Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 144
Текст из файла (страница 144)
Еог ЕитсЬег !пГоппадоп, р1еазе зее Аррепйх 8. Моте ассшасе п|еаяшеп|епс оЕ РХА сопсепсгадопз сап Ъе |паде Ьу боота|песту |п |Ье ргеяепсе оЕ Яиогезсепс |1уез ъчЫсЬ Ь~ид РХА ъчи|Ьоис !исетса!адп8 алд ъчиЬ зрес|6сбу со доиЫе-ягапдед РХА. ТЬе пюзс ъч!де!у изед дуе Гот сЬ|я ритрозе !з НоесЬзс 33258, а ЬВЬепгип|даго!е (Сот Еитйет деса|Ь, р1еаяе яее Аррепйх 8).
Еог а п|ейод оЕ Оиото|песпс |пеаютешепс оГ РХА сопсепсгадопз, р1еазе зее сЬе раис! оп А00ШОМАЕ РКОТОСОЫ Е5Т!МАТ!МС ТНЕ СОМСЕМТКАТЕОМ ОЕ РМА ВУ ЕШОКОМЕТКУ |и Ртососо! 1. 5. Аиа1уге сЬе |1иа1иу оЕ йе ргерагадои оЕ Ь(ВЬ-то1еси1аг-ъче(8Ьс РМА Ьу ри1яе|1-6е1д це! е1ессгорЬогеяя (СЬарсег 5, Ргососо! 17 ог 18) ог Ъу е!ессгорЬогеяя сЬгоиВЬ а соичепдоиа1 О.боуи а8агозе Ве! (СЬар(ег 5, Рго(осо1 1). ()яе ииК-!еи8й аи|1 !теаг солса(етегз оГ ). РМА ая тат)сетя (р!еаяе яее СЬарсег 5, ргососо! 16). ТЬе 8еиоиис РМА яЬои1д Ье июге сЬаи 200 1|Ь |п яге. Ро пос Ье сопсетпед |Г ютле оЕ сЬе РХА тетпашз ш йе ъче!1, япсе РХА тпо1еси1ез >250 )сЪ Ьаче ййк|йу (и епселп8 сЬе Пе!.
ТЫз ртоЫетп сап июа11у Ье зо1чед Ьу етпЬедйп8 сЬе РХА |п а зиса!1 апюипс оЕ п|е1|ед а8агозе (ас 55'С) апд сгапзЕеглп8 сЬе пю1сеп ю1исюп со йе ъче!1 оЕ а ртеГоиие|1 а8атозе Пе1. ТЬ|я сгапзЕег зЬои!д Ъе доле Ье(оте |Ье Пе! !з юЬше|8ед ш е1ессторЬотеяя Ьи((ег. СОМСЕМТКАТ!МС 5ОШТ1ОМ5 СОМТА1М!МС Н!ОН-МОЕЕСЕЛАК-'ъАГЕЕСНТ 0МА |Е йе солселстаиол о( РХА |л йе ртератасюл ь соо )ош со Ье ъчот)изЫе, изе а ияде-Ьотед р|реие от сш-ой уеПоъч др со сталя(ет сЬе РХА !лсо а зсалдатд сеПи)ояе асесасе д!а(уя!я Ьа8 (е,8., 5ресста Рот, л хъч. сш-ой 6000-8000 !ътъътР 5с!елс!Яс)) (Еот ртератасюл о( йа!уяя сиЫл8, р!еаяе яее Аррелйх 8).
Р!асе |Ье |Па!уяз Ьа8 ол а Ьед о( юПд я|стахе (Втаде П, 5!8|па). Рас!| адд!с!ола! юстозе ол сор оЕ сЬе Ьа8. ТЬ(я рас)с!л8 ь Ьеяс доле ас 4С, ол а р!есе о( айти!лип| ЕоП зртеад ол сЬе ЬелсЬ (л а со!д тоот. АПоъч |Па1- уяя Со ртосеет! илСП СЬе чо!илзе о( йе Пйд и| йе д!а!уя)я Ьа8 Ьаз Ьеел тедисед Ьу а Гас|от о( 5-) О. К!ляе йе опта|де от' |Ье Ьа8 и4|Ь те со тетлоче аП о( йе адЬетелс аистихе. Сеиду шаяяа8е сЬе ю)исюл оЕ РХА со оле елд оЕ сЬе Ьа8 алд сЬел с!атлр сЬе сиЬсл8 )изс аЬоче сЬе !ече! о( |Ье Пи!д ъчсЬ а д!а!уз!з с 8р.
