Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 124
Текст из файла (страница 124)
Ас!с) а ьесопс( а!!с)иот оЕ РЕАЕ Ь!аЬ- ьа1с е!исюп ЬиГГег со тЬе шетпЬгапе, апс1 тпсиЬате сЬе ыЬе Гог а ГигсЬег 15 пнписеь ас 65'С. СотпЬтпе сЬе с>чо а1!с)иось оГ РЕАЕ Ь!аЬ-ьа11 е!ис!оп ЬиГЕег. СЬес)с ипс)ег Р>г )Пшшпаиоп тЬас сЬе гпегпЪгапе по )опаег сопсашь а ч)ь!Ые япеаг оГ есЬ)с))ишЪгошЫе-ьса)пес! Р14А. Р)ьсагс) сЬе пьес) гпешЪгапе. Рго1осо! 4 Кесочегу ог РМА ггогп Абрагове апс1 Ро!уасгу!агпМе Се! ь: Е! ес1гоеЫюп ~про Р~а!уыил Вар т НГ5 ТЕСнН((1Ре ()Ч(сРоней ет АС 7022) А(ЮЧЧ5 тНЕ ВЕСОчеач 1п Ь(аЬ у(е!д оуг)оиЫе-аггапг(- ег( РМАа оГ а гчЫе галсе оу ягеа Ггогп 51кеа оу ааагоье апг( ро!уасгу1атЫе Ве)а. ТЬе гпейод 15 аогпегчЬаг гег(1оига гесупг(пВ (Ье гпьеггюп оу 1пг)(чЫиа! ае! 51!сея )пго йа1уяь Ъааа апг( 15 йегеГоге (лейк(епс гчЬеп гесочеппц !агае питЪега оГ Егаатеп!а. Ногчечег, е1есггое1иг(оп ччог)са гче11 апс) 15 йе гесЬп(г)ие оГ Вгаг геаогг аЬои14 г(1Е(гси!г!еа аггее гч((Ь о(Ьег те!Ьог(ь.
МАТЕК1АЕ5 СА(7Т!О(х): Р!еаае аее Аррепг)!х 72 1ог арргориа!е Ьапгй!пе о1 та!епа)а тагйег( гч1!Ь <! >. Вптгег5 апд йо!пбоп5 Р!еаае аее Аррепг)!х 1 1ог сотропеп!а о( а!осЬ ао!идола, Ъи((ега, апг) геааеп!а. 01!и!е а(ос1г ао!ипопа !о !Ье арргориа1е сопсеп1га!1опа. Е(Иапо! Е(Игспигп бготЫе <! > ог 5УВК Со(с( ьгагл(лВ ьо(идол <! > РИелоИсИ1огоуогт (7г7, чуч) <! > 5оепит асе(а(е (3 м, рН 5.2) 0.25х ТВЕ е(ес(горИогеяа Ьийег Рог а 1аа о(гес!Реп р!еаае аее ТаЫе 5-3 1п Ргогосо! 1.
О!Лег е!есггорЬогеж ЪиКега юсЬ аа ТАЕ (р!еаае аее ТаЫе 5-5) ог 0.5х ТВЕ сап Ье иаег( (ог е1ессгое!ог1ап о( РВА тгаупепгг Егош ааагоае апг) ро)уасгу!апггае де!а Ви((ега аге епеа ас гадесами аггепВгЬ (025-05х) го 1псгеаае йе гаге аг гчЫсЬ гЬе РЫА ш!ага!ее гЬгоиаЬ гЬе ае!. 0.25х ТВЕ е!есггорИогеж Ьиууег слога(п(пВ 0.5 РВ/т! е(ЛЫЬит Иготйе <! > Еп2угпе5 апг! Впттег5 Кеагпсг(ол епс(опис(еааеь Се!5 У(дагоае ог ро(уасгу(атЫе Ве! < ! > Ргераге а ае! сопгашша а сопсеппаВоп о( ацагоае (Ргогосо! 1) ог ассу!апгйе (Ргогосо1 9) арргорпаге (ог аерагаГ!пц йе (гаупепеа ш йе Р77А аашр1е.
