Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 126
Текст из файла (страница 126)
1)ье а йагр ьса1ре! ог гахог Ыа6е ео сие оие а ь!!се оЕ а8агоье сои!а!п!68 йе Ъапс! оЕ !иеегеьг ап6 ЕгапьЕег И Со а с1еап, с!ЕьроьаЫе р!аь6с ЕиЪе. Сш |Ье яиаПевт в!|се оЕ а8агове ровяЫе |о пишш|ае йе аиюиис оЕ соитаиииа6ои оЕ РХА |чиЬ нй|ЬЬотв. АЕЕег спп|п8 оШ йе Ъаий РЬоГо8гарЬ йе 8е1 аь с)еьст!Ъет! ш Ргоьосо1 2 Со гесогт! |чЬ|сЬ Ъап|1 оЕ Е)ХА |чав гешочей Адг! -5 чо1шпеь оЕ ЕМТ е!п6оп Ьпууег Ео ЕЬе ь1гсе оЕ а8агоье, с1оье ЕЬе гор оЕ йе ЕпЬе, апс! ше!Е йе 8е! Ьу !псиЪаг!оп Еог 5 пипигеь аг 65"С.
Соо1 йе ьо1игюп го гоош гегпрегагпге, апс) ЕЬеп ас!6 ап ес!па! чо1шпе оЕ ет!и!1!Ьгагес) РЬепо!. ЪЪгсех ЕЬе пихшге Еог 20 ьесопдь, ап6 ЕЬеп тесочет йе аг!иеоиь РЬаье Ьу сепЕт!Е68аг!оп аг 40008 (5800 грги !и а 5огча11 55-34 гогот) !ог 10 пппШеь аг 20"С. ТЬе |чЬПе виЬяаисе а| |Ье !итетуасе Ь ахагове. Ехггасг йе ас!иеопь РЬаье опсе |ч!ЕЬ РЬепоЬсЫогоЕопи аиг! опсе вч!ЕЬ сЫогоуопи. Тгапьуег ЕЬе аг!пеопь РЬаье Ео а ЕгеьЬ сепЕПЕЕ8е ЕпЪе. Ас!6 0.2 чо!шие оЕ 10 М агпгпоп!шп асегаге апт! 2 чо!шиеь оЕ аЬьо!иге етЬаио1 аг 4 С.
5!иге ЕЬе ппхшге Еог 10 пппиьеь аг гоош Ееп|регауиге, апс! йеп гесочег ЕЬе Е)ХА Ьу сепгпЕп8а6ои, Еог еха|ир!е, аг 50008 (6500 гр|и !и а 5огча!1 55-34 гогот) Еог 20 тшигеь аг 4"С. 10. ЪЧаьЬ ЕЬе РХА ре1!ег чч!ЕЬ 70% егЬапо1 апс1 6|ььо!че !и аи арргорПаге чо!шие оЕ ТЕ (РН 8.0). РХА риийе|! Его|и!ои-ше!Пих-|етиретаи|ге ахатове Пе1в ы яитаЫе Еог иве |и |иов| еиху|иа6с теас6оив оЕ тио1еси1ат с1оиш8. ОссавюиаПу, июге ПешаигПи8 ехрегииеия восЬ ав ттаивуес6оив, ш)ес6оив, от ши1т1Ета8шеит Пьа6оив тес!и!ге Ь~ПЫу рог1Е|е6 РХА.
Гта8и|еитв гесочетед !гоги 1овч-ше1тш8-гешрегатите а8агове саи Ье риийе6 Ъу сЬгошатоьгарЬу ои яиаП РЕАЬт-берЬасе! со!шоов !р1еаве вее Рго|осо! 5) от аиу оЕ а вч!Пе табе|у оЕ вресЕаЬу геяив |Ьа| аге ача11аЫе сои|- и|етс|аПу ав ртерас)се6 со!шиив Ер!саве вес СЬаргет Е, Ртососо! 9). Ма1|е яи е йат ЕЬе геяи сЬовеи ы арргорпа|е Еот рипЕуш8 1шеат РХА ию!еси!ев ав оррове6 то с|гси1ат р1авш16в. Ртотосо! 6| Яесочету о)|)3ХАЕ| опт Еовч-тпе!ЕЕп8-тетретатите А8атове ОеЬт От8апЕс Ехттастюп 5.31 Кесо~егу о1 ОНА 1гогп 1.ою-гпе!1~пц-1етрегаШге Ацагоье Се!ь: Еплугпа6с 0феь6оп члй Ацагаье А н нчхчмлт!с мгтноо млч ве ивео то кисочек 19!ч)А Егот Ве18 сахг чч!|Ь )очч-те)6п8-гетрегагиге а8агоае (Витте!хгег ап|1 ЬеЬгасЬ 1989).
