Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 142
Текст из файла (страница 142)
СоПесс Ыоод се1Ь Егогп ЕгеьЬ1у дгаъчи ог Егогеп ьатпр!еь. Ншпап Ыоод )пыь1 Ъе соПес)ед Ьу а 1гашед рЫеЬо)опиь1 ипдег ь)еП1е сопд111опь. ТО СО! ПЕСТ СЕ! Е5 ГРОМ ГКЕ5НОГ ОКАИ'Ы ВЕООО а. СоПес1 -20 гп1 оЕ ЕгеьЬ Ыоос1 !и 1иЬеь сои!а!и)пВ 3.5 ш1 оЕ е!йег асгд спга1е дехсгоье 8010Поп В (АС13) ог Е!3ТА (р1еаье ьее по)е 1о ЕЕЗТА !и йе гпа1еда!ь П)п). ТЬе Ыоод шау Ье ьгогед Еог ьечега) дауь аг 0'С ог )пг)еПп)ге)у аг-70'С Ье1оге 1Ье ОЫА Ь ргерагед. В)оод ьЬон)д пог Ье со))есгед шго Ьерапп, ъчЫсЬ Ь ап )п!пЬпог о( 1Ье ро)угпегаье сЬагп геаспоп (Вен11ег ег а!. )990). Ь. ТгапьЕег йе Ыоод )о а сеп)г!ЕиВе 10Ье апд сеп1г)ЕиВе а1 1300д (2500 грш ш а 5огчаП Н!ОООВ гогог апг1 50-ш! ьъч!пВ)пВ Ьпс1сеп) Еог 15 пипи)еь а) 4"С.
Ргососо1 1: Ега1абои аЕНЕ5Б-то1еса1аг-сче15Ь1 Е7ИАЕгот МаттаБап СеПх Еуг)п5 Ргосетазе К апгЕ РЬепоЕ б.9 с. алешине йе сшрегпасапс ПиЫ Ъу аар!гаПоп, 1Ле а Раасеиг р)репе со сгапаЕег сЬе ЬиЕЕу соас сагериПу со а Егей сиЬе апс! гереас йе сепсгЕЕиВассоп.
Ессасагс) йе реПе1 оЕ гег! сеПя ТЬе Ьиссу спас Ь а Ъгоад ЬапгС оЕ хЫсе ЫоогС се!!а оЕ Ьесегодепеоы гСепясу. й ретине геядиа) сшрегпасапс Егот йе ЪиЕЕу соас Ьу аарсгасюп. Кеаиарепс) йе Ъисуу соас !п 15 т1 оЕ!уяа ЪиЕЕег. 1псиЬасе 1Ье гю1исюп Сог 1 Ьош а1 37'С, апгс ргосеег! со 5сер 2. ТО СО11ЕСТ СЕ115 РВОМ ГРОХЕЬ! ВЕООО 5АМРЬЕ5 а. СоПесс -20 т! оЕ Егер Ыоогс сп сиЪев сопсашшц 3.5 т1 оЕ есйег асЫ с!сгасе ссехсгоае гю!исюп В ЕАСЕ)) ог ЕЕ)ТА (р!еаье атее по1е со ЕРТА !п йе гпасеПа!а Пас). ТЬе Ыио4 гпау Ье асогег! Еог ъечега! дауа ас 0'С ог !пбейп!се!у ас — 70'С ЪеЕоге йе ЕсС4А ь ргерагей Ь.
ТЬасч 1Ье Ыоос) гп а счасег ЬасЬ ас гоогп сетрегасше апс! йеп сгапьЕег П 1о а сепсг)Еице сиЬе. АсЫ ап ег!иа! чо1шпе оЕ рЬоьрЬасе-Ьийегесс ааПпе ас гоогп 1егпрегасше. с. СепсНйце сЬе Ыоог! ас 35005 (5400 грт 1п а 5огчаП 55-34 госог) Еог 15 пбпшеа ас гоот сетрегасиге. 11. Веточе йе кирегпасапс, счЫсЬ сои!а!па!уьесс гес! сеПя Ъу акр)галоп. Пеьиарепг! сЬе ре1- 1ес ш 15 т! оЕ 1уяь ЪиЕЕег.
