!я Вгоиг1п8 Еп Епг))чЫиа! чге11я оЕ 96-ъче11 р1агея Ьу аяр!гаг!оп ЕЬгоиаЬ а Ыие р)репе г!р ог а Раягеиг рлрегге. Ая 1опа ая саге Ь са1геп го ачоЫ гопсЬ|па ЕЬе се11 !ауег, ЕЬеге ь аепега!1у по пеег! со ые а !теяЬ р1реие бр Еог еасЬ гче!1. 2. В)пяе ЕЬе пюпо1ауегя оЕ се11я Еп ЕЬе шд)ч!сЬла! гче!1я гччке ъчЬЬ 100 р1 оЕ РЬоярЬаге-ЬиЕЕегег1 яа! ше. 3. Е)яе а ши111сЬаппе! Р)реггог го агЫ 50 Ег! оЕ се!1 1уя)я ЪиЕЕег го еасЬ гче11 оЕ ЕЬе пнсгойег р1аге.
Р1асе яечега! чче! Рарег гочче1я гп а ро1ургору1епе Ьох (е.ц., а Тиррегччаге Ьох) апг) ЕЬеп ягас1с йе писгог!Еег р!алея сопсашша йе!уя)я Ьийег апг) се11я оп гор оЕ ЕЬе сочче1я. 5еа1 ЕЬе Ъох 118Ь11у чч)ЕЬ йе 1Ы. 4. 1псиЬале йе яеа)ег) Ьох Еог 12 — 16 Ьошя Еп а 60'С очеп. 5. Кебиче ЕЬе Ьох Егогп ЕЬе очеп, р1асе йе р1агея оп а Яа! ЬепсЬ гор, апг! а11очч ЕЬеш го соо! Еог а Еечч пнпигея Ьеуоге асЫ)п8 100 Ел! оЕ ХаС11егЬапо1 яо1игюп рег чче11. Моте ЕЬе р1асея Еог 30 пнпигея аг гоогп гегпрегагиге ччЕЕЬоиг ш)хшц.
А ягг)пну ргес!Риале оЕ пис1е!с асЫ яЬои18 Ье ч!я!Ые аг йе епг) оЕ ЕЬе шсиЬаВоп. 6. 51очч1у лпчеп еасЬ р1асе очег а Ып1г го г1есап! ЕЬе егЬапо1к яо!иг)оп. ТЬе ргес!РЬасег1 пис1ек асЫ яЬоиЫ гешалп апасЬес1 го ЕЬе Ъаяе оЕ ЕЬе ччеПя. Р1асе еасЬ р1аге ш ап иря)сне г!оччп роя!г!оп оп а Ьег) оЕ г!гу рарег гочге1я апг) а11очч ЕЬе геша!п)п8 егЬапо1 го г1гаш Егош ЕЬе р!аге. 7. АгЫ 150 Ег! оЕ 7096 ейапо1 го еасЬ чче!1, Ъе!пц сагеЕи1 по! Ео г)1я)ог)8е йе ргеслрЬаге оЕпис1ек асЫ. Ел)ясагг) ЕЬе 70Уо егЬапо1 Ьу Епчегг!па йе р1аге ая 1п 5гер 6. 81ог ЕЬе ехсеяя 1Ег!шд оп а Ьег! оЕ рарег !отче!я. В)пяе йе ргесгрЬасея оЕ Ел)ч)А гччке гпоге ччпЬ 7096 егЬапо1. 8.