0)а!уге сЬе затл р1е а8а| ля| 4 Псетз о( ТЕ (рН 80) Еот 16-24 Ьоита ъч)СЬ аС )еаяс пчо сЬал8ея о( Ьибет. ТЬВ тлейод ъчот)сз люте е6!с!елг!у йал солсел|таСюл !л Сел|леал с!сМсея от |л соПо|Пол Ьа8з алс! теяи165 !л ятлаПет )озяез оЕ РХА. Ьо!акоп о1 0МА 1гот Матгпа!~ап СеЬ Ьу кроо!~пц Н)8 МгтНОгт, лолртег) гаОм Во)лтегг (туву), ь г)ьеО тО раерлаЕ РМЛ з)шп1гапеоиз1у Егош гпапу д(ЕЕегепг ьашр!ез оЕсе!1ь ог т!запек ТЬе )сеу згерз 1и йе ргососо1 аге (1) ргес)рпа6оп оЕгЬе 8епоппс РХА ас (Ье 1пгегЕасе Ъегсеееп (Ье се11 1узаге апс1 а!ауег оЕ егЬапо1, Ео11осеед Ъу (2) зроо!- )п8 оЕ (Ье ргесгрдагед РЫА опто а 8ЬерЬегд'з сгоо)с ТЬе РХА (з йеп!1Е(ед Егош гЬе егЬапо1к зо1пгюп оп (Ье сгоо1с апд йзао!уес1 ш (Ье ас)пеоиз Ъпйег оЕ сЬоке.
ТЬ)з ше(Ьод оЕ со11ес6п8 ргес)рдагея оЕ Ь18Ь-шо1еси!аг-оге(8Ьг Р)с)А счаз 6гьг пзед (и (Ье 1930а (р!еаье аее (Ье ш(огша!юп рапе1 оп 8РОО(1(с)С 0)с)Л аг гЬе епд оЕ (Ь)з сЬаргег). %па!1 Ега8шепга оЕ РХА апд КХА аге пот ердс)епг1у шсогрогагед (пго йе 8е1а6попя ароо1, АЕ(Ьоп8Ь (Ье Р!х(А 6 8епега1!у гоо япа!1 (-80 1сЪ) Еог ейк(епг сопзггпсгюп оЕ8епош!с РХА 11Ъгаг)еь, и 81чеь ехсе11епг гезп!гз !п 8оп(Ьегп ЬуЬпйаа6опь апд ро1ушегаае сЬа)п геасбопа апд сап Ье паед го сопзггисг а яке-(гас!!опагед !(Ъгагу а(гег 1пшгес1 й8еьг!оп се1(Ь а геагпсгюп епауше. Си1гпгед апепр1огд шапипа1(ап се11з (2.0 х 10', е.8., Не1.а се1!з) у(е!д 100 )гц оЕ Р)с(А 1и а чо1шпе оЕ -1 ш1.
МАТЕК1АЫ СА()т(О)с): Р!еаье атее Аррепд!х т 2 Еог арргорпа1е Ьаий)п8 о( гпагена1ь шаг)сед сх)ЕЬ <1>. ВиЕЕег8 ап(Е Бо!гг(1опь Р)еаье аее Аррепйх т Еог сотропеига оЕ а!ос)с ьо!и6опь, Ъи((его, аид геа8еп1ь. 01!иге а!ос)с ьо!ибопа Го ЕЬе арргорпаге соисеп1га6опь. Се(! !уа!в со!идоп б гег 8озп)дпп!шп Ьус1госЬ)осаде <1> О 1 м зос))ссго зеегзсе (РН 56) Ейало! (гоот гетрега(иге) те (рн В. О) СЕ!8 Ри!аед-Е(е!д 8е! ог О.б;гз а8агоье деl 6.!6 Ргогосо! 3: 1го!адоп о)ГГ)1!А Ггот Митта!!ап Се!!г Ьу 5роо!т8 6.17 Ь!ос!е1с Асп15 апг! О11еопос!еоГге1е5 ЕГпеаг топотегх апд сопсасетегь оГ ЬассепорЬаце Х 0УнА Гр!еаье зее СЬарсег 5, Ргогосо! Хб) Ргераге К 1)гчгЛ аь ВеьспЬеб гп СЬаргег 2, Ргогосо1 Н ог !2.