1псиЬасе йе гю106оп Еог 1 Ьоиг а1 37"С, апс) йеп ргосеес! со 51ер 2. МесБогЕ Сопгтиеь сч11Ь 51ер 2 Ве!осч Тгеа$спепС оЕ 1.убасе члЕЕс Ргосе!па5е К апс! Р!сепо! 2. Тгапарег 1Ье !ужасе со опе ог псоге сепсгсЕице сиЬеа 1Ьас Егс !псо а 5огчаП 55-34 госог, ог ег!шча!епс. ТЬе сиЬеа кЬои!б пос Ье тоге йап опе-1Ыгг! ЕиП. 3. АсЫ ргогешаае К Е20 туут!) Со а Ппа! сопсеп1гаПоп оЕ 100 СсП)т!. сне а ц1ааа гос) 1о пих сЬе епкугпе ао!исюп цепс!у !псо йе ч)аспид !ужасе оЕ сеПя 4. 1псиЬасе 1Ье !ужасе !п а ъчасег Ьай сог 3 Ьоига ас 50 С.
5ъчсг! йе чсьсоиа ао1исюп Егот сппе 1о Сипе. 5. Соо1 йе гю106оп со гоопс сетрегасиге апс) асЫ ап ес!иа! чо1шпе оЕ рЬепо1 ег)ш11Ьгасес) ълсЬ 0.1 М ТНМС! (рН 8.0). Сепг!у пих йе ссчо РЬааеь Ъу к!оси!у сигптВ йе сиЪе епд-онег-епд Еог 10 тшисеа оп а шЬе ппхег ог гоПег аррагасия 1Е 1Ье ссчо РЬаьеь Ьаче пос Еогтес! ап ети1ьюп аС СЬ)з агаПе, р!асе йе СиЬе оп а гоПег аррагагиа Еог 1 Ьоиг. В!!и апб 51аЕЕопС ! ! 970) гесопппеп4 йе ые оЕ 05 ХС ЕЕ!ТА ЕрН 8 О) гп 1Ье 1уяа Ьийег. Натчечег, йе лепя!у оЕ йе Ьийег а!гпиас еииа!ь йас оЕ рЬепис, юЬгсЬ юаЬеь зерагассип оЕ сЬе рЬаьез гПЕЕи си!с.
ТЬе !уяв Ьиссег шед Ьеге сопса!па ЬС7ТА ас а сопсепсгасюп оЕ О.! я, юЫсЬ ретбь еаяег аерага1юп оЕ сЬе рЬепо!пс ап4 ациеииа рЬааеа юЫ!е юа!пса!пюц а Ь!аЬ деагее оЕ ргосеспоп ада!из! гСеагайассоп оЕ сЬе РНА Ьу пис!еаяеь апд Ьеачу гпеса!я 6. 5ерагасе йе ссчо рЬазеа Ьу сепсПЙВабоп ас 50005 Еб500 гргп сп а 5огнаП 55-34 госог) Еог 15 тшигек а1 гоот 1етрегагиге.
6.10 СЬарсег 6: Ргерага6оп апг) Апа)уггк о)'Еи(кагуосгг бепогпкс РХА 7. Рае а счЫе-Ьоге р)реие (0.3-ст «!Еагпесег оп8ае) со !капа(ег йе ч)асина ак!пеона рЬаае со а ЕгеаЬ сепсг)Еи8е сиЪе. СчЬев сгавасегг!п5 йе ак)неона (нррег) рЬаье, кс !ь еяепиа! со г(гаке сЬе РВА шсо йе ркрепе чегу к!окч!у со ачо!гс йкснгЬгпц сЬе шасепа! ас сЬе кпсегЕаее апг) со пнпотвге Ьук)гок)уваппе кЬеак!вВ Еогеея ЕЕ йе РЫА кю1шюп В ю Нкеоы йас в сапное еая1у Ье к)гакчв шсо а кчЫе-Ьоге ркрепе, нае а !овВ ркрессе ассаеЬесс со ап акр!касок со гешоче йе огВав!с (!окчег) рЬаае аа Ео!!окчя г.