А1!очч йе р1агея го г)гу аг гоогп гешрегагиге ип81 йе 1аяг сгасея оЕ ейапо1 Ьаче ечарогасей 1Е ЕЬе Вепош)с ЕЛ)ч)А Ея го Ъе апа!ухег) Ьу РСК, ЕЬеп ргосеег) го 5гер 9. 1Е ЕЬе 11)чЕА Ея го Ье апа1ухег1 Ьу 5оийегп ЬуЬгЫ!хаг)оп, ргосеег1 го Меря 10, 11, апг! 12. 6.22 СЬаргег 6: Ргерагайоп апг( Апа!уг(г о~Еи)еагуос(е ъ епопг|е Е|ХА А001Т!О)ъ(АЕ РКОТОСОЫ ОРТ!М!Х!Еъ(С СЕ(ъ(ОМ!С 0(ъ(А 15ОЕАТЕО(ь( РОК РСК Сепоп Ис 0)ъ)А, !ю!асес( Ьу 1Ье исе(Ьосс 8!чеп аЬоне, сап Ье июсГ аа 1епср|а1е !п асапс|агс( РСКк Ноъчечег, гог ! пюге с|егпапйпИ Суреа о1 РСК (е.е., !опк РСК; аее СЬар1ег 8, Рго(оса| 13), И В Ье((ег 1о иае а чапаИоп |и ъчЫсЬ асеСопе апс( Аг,Х-сс!пъе(Ьу((огпсапск(е аге иаес) Со ргес|рИа|е 014А )п СЬе 96-иеИ р|а|е (Ос)у апгс Ечапь 1994).
И (Ье ьо|асес1 0)ъ(Ая ъчИ( Ье иаесГ оп|у аа сеигр1асеа Гог РСК апс| по1 Ье апа!уеег) Ьу 5ои(Ьегп ЬуЬпйгасюп, ЕЬе сеИа !п сЬе и е|В оГ сЬе п ИсгосИег р|а1еа сап Ье!уаесГ |и а ю|исюп ЕЬас ь сопсраИЫе ч8(Ь РСК. Еуъь |и юсЬ а Ьи((ег аИои а РСК со Ье сагпес! оис йгесс|у |п |Ье |уаВ ю|иИои апс! еИгп(па(ее |Ье пеес| Еог есЬапо) ргес|р|са1юп апс( ппа(пИ. ТЬе съчо ргососо1а 8|неп Ье|оъч аге гоЬиас апс! и ос)ъ ъчеИ иа!ЕЬ а чапе|у о( 1Ьеггиоа|аЫе 06)А ро!уисегааек САСТ1ОХ: Рсеаае гее Аррепйх 12 Еог арргориа|е ЬапдИпИ оГ гпа1еиаВ игаг(ъег( иИЬ к! ). РКОТОСОЕ А Масег!а1я РСК Гуа)я ю)иИои А 67 пъм ТиаиС! (рН 8.8) 16.6 гпм аиспюп!иис юИа1е 5 гпм И-гиегсарсое(Иапо) <! > 6.7 гиМ МИС( 6.7 им Е0ТА (рН 8.0) 1.7 РМ 505 50 щ'ги( ргосе(паче К Ме1Ьос1 1.
Кегпоне (Ье гиейа 1гоги си((игеа о( се|В егоисиИ |и 96-и еИ р|асек 2. 0еИнег 100 а( о( РСК )увь ю|ибоп А )п(о еасЬ ъчеИ апс| !уае СЬе сеИа Ьу (псиЬа((оп Гог 1 Ьоиг а1 37'С, 1оИоъчед Ьу а 10-0 Ипи1е |псиЬаИоп а1 80'С Со спасИна(е СЬе рго(е)пасе К. 3. 0ае 5-25-и! аИс(иоЬ о( СЬе 0)ъ)А ргерага(!опа аа Сепър)а(еа |и РСКк РКОТОСОЕ В (Кбпсдеи аисс 51еигаг! 1993) Масег!а1я РСК Гуг)а ю|ийои В 10 гпм Тпа-С) (рН 8.3) 50 гпм КС| 2 гим МКС) 0.45;4 (ч)н) )ъ)оп(с(е( Р-40 0.45,4 (н)ч) Тъчееп.20 20 ие)ги! рго(е!паче К сугасе Ьи|)ег 670 гпм ТпьС| (РН 8.8) 166 гим апсгпоп)иис ы1(а1е 1 исИггп) Ьоч|пе аегиги а|ЬипИп МесЬо с| 1. Кегпоче СЬе гпес1югп (гоги си)(игеа о( сеИь Вгоъч(па (п 96-ъчеИ р|асек 2.