ТЬе ЕГХА ы иье8 аа а а!ге вгапг!агг! Виг1п8 Ве1 е!есггирЬогеяя прес!а! ЕцогргпепГ К!тьирех Ро!ургору!епе ГиЬеи !50 гп!) Кос/сиц р!агуоггп 5ЬерЬегд'х сгоо)сх Гихед аз ап апегпадне го д)а!ук!х) 5ЬерЬег85 сгооЕг аге Раггеиг р!Реггеь ъчЬозе бр Ьаа Ьееп аеа1ег! ш гЬе Вапге оу а Випаеп Ьшпег апг$ гЬареч!!пго а Н ю!гЬ а Ьешоггаг. ЪНеаг аауегу 81аыег гчЬ!1е пш!ббпр гае 5ЬерЬегг!5 сгоо$сч.
И !де-Ьоге р!рег!ех ГО.З-спг д!атегег опГГсе) 'чу!8е-Ьоге р)реггеь аге ача!1аЫе Ггогп ьечега! гпапиуасшгегя Ночченег, чгапбап! р!Реггеч сап Ье иьес$12 гЬеу аге аигодачеа ш гЬе игоп8 опепгабоп и!гЬоиг соссоп-юоо! р!и8я АЕ1е116опа! КеацепЬ МасегГа!х алд ес)иУртеп! иьед !и 5гер 7 оГ Ргогосо! ! ТЬе ехасг гпагепа1в апг$ е4шргпепг гег!и!гег! чч!П г$ерепб оп гЬе гуре оу згагг!п8 шагепа1: Ыооб, си! гшег1 се!Ь, ог авшие !Р1еаье атее Ргисосо! !1.
Се!15 апг! Т155ое5 Мопо!ауегх ог ьиьрепх!опт оГ таттабап се!!я ГгехЬ дьые, ог Ыоод катр!еь МЕТНО0 1. Ргераге се11 юарепяопх (ог Ггохеп се11 рогчг!ега) аа с!еасг!Ъед ш Яер 1 оГ Ргогосо1 1. 2. 1уае гЬе се!!а Ьуопе оГгЬе Го1!огч!п8 ггчо те!Ьос!я РОК Еу5!5 ОГ СЕ!Е5 ГКОМ 5!)5РЕ!ч!5!О!ч!5 а. ТгапаГег йе се11 юарепяопа !о с!!ароааЫе 50-т1 ро1ургору1епе сепгггТи8е гиЬея Ь. АгЫ 7,5 но!шпеа оГ се1! !ух!а ю1иг!оп. ГО8 ЕУ5!5 ОГ СЕ!Е5 Г!1ОМ Т!55!)Е5 а. А<И гЬе Ггохеп се11 рогчг!ега 1!гг!е Ьу !аг!е го -7.5 но1игпеа оГ се11 1уа!а ао1иг!оп ш Ьеа1сегя А11огч гЬе рогчс!егх го аргеас1 онег гЬе аигГасе оГ гЬе 1уяа ао1иг!оп, апд гЬеп хЬа1се йе ЬеаЬега го ьиЬтег8е йе гпагепа!. Ь. ччЬеп а11 оГйе тагепа! !а Ьа ю!игюп, ггапаГег гЬе ао1иг!опа го сепгггТи8е гиЬея 3.