ВеЕоге ксаг6п5, пка!ге анке йас йе чаеишп сгарк аге епгрсу апк! аеенге, зо сЬас рЬепо! сапвог епгег йе часишп аугсеш. й. сч!ЕЬ йе часншв 1ше с1оаей ь!окч!у !окчек йе ркрессе со сЬе Ьоссогп оЕ сЬе огцапй рЬаае. Ъсга!с нп01 с!ке чЬеонк сЬгеак) оЕ аг)неона гвасепа! ВесаеЬеа Егогв йе ркрессе, апг! ЕЬеп саге!и)!у ореп сЬе чаеинпк 1!пе апк) Кепс!у чбсЬг)гаке а11 оЕ сЬе ог5апге рЬаье. С!оке сЬе часншп 1кве авд он!е)к)у кч!сЬк)каке сЬе рсрессе сЬгонВЬ сЬе ак)неона рЬаае. )гпшейасе1у ореп сЬе чаеншп 1гпе со с гана(ег сЬе геяк1на! рЬепо1 кпсо сЬе агар. ш. Севке!Енхе сЬе РХА ао1ииоп ас 5000е(6500 кргп ш а 5окча1! 55-34 кокос) Еог 20 пивнсеа ас гоош сешрегаснке. Ргосеш авк) е!оса оЕ РХА чл11 аекВпсепс со йе Ьопосп оЕ сЬе сиЬе.
ТгаваЕег йе РЫА ао!ииов (сЬе якрегпасапс) косо а 50-ш! севке!Енхе шЪе, !еаяп5 ЬеЬкпк! СЬе ргокеш авк) с!оп оЕ РХА. 8. Вереас сЬе ехсгас8оп ичсЬ рЬепо1 ссч)се пюге апк! роо1 сЬе ак)пеона рЬааея 9. !ао1асе Р)ч)А Ъу опе оЕ сЬе Е01!осч)иц ссчо тесЬок!я ТО 15ОИТЕ РЬСА !ЬС ТНЕ 5!ХЕ ВАЬССЕ ОЕ 150 — 200 кВ а.
Тгапьуег сЬе роо1ек) ак)пеона рЬааеа со а йа!уяа Ьа8. С!оке йе сор о( йе Ъаи ипсЬ а йа1- уяа СиЫп8 с!(р, а1!осч)и8 гоокп )и СЬе Ьа8 Еог йе аатр1е чо!шие Со (псгеаае !5 — 2-(016 к(игсп8 Йа!уяя Ь. Р(а!ухе йе 401и8оп ас 4'С ада)пас 4 18ега пук!)а!уяа ЪиЕЕег. СЬап8е сЬе ЬиЕЕег йгее с(теа ас 1псегча1а оЕ >6 Ьоигя Вегасе оЕ йе ЬкВЬ чысогЬу оЕ сЬе РМА ьо!нс!ов, еВа1уяк Вевега!!у са)кеа >24 Ьош ь со согпр1есе. ТО!5ОИТЕ РЬСА ТНАТ НА5 АЫ АСКЕВАСЕ 5)ХЕ ОЕ 100-150 КВ а.
АЕсег сЬе й(гк1 ехсгассюп ипсЬ рЬепо1, сгапауег йе роо1ек1 ак)пеона рЬааеа со а ЕгеаЬ сепсг)Еи8е сиЪе аик1 акЫ 0.2 чо1шие оЕ 10 М аппиопппи асесасе. АкЫ 2 чо1шпеа оЕ ейапо1 ас гоопс сегпрегасиге апк1 асч)г! йе спЬе ипс(1 сЬе ьо1и8оп 14 сЬогоикЫу ппхек1. Ь. ТЬе РМА (ттейасе!у Еогта а ргес(рЬасе. Реточе йе ргес(р(сисе Еи опе р(есе Егокп сЬе есЬапо1к сю!исюп сч)сЬ а 5ЬерЬегкГа сгоо1с (а Раасеиг р(реие счЬоае епк1 Ьаа Ьееп аеа!ег! апк! аЬарек! спсо а (); р!еаае аее 5сера 5 — 7 оЕ Ргогосо! 3).