1п |Ь|8 гесЬп!с)ие, |Ье Ега8|пеп! сои!а)п)п8 |Ье Е9!хЕА !а ехс!аес) !гогп |Ье Ве1 апд |!!Веагед |чЬЬ ЕЬе епхугпе а8агаае, |чЬ|сЬ Ьус)го)укеа |Ье а8агохе ро!утег |о йьассЬагЫе зиЪийпс ТЬе ге)еахес) 19)ч)А ыЬеп риг!6ес) Ьу рЬепо1 ехсгасгюп апс) е|Ьапо1 ргес|рпа6оп. Весаиае !Ь|я тегЬос) !8 ех|гегпе1у Вепбе, Ь !а раг6си1аг1у овей|1 Еог |Ье гесочегу оЕ Ь!ВЬ-гпо1еси1аг-чче!8Ь! Ет)чЕА8 ех|гас|е|1 Егогп ри1хед-6е16 а8агоае Ве)а (Рготосо!х 19 ап|1 20). Нотчечег, Ь а!80 хчог)сх |че11 Еоггесочегу оЕ япа11ег Е9)ч)А 6 а8| поп!а !тот а8агоае це18 гип Еп сопа!апс е1ес|пса1 6е1йс МАТЕИАЕй СА!2Т!ОЫ: Р1еаае аее Аррепйх 12 !ог арргорпа|е Ьапд1!08 оЕ гпа|ег!а!а |пагЬег) чч!!Ь <!>.
Войегв апг! $о!66опв Р1еаье атее Аррепйх 2 Еог сопзропеп!ь оЕ ь|осЬ ко!01!опт, ЬиЕЕега, апс! геадеппп О!!и|е а!осЬ 80106опа |о |Ье арргорпа|е сопсеп!гапопа. Е|Ьапо! ЕЕЬЕЕЕЕит ЬготЕг)е <! > ог 5УВ|с Со)|Е ьгаЕОЕпц хо!и!!оп <1> Рог а й|сыяоп оЕ ага!и!пв авагоье Ве!я, р!сакс асс Рго|осо! 2. Се! ес)и!!!В|а!!оп ЬиЕЕег |О шМ Вь ТгеаС! !РН 6.5) 5 |пМ НЭТА !РН 8.0) О.! М ХаС! ВЬ Тп|-С1, а сошропеп| оЕ Ве1 ецш1!Ьгаг!оп ЬпЕЕсг, !х В!|12-Ьу|Е|охуе|Ьу!)!ш!погг!ьЕЬу|Егохуше|Ьу!) гпе|Ьапе Ьус!госЫогЫе. !| Ь опе оЕ а !агве ясг!ех оЕ хъппепошс ЪпЕЕегы|ечс!прес! ш |Ьс ш!В ! 960| Ъу Хоппап Соо|Е апсЕ Ь|и со!!еавиех |и ге|роище |о |Ьс пес|! Еог сошропп|Е| |ч!|Ь ьггопв ЪпЕЕсг!пв сарас|- |у а| Ь!о!ов!са!!у гс!счап| РНх Ебоо|Е е| а1.
|966; Гегвпюп ес а1. |980), ТЬе РК, оЕ ВЬ Тп|-С1 ь 6.5 а| 25 С, ап|! || В еЕЕеспче ах а Ьппег Ьсичссп РН 5.8 ап|Е 7.2 Ер!саяе |ее Аррепйх !). ХаС! 15 М! РЬепоЕ, ес)иЕ!ЕЬгагес) го рН 8.0 <! > УЕ ЕрН 8.0! 5.33 5.34 СЬаргег 5: бе! Е)есггорЬогези оу с )ъ)А алд Ри1зед-Еге!д Аеагозе Се! Е!есггорЬогез!з Епкуепеь апе! Вийегь Ааагазе Ааагазе ь аъаааЫе Ьо|п а пшпЬег оЕ п|аппЕас|пгегз (е.а., РЕ1азе Его|и Еркеп|ег ТесЬпо1оа)ез, 11- Азагазе 1 Его|и ))еъе Епз)апй Вю1аЪ|, апй В-Азагазе 1 Его|и Са!Ъ|осЬеп|). )ъ(ис(е!с АсиЬ апе! О(коппс(ео1!е!ея Е)А|А заглр)е прес!а! Ег!и!ргпеп1 Иа)уз!з гиЬ!ла, Ьодес! Гог |Ье ргерага6оп оЕ сиа!уяз гпЬ)па Еог ые ей|Ь Р)ъ)А, р1еазе зее Аррепйх 8 ог пзе а со|и|пего|а! ргерага|юп оЕ |по!есп1аг Ью!оВу агайе й)а!уз)з шЬ)пц (е.а., Ые ТесЬпо1оВ)ез).