С!оае гЬе гиЬеа апд гпсиЬаге гЬегп Гог 1 Ьоиг аг гоот гетрегагиге оп а госЫпц р1агГопп. Се!1ь ог бяие роих)егг !псиЬагег! МгЬ 1уяа ьо! иг!ип аг г!езсг!Ьег! ш 5герг ! — 3 аЬоче сап Ье ггогеб Гог ъечега1 гпопйз аг ч'С Ьеуоге ехггасип8 гЬе Вепипис !ггчА. 4. Г)1арепае 18 гп! оГ ейапо1 аг гоот сетрегашге !пго еасЬ оГ а пег!еа оГ с!!хроааЫе 50-т1 ро1ургору1епе сепгпуп8е гиЬея Е)ае нчЫе-Ьоге р!Репех го 1ауег гЬе се11 ыарепяопх сагеГи1- 1у ипдег гЬе егЬапо1. 6.18 СЬарсег 6| Ргерага6оп апг(Апа!уя| оу'Еи)гагуоссс Сепотсс Р!мА Кесочег сЬе Р!мА Егош еасЬ сиЪе Ьу 81ои4у епгпп8 сЬе Епсегуасе Ьес|чееп сЬе се11 1уеасе апд сЬе есЬапо! счссЬ а 8ЬерЬегсГе сгоо1с.
ТЬе РЬЕА сч01 а6Ьеге со сЬе сгоо1с, Еопшп8 а Ве1а6поне шаяп Сопснше 86гпп8 нп61 сЬе есЬапо1 апд сЬе асрлеоне рЬаее аге сЬогоиВЫу пшсег). Тгапьуег еасЬ 5ЬерЬегсГе сгоо1|, и пЬ 118 ассаеЬе|1 Р)м)А, со а еерагасе ро1ургору1епе сиЬе сопсанип8 5 ш1 оЕ ейапо1 ас гоош сегпрегасше. 1.еаче йе РЬЕА енЬ|пег8е6 Еп сЬе есЬапо1 ип61 а11 оЕ йе еашр1еь Ьаче Ъееп ргосееьей Кепюче еасЬ сгоо1с, мчссЬ 118 ассасЬед РХА, ап|1 а!1осч ае пшсЬ ейапо1 ае ровяЫе со дгаш амчау. Ву сЬ18 еса8е, сЬе РХА 8Ьои16 Ьаче 8ЬгипЬ 1псо а 68611у рас1сед, беЬуг!гасе6 шаяп Ес |8 йеп роеяЫе со ге|номе пюес оЕ йе Егее есЬапо1 Ьу сар01агу асбоп Ьу соисЫп8 йе ()- йаре|1 еп|1 оЕ сЬе сгооК со а есас)с оЕ Кнпмчсрея Веуоге а11 оЕ сЬе есЬапо1 Ьае ечарогасе|1 1тош сЬе РХА, сгапьуег йе сгооЬ 1псо а ЕгееЬ ро!ургору1епе сиЬе сопсаспсп8 5 ш! оЕ есЬапо1 ас гоосп Сеп|регаюге. '|1|Ьеп а11 оЕ йе еашр1ее Ьаче Ъееп ргосеееес1, а8асп гешоче ае пшсЬ есЬапо1 ае рояВЫе (еее 5сер 7).
Ро по| а1!о|м йе РС4А ре1!есе со й у со|пр!есе1у ог сЬеу ми11 Ье мету ййки1| |о йяо1че. Тгапауег еасЬ рсрессе со а ЕгееЬ ро1ургору1епе сиЬе сои!а)п)п8 1 гп1 оЕ ТЕ (рН 8.0). А)1осч йе РХА8 Со геЬубгасе Ьу есопп8 сЬе сиЬее очегп18Ьс ас 4'С. Боте РС4Ае гпау ге|риге 24 — 48 Ьоил Со геЬу|1га|е согпр1е|е!у. Рипп8 геЬу|1гасюп, йе РХАе Ъесо|пе Ь|8Ыу Ве1абпоне Ъис гешасп апасЬе|1 со йеЬ рсренея Рее ЕгееЬ 5ЬерЬег6'и сгоо)се ае есгареге со Егее сЬе ре11есе оЕ РХА Вепс1у Его|и йеЬ р|рессея Рсесагб сЬе рсреяея 1еасбп8 сЬе Р!м)А ре!1есе Е)оассп8 ш сЬе ТЕ.