0еИнег 50 и! оЕ РСК!уаВ ю|исюп В !псо еасЬ ъчеИ апс! (уяе ГЬе сеИа Ьу |псиЬа1юп онеги(ИЬС а1 37'С, Го|- 1оъчесГ Ьу а ЗО-ги|пи1е |псиЬаИоп ас 95чС 1о |пасс!ча1е ГЬе ргосе(паае К. 3. То еасЬ 1уаа(е ас(сГ ап ес(иа( чо)ииъе о( а (уаа(е Ьи(Еег. 4. 0ю 10-50-и) аИсрзоЬ о( СЬе 0)ъ(А ргерага(юпа аъ Сегпр|а|еа |и РСКа. Ргерага6оп о1 Сепогп~с 0МА ггогп Моите Та~В апд Обжег 5гпа1! 5атр1еь о ч(8 тнг чгл85, млнч Ркотосог5 (ох тнг гхтклст|он о( Р)ч(А Егош пюиае са(!а Ьаче Ьееп риЫЬЬе|1, а!шоас а1! о( йеш г)еасепг)апса оЕ йе оп8!па! шесЬог) |1ече1оре|1 Ьу В!сЬагг) Ра!иисег ап|1 Ва1РЬ Вппасег (и 1985 (Ра1писег ес а1. 1985).
Ра1иисегЬ 1аЪогасогу лчаа |п 5еагс1е, лчЬ!1е Вппасег апг) Ь!а йогьап|Ь оЕ лисе счете 3000 ш!!еа а|чау ш РЬ~1а|1е1РЫа, Вппасег ччои1Й аи!р Ега8шепса оЕ са|!а Его|и |Ье лисе, р!асе йе|п !и а |ю1ииоп оЕ ВР5 апд ргосешаае К, ап|1, ш сЬоае рге-рег)Ех дауя |чои!6 аЬ!р |Ьеш со Ра1писег Ьу !)5. Ма|1. АЕсег йе!г 2 — 3-|1ау )ошпеу ас ашЬ|- епс се|прегашге, сЬе аашр!еа |чете ехсгассе|1 лч(сЬ РЬепоЬсЫогоЕопи, апд сЬе Веиошк РЬ)А ччаа гесочегес) Ьу ргес!РЬабоп |чЬЬ ейапо!. 5иссеы чч!сЬ сЬ)а шесЬос) Еогсииасе!у г)оеа пос ге|)шге епсгизс)п8 аеш(й8еасе6 шолье рать со сЬе саге оЕ йе Р5. Риала) ауасеш. 1пасеай йе ЙВеа6опа сап Ье июге сопчешепс!у сагпе|1 оис очегшВЫ ас 55"С, лч!|Ьоис сгапарогсасюп. ЕасЬ са!1 ап)р- реС Вепегагеа 50 — 100 С|8 о( РХА йа| сап Ье ые6 |и дог ог а1ог Ыо|г!п8 Со г)егесг а Сгапа8епе оЕ !псегеас, |п 5оисЬегп ЬуЬпйха6оп со |1есесс РХА Ега8шепса йас аге <20 )|Ъ |п ыхе, ап|1, июге ехрейепс!у, аа а сегпр1асе |п РСВя ТЬ!а яшр1е ргососо1 сопс)пиеа со Ье иаег) ш Ьип|1ге|Ь оЕ 1аЪ- огасопеа Еог Вепосурш8 сгапа8еи!с ап|1 )спос)г-оис лисе ап6 Еог ехсгасбп8 РХА Егош япаП пшпЬега оЕ си1сше|1 се1!а ог Егош Ега8шепса оЕ с!ааие.
Тсчо чапапь оЕ |Ье Ьаяс ргососо1 аге иаери1 лчЬеп ргосеаяп8 чегу !аг8е пшпЪега о( аашр!ея ТЬе шейо|1 оЕ 1.а|г|1 еС а1. (1991) опиЬ ех|гас6оп |чИЬ РЬепоЬсЫого(опп, лчЬегеаа йе ргососо!а с)еаспЪед Ьу ТЬошаз ес а1. !1989) апд Сипае ес а1. (1994) гье сопипегс!а1!у ача|1аЫе Ве1-Ьагпег сиЬеа со е1!пипасе йе сейо|ь сгапаЕег о( аашр)еа йлпп8 аепа! ехсгассюп лч)сЬ ог8апк |ю1чепся ТЬеае чапасюпа аге г)еасг!Ьег) ш йе а1|егпабче ргососоЬ ас йе епг) сЬ|з ргососо1. МАТЕИАЕ$ САССТСО|Ч: Р!еаче чее Аррепйх 12 (ог «рргорпа|е Ьаог)!и|8 о( гпагег(а1а шаг)гег) чч|СЬ (! >.