5.23 5.24 СЬарсег 5| бе! ЕlегсгорЬогеьо о!' с))чА апг( Ри!ьег(-Еге(г! Аеагоье бе! Е!егггорЬогеяь Нос!е!с АснЬ апс! О!коппс!еобс!ев ОКА ьатр!е прес!а! Ес!о!рспеп1 РЕа!уыь сиЬЕпд, Ьо)!егЕ Рог йе ргерагасюв оЕ соа)уяь сцЫпВ Еог цье часЬ с|ХА, р!еаье ьее Аррепйх 8 ог цье а сопппегс|а! ргерага6оп оЕ п|о1еец1аг Ью)оВу Вга|)е |Ва)уяь сцЪ|иВ (е.а., ЫЕе ТееЬпо!оа)еь).
О)а!уяь сиЬ)пе сйрь Врессга Рог с!оьцгеь Егош 5реесгшп Мейса! спг)цьспеь. Ног!топ!а! е!еесгорЬогеыь сап)г Су)сгач)о!ес !агпр, Ьалг)-Ье!ЕЕ, !опВ-|чаче!епВЕЬ (302 лп|) <1> АИЖопа! КеацепЬ 5|ер 3 оЕ Й|ь ргосоео! гег(исгеь геаВепсь !Еьсег) т РгоСоео! 2 оЕ й|ь еЬарсег. 5|ер 70 оЕ й|ь ргогоео! тау гег(и(ге геаВепгь !!а|ее! |п Ргосоео! 5 оЕ й|ь сЬарСег. МЕТНОО 1. аеас ап апюцпс оЕ |Ье ьатр!е Т))х)А |Ьас чч(11 у!е!й ас 1еаьс 100 пВ оу сЬе ЕгаВтепс(ь) оЕ шсегеьс. 5ерагасе |Ье ЕгаВтепсь Ьу е1ессгорЬогеяь сЬгоцВЬ ап аВагоье ог ро1уасгу!атЫе Ве! оЕ йе арргорпасе сопсепсгас!оп, ьсаш ьч!сЬ 05 )се/т! е|Ь|ебти ЬгогпЫе ог 5'с'ВРх Со!|1, апсс !осасе |Ье Ьапс((ь) оЕ (псегеьс чч(сЬ а Ьап|1-Ье1й 1опВ-|чаче!епВй ()Ч 1аи|р. АВагоье Ве!ь шау Ье саьс чг)сЬ есЬ|гашп ЬгогпЫе ог гцп аис) ьцЪьеацепс!у ьсашес) еЬЬег |ч!ЕЬ есЬЫ|шп Ъго|пЫе ог тч)сЬ 5уВК СоЫ (р1еаье ьее Ргососо) 2).!! сЬе )22)А Ь ьерагасес) Ъу е)еесгорЬогеь!ь сЬ|оцВЬ асгу)ап|Ые, сЬе Ве! Ь ьцЬьес)цепс)у ьса)ие|С еиЬег ъчсЬ ейЫшш Ьго|иЫе ог МЕЬ 5УВК бо1В (р)еаье ьее Ргососо1| 9 аи|С |0).
Ехс)|ассов оссЬе есЬ1д)цш Ьгоп|Ые — РХА согпрсех шау саше РЬосоЫеасйпд оЕ йе с)уе ап|С япВ)е-ьсгагЫ Ьгеа)гь. С)ье оЕ а ьоцгсе |Ьас еицсь ас 302 пп| )пьсеаг) оЕ 254 игп |ч)!1 ш)шп|)хе Ъой еаесСь. 2. ()ье а ьЬагр ьса1ре! ог гахог Ыас(е Со сц| оц| а ь1ке оуаВагоье ог ро1уасгу!ат!с)е сопга!и(пВ |Ье Ьап|1 оЕ !псегеьс, ап|1 р1асе и оп а ы!цаге оЕ Рага66п ччессес) чч(сЬ 0.25х ТВЕ. Сцс йе япа11еьс ь1ке оЕ Ве! РоьяЫе со гес!цсе |Ье апюцпс оЕ сопсат!пасюп оЕ Е)ЬЕА чч(сЬ )пЬ(Ысогь, со ицтииге сЬе 06ьсапсе сЬе Е)ХА пеес! т!Вгасе со ех|с сЬе Ве1, апс) со епьцге ап еаьу 6с !псо |Ье |Ва!уяь сцЬ!пВ оп Ьапй 3.