М!сгоо5а)у|дз зузгет (1)Ее ТесЬпо)об!ез) Ор6опа1, р!еазе зее 5|ар 6. Иггаъео!ег )агпр, Ьалд-ЬеЫ, )опц-махаче)епдгЬ (302 пт) <! > Яагег Ьайз ргезеГ Го 40ос алд 65ос Ае!Й1!опа! Кеаееп15 5)ер 7 оЕ ЕЬ!з ргогосо! геди!гез |Ье геадепгз !Ез)ед т Ргогосо! б оЕ !Ь!з сЬаргег. МЕТНО0 1. РоПоъе 51ерз 1 ЕЬгопВЬ 4 оЕ Ргогосо1 6 го ргераге а де! сазе ъч(й !ой-те11ша-гетрегагпге ааагозе, го !оай 1Ье Е))ъ)А затр1е, апй |о рег(опп е1есггорЬогез(з.
2. Ехс(зе а зецтепг оЕ Ве! сопгаш(па 1Ье 1))ъ)А оЕ шгегезг апй шспЬаге йе де! зПсе !ог 30 ппппгез а| гоот гетрегашге )и 20 чо1шпез оЕ ае! е|!шПЬгагюп Ъпйег. 3. АЕгег сп16пц опг йе Ьапй, РЬогоцгарЬ ЕЬе Ве! аз йезспЪей (и Рго|осо1 2 со гесогй ъеЬ~сЬ Ьапй оЕ Т))ъ)А ъеаз геточей. 4. ТгапзЕег йе зеВтепг оЕ ае! Ео а ЕгезЬ шЬе сои!а)п(па а мо!пте оЕ ае1 еъ!ш1(Ьгаг(оп Ъпйег арргохппа|е(у ег!па! Ео йас оЕ 1Ье Ее1 з(ке. 5. Ме11 йе Ве( з1ке Ьу шспЪагюп Еог 10 ппппгез аг 65'С.
Соо1 |Ье зо1пгюп 1о 40'С апй а|Ы Ревазе-Егее аВагазе, пайпс 1 — 2 ппиз оЕ адагазе рег 200-)ъ! Ве! зПсе. 1пспЬасе ЕЬе загпр1е Еог 1 Ьопг а1 40'С. Рпг)пц |Ь|з шпе, |Ье ааагозе ы й)Вез!ей |о о))ао- апй й)зассЬаг)йез. 1Е йейгей, |Ье Р)СА зо1п6оп а|ау Ье изей й)гесг)у а| |Ь)з паде Еог 1)цагюп, гез|пс6оп епгуп|е й)цез6оп, апй |гапзуогп|абоп. А)гегпа6ее1у, |Ье Р)ъ)А |пау Ье рппбей Епг|Ьег апй сопсеп|га|ей аз йезспЬей |п 5|ер 6. 6. Рпп(у апй сопсепггаге йе Р)ъ)А: То РРВ!Гг' 5мАИ. Рь)А ГВАсме)ъ)т5 (<20 кВ) а.
Ехггасг йе 1)ХА зо!пгюи Еъчке ъе(1Ь е|)ш!1Ьгагей РЬепо(. Ь. АЕгег йе зесопй ехггасгюп, ггапз(ег йе аср|еопз РЬазе 1о а ЕгезЬ гпЬе ап|1 а|Ы 2 чо1шпез о(ТЕ (РН 8.0). ТЬ~з з|ер Ье!рз |о ргееепг ргес|рпа|юп оЕ о!|ВозассЬагЫез. с. А|Ы 0.05 уо!пте оЕ 5 ЬЕ )ъ)аС1 ЕоПоъчей Ьу 2 чо!птез оЕ ейапо!. (Неге, 1 чо1шпе (з ес)иа! |о 1Ье чо1шпе оЕ !Э)ь)А аг ЕЬе епй о(51ер 6Ь.) 1пспЪаге ЕЬе |пЬе Еог 15 ппппгез аг 0"С апс1 |Ьеп соПес| |Ье ргес(р(гасе Ьу сепгг(6|аагюп аг тахпппт зреей Еог 15 ппппгез а!4"С |п а т(сгоуиВе.