С1оее йе сиЬее ап|1 шснЬасе йе|п ас 4"С оп а госрбп8 р!асЕопп ип61 сЬе ре!1есе аге со|пр1есе1у 6188о1че|1 (-24-48 Ьонге). ТЬе 1ече! оЕ соп|апипапоп Ьу КС4А ь 1|ерс гмссЬсп ассерсаЫе !нпср |Е 1.5 п|1 ог пюге оЕ 1уяыю1и6оп ы ые4 рег !ог се18. Но|мечег, йе ап|оипс оЕ КС4А сопсапипаип8 |Ье РЬСА ьатр!е сап Ье Еиг|Ьег ге|Сисе|С Ьу а|С|11и8 К!мазе (Нпа! сопсеп|гапоп оЕ 1 и8|и|1) со |Ье ю1тюп РсмА. ТЬе 014А ргерзге|С Егот Ьото8епсге|С сЬгпее Ьу сЬ1ь тесЬог! оНеп Ьае а Еа|пс Ьго|мпВЬ-ге4 со!ог (ргеьшпаЫу |Сне со сопсапипасюп |мссЬ япа!1 агпоипсз о! Ьеп|о81оЬ|п). ТЬсь соп|апипасюп гСоее пос |пЫЬ|с е88е|6оп и4|Ь геяпссюп епауп|ея Апа1уке ап а!щиог Ъу рн!ее6-усе!а Ве! е1есггорЬогеяе (СЬарСег 5, РгоСосо1 17 ог 18) ог Ьу е1ессгорЬогеяе сЬгои8Ь а О.б% а8агоее Ве! (СЬарсег 5, Ргососо1 1). 5соге сЬе РХА ас 4 С.
ТЬе РЬСА еЬои1|С Ье -80 С|Ъ |п яге ап|С ьЬои1|С пи8гасе тоге |1оиг!у йап топотегь оЕ ЬассегюрЬа8е Х РС4А. Весаые РМА та|Се Ьу |Ьь ргосе|Сиге сь а1|мауь спасаю!пасе|С гмссЬ а япа11 атоипс оЕ КС4А, и Ь песеыагу со ее!стасе |Ье сопсепсгапоп оЕ РХА т |Ье Нпа! ргерагапоп еНЬег Ьу Яиоготесгу (р1еаее ьее СЬе рапе1 оп АРР!Т1ОЫАС РКОТОСОЫ Е5Т1МАТ!ЫС| ТНЕ СОМСЕЫТКАТ!О~4 ОЕ РЫА Вг' ЕШОКОМЕТКг' си рго|осо1 1) ог Ъу Ве! е1ессгорЬогеесь ап|С еса1исп8 иисЬ е|Ьг8!шп Ьгот|8е (СЬарсег 5, Рго|осо! 2).
6.20 СЬаргег б: Ргерагаг1оп апгЕАпа1уяЕя оЕ'Еи)гагуогЕс бепогп)с Е1ХА прес!а! Ег!гя!ргпеп1 Аяр1гаг1оп г)еч1се соппесгегЕ го а часиигп Ете Е111егЕ еЫй !гара Ми)11сЬаппе1 р1реггог, 8 ог 12 сЬаппе1я Ка1п!п ЕРР-Р1пя Мя !тога Ра1п1п!пс. ТЬеяе г1еч1сея аЫ ЕЬе аг165гюп оЕ пш111Р1е геааепгя го 1по1чЫпа! гче11я оЕ ппсгогпег р!алея. 1Е РСК мпП Ье ыес! го ясгееп ЕЬе се!1 сп1гпгея, ые р!пааег1 РЕреие Вря. ТЬе Ьагге!я оЕ пш!гкЬаппе1 ргрепея яЬоп!г1 Ъе ЕпапегаЫед апгЕ с1еапег! ЬеЕоге ые.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