Айег ехссыпВ йе Ьапй РЬосоВгарЬ сЬе Ве! аь деьспЪе6 |и Ргососо! 2 со еьсаЫ)ьЬ а гесогс( оЕ счЬ!сЬ Ъап|1 ччаь геточе|1. 4. аеас(пВ а1онеь, ьеа! опе епг) оЕ а р)есе оЕ гба1упь сцЬ)па шЬЬ а ьесцге )гпос. Р)11 |Ье с)са1уыь ЬаВ со очегйочч!иВ |ч|й 0.25х ТВЕ. Но!йпе сЬе пес)с оЕ |Ье ЬаВ апс) ь1!еЬ|!у ы)цеех(иВ |Ье сцЬ!пе со ореп !с, цье а сЬ|п ьрасц!а со сгапьуег йе Ве) ь1ке !псо |Ье Ьцу(ег-611ег1 ЪаВ. 5. АПо|ч |Ье ее) ь1ке со яп1| со сЬе Ьопот о( |Ье ЬаВ.
5|р|ееае оцс июьс о(|Ье Ъцу(ег, 1еач(пВ )цьс епоцВЬ со 1|еер |Ье Ве! ь1ке |и сопьсапс сопсасс ччЬЬ йе Ъцйег. Р!асе а 06а1уяь с1!р )цьс аЬоче сЬе Ве! ь!ке со ьеа! йе ЪаВ. АчоЫ сгарр(пе а|г ЪцЪЫеь апс( ебрр!иВ сЬе ее! ьбсе Ьье!Е (Е(ецге 5-5). ()ье а реппапепс Ее!с-с!Ррег) гпаг)сег со 1аЬе1 йе еаа1уяь с1(р чч!сЬ сЬе пате оЕ йе 1)ХА ЕгаВтепС. 6. 1иппегье йе ЬаВ ш а ьЬа11оъч 1ауег оЕ 0.25х ТВЕ !и а Ьопгопса1 е1ессгорЬогеяь сап1|. ()ье а 61аьь го|1 ог р)репе со ргечепс сЬе |Ва1уяь ЬаВ Его|и Воа6пВ ап|1 со гпа!пса(п йе ее! ЕгаВтепс !и ап опепсапоп йас !ь рага1!е1 со йе е1ессго|1еь. Раьь ап е!есспс сцггепс сЬгоцеЬ йе ЬаВ (7.5 Рготосо! 4т ЕЕесочегу оЕР)ъЕАЕтотп Агаготе апс) Ро!уасгу!атпи1е бе!я Е!есттое!ит!оп опто Рта!уяз ВаПт 5.25 Г!СРКЕ 5-5 Е!есттое!пт!оп оЕ Р!ъ!А Еготп ЕЬе Се! 50се ТЬ!а гпетЬот! оЕ гесочет!пП Р!9А Етотп Пе!а ъчаь ог!П!паПу т)еаст!Ьет! Ьу МсРоппеП ес а!. (1977).