Ргогосо! 7: Кесочегу оу гг)(А ггот Хогч-те1(!п8-гетрегапггеАггагоге бе1гс Епгутаг!с Р!8ег(1оп гчгг)г А8агаге 5.35 й Сагегп)1у гегпоче (Ье егЬапо! апс) аЫ 0.5 гп! ог'709о е(Ьапо1 аг гоогп гегпрегагпге. Чоггех (Ье ппхшге апс) йеп сепгг!(п8е ая г)еясг!Ьей ш 8(ер с. е. Кепюче (Ье апрегпагапс апд агоге (Ье ореп гпЬе оп (Ье ЬепсЬ гог а гечч ппппгеа ас гоош гегпрегагпге го а!1очч йе егЬапо! (о ечарогаге. О!аао1че (Ье РЬ)А !п ап арргорпаге чо1- шпе ог ТЕ (рН 8.0).
ТО Р()к!Гч иксе Рь)А екАсме)чт5 () 20 ВВ) а. Тгапагег йе а8агаье-ЖВеагес) яашр1е го а йа1уяа Ьа8, аеа1, апг) р1асе йе Ьа8 ш а Ьеа)сег ог ()аа)с сои!а!пшц 100 ш1 ог ТЕ (рН 8.0). Ь. Р!а1уке (Ье зашр1е Гог аечега1 Ьопга аг 4'С. АЬегпа6че!у, йа!ухе гЬе ао!пЬ|!(хег) Ве! а8а(пег ТЕ (рН 8.0) !п а дгор-йа!уыил аррагагпе (е.8., М!сгойа!уыил 5уегетп, 1)(е ТесЬпо!о8!ея). То ргечепг еЬеаг(п8, !аг8ег РНА (га8гпепге еЬоп!д пог Ье апЬ)ессеи го рЬепо1 ехггаспоп, чоггех!п8, ог егЬапо1 ргес!рпаггоп (р!еаье еее гЬе )п(оппаКоп рапе! оп М!Ы!М!Х!ЫС РАМАСЕ ТО !АКСЕ РЬ)А МОЕЕС() ЕЕ5 (п СЬаргег 2).
ТЬе !пс!ппоп о( 30 рм ьрегпппе ап4 70 рм зреггпЫ!пе !п гЬе 4)а)уе!к Ьп((ег сап епЬапсе гесочегу ог !агВе Р!чА ггарпепге (>!5 ЕЬ). Рго1осо! 8 АНса!~пе Ацагоье Се! Е!ес1гор'погеяь д гклине лслкоье сйгь лкй кон лт н!сн кН, ъчн!сн слоьйй йлсн тнчм!о!нй апг! Виапше геяг1ие го !оье а ргогоп, апд гЬиь ргечепгь йе Гогшаг!оп оу Ьуг)гойеп ЬопгЬ ъчЬЬ гЬе!г аг)епше апг! сугояпе раггпегь. ТЬе г)епагигед Еъ)ь)А Ы ша)пга!пег) )п а япй!е-ьггапъ)еъ1 ьгаге апг1 пщгагеь гЬгоиВЬ ап аПга1ше айагоье йе! аь а йпсЬоп оГ гЫ яае. Ойег депагигапгь ьисЬ аь |огшаш!г!е апг) игеа ъ)о пог и от)ъ ъчеП Ьесаиье йеу саиье гЬе айагоье го Ьесогпе гиЬЬегу. 5!псе йегг шчепгюп !МсРопеП ег а1.
1977), айгаНпе айагоье Ве!ь Ьаче Ьееп иьеъ) сййейу го ° шеаьиге гЬе ь!ге оу Нгь! апг! ьесопг! ьггапдь оГ ст)!ъ)А ьупгЬеяаеъ) Ьу гечегье ггапьспргаье йСЬарГег 11, РгоГосо1 !) ° апа)ухе гЬе ь!ге оГ гЬе О)ъ)А ягапс1 айег ъ)!Веьгюп оГ Т))ъ)А-К)ъ)А ЬуЪПгЬ ъч)гЬ пис1еаье 51 (Рача!ого ег а1. !980) ТЬе иье оГ а!)саПпе айагоье Ве! е!ессгорЬогеяь геасЬег) Ьь шахипшп ш йе еаг1у 1980ь ъчЬеп геайепгь апг! епаушеь ъчеге!еьь ге!гаЫе йап гог)ау апг) с1опегь ъчеге оГ песеьягу гпоге ч)кг1апг аЬоиг оиаПгу сопгго1. Аг йаг типе, аНгаПпе айагоье е1есггорЬогеяь ъчаь иьег) гоиПпе!у со ° сЬес)с Гог п!с)с!пй асг!ч)гу !п епаугпе ргерагагюпь иьеъ) Тог пю1еси1аг с!огйпй ° са!!Ьгаге йе геайепгь иьег) ш п!с)г ггапь1аНоп ой Р)ъ)А. Моъчаг)ауь, оп1у йе шоя сошри1яче !пчеьПйагогь ъчои!д иье аПсаНпе акагоье е1есггорЬогеяь го пюпггог йе г)иа1Ьу оу епаушеь.