Соисат(пас(п8 0118опис1еосЫеа геша!п т сЬе есЬапо!ге рЬаае. 0. 1Е йе Р)ч)А ргес(рЬасе Ьесотеа Егаитепсек), аЬаиг!оп сЬе 5ЬерЬегк)'а сгоо)с апк) со11есс йе ргессрЬаге Ьу сев!к(Еи8аг(оп аг 50005 (6500 гргп )и а 5огча11 55-34) Сог 5 т(иигеа аг гоокп Сетрегагпге. й ЪСгааЬ йе РХА ргес(р)Саге Ссч(се сч(СЬ 70окЬ ейапо1, апк( со1!есС йе РХА Ъу сепгг(Ьсцас(оп аа к(еасг(Ьек! Еи 5сер с. е. йеточе аа пшсЬ оЕ йе 70око ейапо! аа роаяЫе, ияп8 ап акр(касок. 5соге йе ре11ес оЕ РМА ш ап ореп сиЪе ас гоогп сетрегасиге ип81 йе 1аас чкяЫе сгасеа оЕ есЬапо1 Ьаче ечарогагед.
Ро пос а!!осч сЬе ре1!ес оЕ Р)4А со к)гу еогпр!есе!у; к)еяееасек) Р!)А Ь чеку к)!Ебен!с со йяо!че. Ргососо! 1: Его!а!сои о~ЕЕ!ЕЕ-то!еси1аг-сче(8Ьс РИА !сот Матти((ап Се!Еч (Гхсле ршсетасе К апгГ РЬепо! 6.11 Г. АсЫ 1 пс1 оЕ ТЕ (РН 8.0) Еог еасЬ О. 1 сп1 оЕ се!!х (5сер 1). Р1асе сЬе шЪе оп а гос)ип8 р1асЕопп апс! Кепс!у гос1с СЬе сю!06оп Сог 12 — 24 Ьоигх ас 4'С ип61 сЬе РХА Ьаа сошр1есе1у с!!8801чес!. 5соге сЬе РХА хо1шюп ас 4'С.
10. Меааиге ГЬе сопсепсгабоп оЕ сЬе Е)ХА. !с В ойеп сВйки!с со гпеааиге сЬе сопсепсгаиоп оГ ЫВЬ-пю!еси!аг-ъче!8Ьс РХА Ьу яапссагс) шесЬос)а ацсЬ аа аЬаогЬапсе ас 260 ппч. ТЬ!а !а Ьесаиае сЬе РХА ьо!ииоп ь Егес)иессс!у попЬошо8епеоы апс) В иаиа!1у ао чВсош сЬас и В ипроаяЫе со к!сЬигаъч а гергеаепса6че аашр!е Еог апа!уяа. ТЬеае ргоЫеша сап Ъе пбшгпыес) Ъу ччссЬс)гак!и8 а 1аг8е аапср!е (10-20 01) ччсЬ ап аисогпаск р!репег ес)шррей тч!ГЬ а сис-ой: уе!1оъч Вр, ТЬе аапср1е ы сЬеп с6)исес) сч!ЕЬ -0.5 гп! оГ ТЕ (рН 8.0) апс) чогсехес) М8огоы!у Сог 1-2 ппписеа.
ТЬе аЪаогЬапсе оЕ сЬе й!асей аапчр!е сап сЬеп Ъе геад ас 260, 270, апд 280 пис сп сЬе асапс)агд ъчау. А ао1ииоп ъчЬЬ ап А оЕ ! сопса!па -50 08 оГРХАйп1. Хосе сЬас еас!шасеа оЕ рпгиу оГ пис1ек асссЬ Ьааес) оп ОР;ОР, гапоа аге ипге!саЫе (О1аае! 1995) апсс ГЬас еаигпасеа оЕ сопсепсгасюп аге спассигасе !Е сЬе ьаспр1е сопсаша я8псбсапс ашоипса оЕ рЬепо1. Н О аасигасей мчсЬ рЬепо! аЬюгЬа кЬЬ а сЬагассепа6с реаЕ а! 270 пгп апсс ап ОР:ОР гаио оЕ2 (5!и!и!8 апс) АшЬег8ег 1994). Хис!ек асг8 ргерага6опа Егее оГ рЬепо! аЬои1с) Ьаче ОР:ОР гасюа аГ -1.2. Еог ЕпгсЬег !п(оппаиоп, р1еаае аее Аррепйх 8. Моге ассшасе шеаапгешепс оЕ РХА сопсепсгабопа сап Ье шас)е Ьу Виогоисесгу ш сЬе ргеаепсе оГ Нпогеасепс с)уса гисЬ аа 5уВК Оо!с) апй НоесЬас 33258, пЬ!сЬ Ыпд РХА чч!ГЬоис шсегса!абп8 апс) ьчсЬ арессбс1су со с)оиЫе-а!гипс)ес) РХА (Еог ЕигсЬег с)еса!)а, р1еаае аее Арреийх 8). Рог а шесЬод оЕ йиогогпеспс исеаг пгешепс оЕ РХА сопсепсгасюпа ияп8 НоесЬас 33258, р1еаае аее сбе раис) оп АРР!Т!ОХАС РКОТОСОН Е5Т!МАТ!ХО ТНЕ СОХСЕХТКАТЮХ ОЕ РХА ВУ ЕПЗОКОМЕТКУ оп сЬе Го!!оичп8 ра8е.