Ч)сш) Еог 45-60 пппптея ЕЛе а Ьапс1-Ье1й 1опП-ъчаче1епПЕЬ БЧ 1атпр то тпоштог йе точетпепс оЕ тЬе Р)ъ)А ЕгаВшепт опт оЕ йе Пе! а1ке. !1 ЕЬе сПа!уыил ЪаВ соотатгПпц ЕЬе РЬЕА ЕтаВптепт ы ъоЬ)естет) то ап е!естпс Пе!т! Еот тоо ьЬотт а реп'- от) оЕ т!гое, пот аП оЕ йе РЬЕА члП пт!Втате оот оЕ тЬе Ве! ъПсе апт) ЕЬе у!е!т! мпП Ъе тес!псес!. 5ппт1ат)у, !Е тЬе е!ессторЬотеъть т!пте !ъ тоо !опт, ЕЬе РЕ4А Ьесоптет аттасЬетЕ со ЕЬе ъчаП оЕ ЕЬе т!!а1- уяь ЬаВ. ТургсаПу, 45-60 пипотеь ат 7.5 Ч/сто !и 0.25х ТВЕ ЬцКет Ь гоЕПстепт то е!есттое1оте -8550 оЕ а РЬЕА ЕтаВптепс оЕ О. ! — 2,0 !ъЬ Етопт ЕЬе Ве! ъПсе. ОЕЬет ЬнЕЕетя !атВет РГЕА ЕтаВптептя аптЕ Ве!ь соя!а!и!пВ Ь!ВЬ сопсепттатгопь оЕ ааатоъе тецгПте т!!ЕЕетепт е!естторЬотеь!ъ Птпея 7.
Кечегае йе ро1агПу оЕ тЬе спггепс Еог 20 аесопт)а го ге1еаае гЬе Р)ъ!А Еготп йе ъчаП оЕ тЬе ЬаП. Тпгп оЕЕ йе е!естпс спггепт апт) гесочег йе ЬаВ Еготп йе е1естгорЬогеа!а сЬатпЬег. Сепг!у шааааПе йе ЪаП то ппх йе е1шес1 РХА Епто тЬе Ъпйег. 8. АЕтег тЬе течете е1естгорЬогеяя гепюче йе сПа1уяа сПр, апс1 тгапаЕег гЬе ЬпЕЕег ялггоппс)- 105 ЕЬе Пе1 51ке со а р1аь6с тпЬе. Кетпоче йе Пе! 51ке 1готп тЬе ЪаП апт1 ага!и и аа с)екает)Ъес) !п Втер 9.
Е)ае а Раатепг р)ретте то ъчааЬ ош йе етпрЕу ЪаП ъчПЬ а япаП т)пап Пту оЕ О. 25х ТВЕ аЕтег йе !011!а! сгапаЕег, апс1 атЫ ЕЬе ъчааЬ то гЬе тпЪе. 9. Вташ тЬе Пе1 аПсе Ьу иптпегяпП П ш 0.25х ТВЕ сошаштпП етЬЫппп ЬготпЫе (0.5 )тПЕш1) Еог 30-45 пппшеа ат гоош тетпрегатпге. Ехаш!пе тЬе яа1пес1 а!ке Ьу ЕУЧ 1Пшпшатюп то сопЕттш йат аП оЕ йе Р)ъ)А Ьаа е! ыет1. 1О. Рпт!Еу йе Р!ъ)А епЬег Ьу рааааПе ЕЬгопВЬ РБАВ-ВерЬасе1 (р!еаае аее Ргососо! 5), Ьу сЬгошатоПгарЬу оп сопнпегста! геяпя ог Ьу ехтгасйоп ъчПЬ рЬепоЬсЫогоЕогтп апс) агапе)агс) ейапо! ргес)рПаПоп.
Рго1осо! 5 Риппса6оп о1 0МА Кесочегес! 1гогп Ацагоье апс! Ро!уасгу!агп!с!е Се!ь Ьу Апюп-ехсйапце СЬ гогпа1оцгарйу р ЫА гкасмемть Р()к)г)ю гком Асхко8е сегь, Вепегасег( Ьу |Ье ро1угпегаье сЬаю геас6оп (РСК) (СЬаргег 8), ог ечеп рго|1исе|1 Ьу г)18еагюп |ч((Ь геагпс6оп епхугпея аге ойеп геыагапг со Еигйег епхугпа6с |пап|ри1агюп. ТЬе геаьопь Еог |ЬЫ геыагапсе аге гпап)Ео)6 Ьи| аге Вепега1!у ааспЬе|1 |о йе ргеьепсе оЕ"!пЬ(Ь)гога." Рип6сагюп оЕ доиЫе-аггапг)ег) РХА Ьу !оп-ехсЬап8е сЬгогпагоВгарЬу оп роябче1у сЬаг8ег) геяпа сап Ье иаес) го г(6 а аагпр1е оЕ (Ьеае роог1у г(е6пег( |пЬ~Ъ|согя ТЬе пека)(че1у сЬаг8е6 РХА ь Ъоипд |о а гпа|пх, аисЬ аь РЕАЕ-ВерЬасе1 ог РЕАЕЯерЬабех |и Ьийег оЕ 1очч юпк хггеп8(Ь, йе сопгапипапь аге ччааЬед а|чау, апг( |Ье РХА Ы йеп е!иге|) Егогп |Ье |пагпх Ьу га)япВ |Ье юпк аггепВ(Ь оЕ йе ЪиЕЕег.