)ъ)ечеггЬе1еьь, гЬе гесЬпийие гегпа)пь )шроггапг Ъесаиье оу Ьь ьреег! апг) ассигасу гп гпеаьиг!пй йе 1епйгЬ оГ Р)ъ)А ьггапъ)ь )п РХА-КХА ЬуЬг)ъ)ь апг) оК Пгьг- апг! ьесопйьггапг! сР)ъ)Аь. Н!5ТОК!САЕ ГООТМОТЕ Лйъайие айагоье е!есггорйогеь!ь ъчаь ъ)ече!орег) !и ВП! 5шгйег'ь !айогагогу аг Вгооййачеи гъаг!оиа! Гайогаъогу аь а гер!асегиеиг йъг !айогюиь айъайие йгагйеи! сеигп)ийайои о1 Ьасгегюрйайе Т7 ОХЛ. Тйе йгь! а!кайпе Ьог'аоига! Вен ъчеге ег)и!ррег! ъч!йъ айагоье ъч!сйь, Ьиг!аГег, 5гигйег г!ече!орег1 а Ве! Ьох ъчйй геиъочаЫе ь!оМоггиегь йас айоъчег! гйе Ве! го Ье роигег), ьоайег), ььа!иег), аиг) ч~юччег) !и ь!Ги.
ТЫь гуре о1 аррагагиь ъчаь яиър!е го соиягисг аиг! Ьесаиъе ехггеиъе!у роро!аг 1ог Ьой а!кайпе аиг) иеигга! е!есггорйогеьеь !и йъе уеагь, Ье!оге соиъгиепй!айу иъаии)асгигег) йе! Ьохеь Ьесагие ачайаЫе. Вгогиорйеио! Ыие В г)и!сх!у Ыеасйег! Ьу !исийайои а! Ыйй рН аиг1 'ь йеге1оге ииьаг!ь)асгогу аь а ггас!ъ!ий г)уе !и а!кайпе айагоье йеЬ. Тйе ьирегюг ъ)иаййеь о1 Ьгогиосгеьо! Вгееи ъчеге г)!ьсочегег) !и а ьуяегиайс ьсгееи о! аи аис!еиг сойесйои о1 г!уеь !аийи!ьЫий !и гйе Вюоййачеи !зЬогагогу сйеийса! ьгоге. 5.36 Ргососо! 8: А!Еса!спе АПагоье Се! ЕlессгорЬогеьо 5.37 МАТЕИАсо САС)ТЕОМ: Р!еаье ьее Аррепд)х 12 Еог арргорпасе Ьапд))пд оЕ спасена!ь спапПед илй <1>. Вссйесб апс$ ьо!ссПсопб Р1еаье ьее Аррепспх 1 Еог сотропепСь оЕ ьСос)с ьо1ипопь, ЬиЕЕегь, апд геаеепСь.
0$101е ьСос)с ьо!06опь Со СЬе арргорпа1е сопсепСгаНопь. Адагоье 10х А1Иа1$пе адагоье ееl е1ессгорЬогесдь ЬиПег 500 шм ХаОН <1> 10 спм ЕРТА Адд 50 шс ос ! 0 Х МаОН апд 20 ш! оЕ 0.5 М БРТА 1рН 8.0) Со 800 ш! оЕ Н,О апд СЬеп ад)иь| Ппа! чо1- шпе со 1 !Пег. Рй|се |Ье 10х а!Па!)пе а8агоье Пе! е1ессгорЬогеяь ЪиЕЕег чд|Ь Н О со Пепегасе а 1х |чог1|- |п8 ю1идоп ппп|егаасе1у ЪеЕоге иье ш спер 5 Ье!о|ч. Рье йе ьаспе с!ос)с ос 10х аП|а)ше аПагоье Пе! е1ессгорЬогеяь Ьиссег со ргераге сЬе а)Па!спе а8агосе Пе! апс1 йе 1х ъчог)дп8 со!одоп оЕ аПсаапе е1ессгорЬогеяь Ьиусег.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