11. Апа!ухе сЬе с!иа1иу оГ сЬе ргерагабоп оГ Ь!8Ь-шо!еси!аг-сче!8Ьс РХА Ьу ри!хес(-йе!Й Ве! е1ессгорЬогеях (СЬарсег 5, Ргососо1 17 ог 18) ог Ъу е1ессгорЬогеях сЬгои8Ь а сопчепс!опа! О.боуи а8агоае Ве! (СЬарСег 5, РгоСосо1 1). с)хе ип(С-!еп8СЬ апс!Еог !шеаг сопсасешега оЕ Л РХА ах шаг)сега. А шесЬос! со Вепегасе !шеаг сопсасешегх оГ Л Е)ХА !х с!ехсг!Ьес! ш СЬарсег 5, Ргососо1 16.
13о пос Ъе сопсегпес1 !Е аогпе оГ сЬе РХА геша!па !и сЬе сче!1, япсе РХА гпо!есп1еа >250 1сЬ Ьаче с)!6)си!су епсепп8 сЬе 8е1. ТЫа ргоЫеш сап пыа!1у Ъе со!чей Ъу егпЬедсбп8 сЬе РХА ш а агпаП агпоипс оГ гпе!сес) а8агоае (ас 55'С) апс) сгапаЕеггш8 ГЬе гпо1сеп ао!ыюп со сЬе ~че!1 оГ а рге- ГогшесС а8агоае 8е1. ТЬе сгапасег гЬоиЫ Ье йопе Ье(оге сЬе 8е! Ь еиЬгпег8ес) !и е!ессгарЬогеа!а ЬиЕЕег. 6.72 О|аргег бг Ргерагабол алд Ала1уж о!'Еи/сигуа!|с беггогл(с РХА АОО!Т!ОМАЕ РКОТОСОЕ: ЕВТ(МАТ!МС ТНЕ СОМСЕМТКАТ|ОМ ОЕ ОМА ВЪ' ЕЕЕ)ОКОМЕТКУ А(еалиппц Яъе сопсеп(габоп о1 0МА ияпЯ Яиоготе|гу ь гпоге яепйиь е Яъап ересиор)ю(оиъеиу а||вчпЯ (Ье де|есИоп о1 папоЯгагп с|иап66|ее о( 0МА |и ЕЬЬ алеау, 0МА ргерага6003 Ы1лочп апд ип(гпочл сопсепиабопа аге |псиЬа(ед илдь Яъе йюгосЬгогпе НоесЫ 33258.
АЬеогрбоп ча(иеь 1ог Яъе ии(ихнчи еатр!е аге сотрагед члдь Яхье оЬееиед Ьг а Еиххчи еепее, алс1 Яъе сопсеп(га6оп о1 Яъе ип)точи еагпр(е 'ь ее($та(ед Ьу |п|егро|а|юп. Адд!1!опа! Ма1ег!а!5 ХаО (4 м) 5од(ит рЬоерЬа(е (05 М, рН 2.4) Яиоготеиу Ьиууег 2 м МаС| 50 пъм лед(нв рлилрла1е Ргераге 500 пъ! аид лгег($(хе Иъе ло(нг(оп Ьу йггаиои ЕЬгонЯЬ а 0.45ънпь й|ег. НоесЬ31 33258 дуе (0.2 тфт! и Н О) ТЬе сопсепггагед ло)нбоп о1 г$уе сап Ье лвгед а| ггюгп гепърега|нге |п а Ео)$-втарргн|гелг |нЬе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