Р!оп(6 Р)ч)Аа апс) яп81еаггапс)ег) РЫАа хЬои!6 по| Ъе роббе|1 оп РЕАЕ геяпа а!псе йеу аге йрбси1с го е1иге опсе Ьоипд. АЕТЕКЕ!АТ!ЧЕ КЕВ!ЫБ РЫроваЫе со!и|ппа соп(а(п(п8 гечегьег(-рЬаае геа)па (е.8., Е!ибр-г! со!игппя 5сЫе)сЬег А 8сЬие!1; ЫАС8, Е)(е ТесЬпо!о8(еь), я!|са |па(г(с(еь ()А |аагг( РСК Ргера Кеяп, Рго| пека; 8(га(аС!еап Кеяп, Яга(акепе), ог 8!ааа роччг(ег (е.В., 5ерЬа8!аь, РЬаг| пас)а-сКВ; СЕЫЕСЕЕАЫ, С)'В(ОВепе) аге ача()аЫе (гогп аечега! ьирркегь (Еог гпоге |п(оггпа|юп, р!еаае атее СЬар|ег 1, Рго|осо! 9). ТЬеае геь(па Ьаче г()((егепг е!и|юп рго|осоЬ (Ьа( сап ча|у дгап|абсаПу (гоп| йе п|ейод г(еасг(Ьсх) )и йе сиггеп| рго|осо!. Рог еха|пр(е, г)оиЫе-ьггапг(ег) РЫА 'ь Ьоипг( |о 8!аида роччг)ег аг Ь(ВЬ |оп)с аггеп8(Ь апг( е(иге|! |и !очч аа!(, ехас(!у |Ье орроя|е со апюп-ехсЬап8е сЬго| па(окгарЬу. И ь (Ьиа 'ипрог|ап| |о Ео)!огч йе (пяп|сбопа ргочк)ег) Ьу |Ье (пг)(н(6иа! |папи(асгигега о! |Ье г((((егепг со!игппы МАТЕК1А15 САЕ)Т!ОЫ: Р!еаае аее Аррепб!х |2 Еог арргорпаЕе Ьапг)!!пк оЕ гпа(епа!а гпаг)гег) и4(Ь <!>.
ВоЕЕегь апгЕ 5о! 6Е)опт Р)еаае аее Аррепг(!х ) Еог согпропепЫ оЕ а(ос)г ао1и6опя Ьи(Еегя апг! геадепЫ. О!!и(е а(ос(г ьо!и6опь (о (Ье арргориа(е сопсеп1га6опы Ейапоl (хоргорапо! 5.2б Ргогосоl еЬ Риг(Ясагюп о~Е)ХА Песочегег(угот Ацагохе алс( Ро)уасгу!ат(г)е беЬ 5.27 РЬело)|сЬ)огоуогт (7|7, ч)ч) <!> ТЕ (рН 7.6) ТЕ (рН 7.6) солса(лтд О. 7 м ХаО ТЕ (рН 7.6) сил|а(лтд 0.2 М ХаО ТЕ (рН 7.6) сил!а(лта 0.3 м ХаО ТЕ (рН 7.6) сол)а(л!ла 0.6 м ХаС) ТЬеае (онг Ън((ега ьЬонЬ) Ъе а|ел!|хеб Ъу ангос!ач!пц ог 61|га|юп ап|) |гоге|( а| гоош |ешрегашге.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