ВслЕЕег8 ап(1 Ьо!ос1оп8 Рсеаае аее Арреийх С Еог соп|ропепЬ о( агос)г ао!и6опя ЬиЕ(егя апг( геадепгя 01!и|е агос)г аосиС!опа Со йе арргорпа|е сопсеп|га6опя Е(Ьало) !|юргорало! РЬело(|сЫого(огт|Ьоату! а!соЬо( (25:24: С чгч) < С > РЬоарИасе-Ьи((егес( ха((ле 6.23 6.24 СЬартет бг Ртерагапои алт( Ала!уь(я о)" Еи(сатуог!с Селоттс РИА 5(ч)ЕТ 20 тпМ Тпз-С! (рН 8.0) 5 шМ ЕРТА (рН 8.0) 400 гпМ ЫаС! !ччч (яч)ч) 505 Яеп1тхе тЬе зо1и6оп Ьу 61тгатюп тЬгои8Ь а 0,45-пап п(тгосе1!и1озе 61тег, Моте йе згеп1е зо! итюп ш 50- тп1 абииогз ат гооти тепгрегатиге. ТЕ (рН В.О) Епгугпе5 апд Войег5 Рго(етлаье К (20 тВ)т)) Р1еазе зее Аррепйх 4.
Сеп$г!йде5 апд Вогог5 5оваПН70006 алс( 5Н-3000 гогогь ог ес(и(ма)ел(ь прес!а! Еццзргпеп$ Ро1ургору1еле (иЬеь (77 х 700 тт) Кос)стлВ р1а(Еогт аг гоот !етрега(иге алс( 4'С Кос)с)ле р!аг(огт ог ьЬаЫлд (леиЬа(ог, ргеье! (о 55"С 5ЬерЬегерь сгоо)с (Еог а с)еьег!р(!ол, р)еаье ьее Мерь 5 — 7 оЕ Ргогосо( 3) СеВ5 апе! Т!55пе5 Си1!игес! СеПь Мопо1ауег си1гитез, 8гоячп то сопбиепсе ог зеппсопбиепсе !п !00-ппп т((яЬез, зЬои16 Ье тчазЬес1 очке чай |се-со!6 рЬозрЬаге-Ьи((его) за1тпе апс1 гЬеп ипитейасе1у!учет( Ьу аайпоп оЕ 1 гп! оЕ 5ЫЕТ соптатшп8 400 И8(ш! рготе)лазе К, аз с(езспЪет1 (и 5тер 1. Се(1з 8гочтш8 ш зизрепяоп зЬои16 Ье тесочегес1 Ъу септп(и8ат!оп, ячазЬес( ич!се гп гсе-соЫ рЬозрЬасеЪи((егес( за!(пе, апс( йеп гезырепс1еа ш ТЕ (рН 8.0) ат а сопсепгга6оп оЕ 5 х 100ш1, А1й)иогз оЕ йе зизрепяоп (0.2 пг1) аге тЬеп тгапз(естес( со а яепез оЕ ! 7 х 100-пип ра!соп ро!ургору!епе шЬез апт( йе себя аге )пипейате1у 1узес( ччиЬ 5)4ЕТ солта(шп8 400 И8)ш! рготешазе К, аз т)езсг(Ьеа ш 5гер 1.
Моиье (аПь ог тоиье Бььие 5атпр!ез о( пюизе га(1з аге 8епега11у сит !тоти !О-т)ау о16 зпсИтп8 апина!з ог ат гЬе типе оЕ ячеап!п8 (-5 ъчее(ь о( а8е). !и тЬе Еоппег сазе, йе йзга! опе тЬ|гт( оЕ гЬе тат! Ь тетоочед апт! ьапзЕеггед шсо а питта(и8е.! п йе 1аттет сазе, 6-10 иип о( йе га6 а гетпочет( ипс(ег апезйеяа апт( !тапа(естес( то а 17 х 100-тппг ра1соп ро!ургору1епе тиЬе, Рпт)ег гаге с(гсшпзгапсез, ячЬеге оЪта(птп8 а гези1т тарЫ1у Ь оЕ рагапюипт ппрогсапсе, йе епгтге саа сап Ье гегпоче6 !топя печчЪогп апипаЬ апт( !гааз(естес( го а иного(и8е гиЬе. То гзо1аге РХА Егоит птоизе Вшие (отЬег тЬап та6 зп(рреь), тгапзЕсн -100 гп8 о( йе ЕгезИу йьессет1 т1ззпе то а 17 х 100-пнп ра1соп ро!ургору!епе гиЬе. Мосье тат!з ог ойет Вмиез сап Ъе зтогес( Еог а Ееяч ъчее)сз аг — 70'С (п г(8Ьт!у с!очес( шЬез ЪеЕоге адйп8 5ХЕТ апс) ргогетпазе К.
Ноъчечег, и Ь Ьессег то ргосеет) сайоит с(е!ау то й8езт тЬе зашр!ез яч(тЬ рготешазе К (5герз 1 апт) 2). ТЬе сошр!есет! й8езь сап тЬеп Ье зтогес( !пбегтп!те!у ат — 20"С ЬеЕоге рЬепоЬсйоготопп ехтгасиоп. А!! ехрегипепь саге!еа оит оп 1аЬогасогу инее, (пс! ийп8 гетпойп8 зес6опз оЕ таа, гео шее рпог аийопта6оп (гоги гЬе арргорпаге шзпги6опа1 етЫсз соиипггсее. МЕТНО0 1.
Ргерате (Ье арргорпа(е атпоипт оЕ 1уяь ЬиЕЕет (ьее ТаЫе 6-1) Ьу асЫ(п6 рго1е(пахе К то а Впа1 сопсеп(галоп оЕ 400 )т61гп! Еп 5ХЕТ. АсЫ 1уь(ь ЬнЕЕег Со (Ье пгоиье Са(1я ог оГЬет 1(ььиеь. ТЬЬ ртосеаиге а!зо сап Ье изей то ьо!аге Р(4А 6ош тпопо!ауегз о( си!тшес1 шапппа1)ап се11з. !п тЫз сазе, 1 ш! оЕ 5НЕТ солта(и(п8 400 И8)ш! рготетпазе К Н атЫет) спгест1у то 100-пнп тпопо1ау- Ргососо! 5: Ргерагассоп о7 белит|с Е7ХАугот Моизе Та|)з апг( Обжег 5таП 5атр)ез 6.25 ТАВЕЕ 6-1 5)ч)ЕТ Еугбз ВВЕЕег Ч01ишез сгосиме ОГ 5)з(ЕТ СУ515 ВОГГЕВ (и|!) АСЕ ОГ МОи5Е АМОиасг ОГ Т155иЕ ТУРЕ ОГ ТиВЕ еп6ге саП (! сги) ГПзса! оие-й|г6 Ые|чЪоги 10 дауа о!д СЧеаиПп8 (5 — 4 зчее)сз) Апу а8е 6-! 0-ини 100 ш8 оЕ Еге|Ь сЬзие егз йас Ьаче Ьееи пизе6 с|енсе ш РЬозрЬасе-Ъи((егеб заПие, ТЬе чпсоиз сеП з!иггу Ь зсгаре6 Во|и йе ГП|Ь зч!СЬ а гиЬЬег ро!кегиаи, аид сгаиз(егге6 со а 17 х 100-пни ро!ургору1епе Ра!сои сиЬе. СеПз Вгочбп8 !и зизреияоп йас Ьаче Ьееп |чазЬе6 счлсе |п РЬозрЬасе-ЬиВеге6 за!ше аге гезиз- реибе6 |и ТЕ аи6 1узе6 |чЬЬ 5ХЕТ соиса1шп8 400 И8 оЕ ргосешазе К (1 ш! Рег 10| сеПз).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
