Диссертация (1174342), страница 8

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 8)

Пробу перемешивают, охлаждают и центрифугируют. Вхимических пробирках смешивают 0,5 мл фосфатного буфера с 1,0 млнадосадочной жидкости. В опытную пробирку добавляют реактив Эллмана, а вконтрольную пробирку – метанол.Концентрация(С)восстановленногоглутатионавыражаетсямМ/лирассчитывается по формуле:опкгде Еоп – оптическая плотность опытной пробы; Ек – оптическая плотностьконтрольной пробы; 72,6 – фактор разведения; 13,1*103 – коэффициент молярнойэкстинкции реактива Эллмана.11.

Общая антиокислительная активность плазмы крови (квант/с·мл) –это кумулятивная антиокислительная активность витаминов, белков, эндогенныхбиоантиоксидантов.Исследуемый материал – плазма крови.Реактивы:фосфатный буфер; раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола вокисленной форме; раствор FeSO4.Принцип аналитического метода: метод базируется на фиксации скоростиокисления восстановленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИХ)кислородом.Ход измеренияВ термостатируемую пробирку добавляют фосфатный буфер, раствор 2,6ДХФИХ, растворFeSO4 и активно перемешивают. Далее добавляют исследуемуюплазму крови и в течение 5 минут с интервалом 30 секундфиксируют оптическуюплотность при 600 нм.

Скорость окисления 2,6-ДХФИХ измеряют с помощьюдобавления дистиллированной воды вместо исследуемой плазмы.12. Супероксиддисмутаза (ОЕ/мг гемоглобина).Исследуемый материал – эритроциты, отмытые от плазмы 0,9 %-м р-ромNaCL47Реактивы: 0,2 мМ р-р ЭДТА-Na; 0,05 Мр-р тетраметилендиамина(ТЭМЭДа); 0,034 мМ р-р рибофлавина; 0,2 мМ р-р паранитротетразолияхлористого; 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4; 0,1 М фосфатный буфер, рН 9,85;1 %-й р-р КI; 0,9 %-й р-р NaCL; смесь хлороформ – этанол.Принцип аналитического метода:Расчет активности СОД проводитсяпутем оценки скорости восстановления тетразолия нитросинего (НСТ) внеэнзиматической среде.Ход измеренияОтмытуюэритроцитарнуюмассугемолизируютхолоднойдистиллированной водой и переносят в центрифужные пробирки, добавляя 0,5 млсмеси хлороформ-этанола.

После центрифугирования половину полученногобиологического материала помещают в кипящую водяную баню, а вторуюполовину – в ледяную водяную баню. Далее готовят среды инкубации путемдобавления биологического материала к следующим реактивам: 0,1 М фосфатныйбуфер, рН 7,4; 0,1 М фосфатный буфер, рН 9,85; 0,05 М р-р ТЭМЭДа, 0,85 М р-рn-нитротетразолия, 0,034 мМ р-р рибофлавина.

Полученные пробы облучают,включая лампы дневного света в течение 5 минут. В пробирки вносят по 1 мл1 %-го раствора KI. Проводят измерение оптической плотности каждой пробы спомощью фотоэлектроколориметра.13. Глутатионпероксидаза (мкМ /л*мин).Исследуемый материал – сыворотка крови.Реактивы:0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4; р-р восстановленногоглутатиона; р-р перекиси водорода; 10 %-й р-р трихлоруксусной кислоты (ТХУ);0,3 М фосфатный буфер, рН 8,0; реактив Эллмана.Принцип аналитического метода:Активность ГПО рассчитывают поуменьшениювсредеинкубациивосстановленногоглутатиона,которыйокисляется за счет действия ГПО.Ход измеренияВ химической пробирке гемолизируют исследуемую сыворотку холоднойдистиллированной водой и приливают 1 мл р-ра глутатиона.

По 0,5 мл48полученной смеси вносят в центрифужные пробирки и инкубируют их на водянойбане. В опытную пробирку вносят 0,1 мл р-ра перекиси водорода с последующимвливанием как в опытную, так и в контрольную пробирки 2 мл 10 %-й ТХУ ицентрифугированием проб. К надосадочному раствору из обеих проб приливаютфосфатный буфер, рН 8,0, а затем реактив Эллмана.Измерение активности ГПО проводится в среде спектрофотометрированияпри λ = 412 нм.14. Глутатионредуктаза (мкМ /л*мин).Исследуемый материал – сыворотка крови.Реактивы:0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4; р-р окисленного глутатиона;5,35 мМ р-р НАДФН2; 10 %-й р-р трихлоруксусной кислоты (ТХУ); 0,3 Мфосфатный буфер, рН 8,0; реактив Эллмана.Принцип аналитического метода:Активность ГРУ рассчитывают по степениувеличения в среде инкубации восстановленного глутатиона, который переходитиз окисленной в восстановленную форму за счет действия фермента ГРУ.Ход измеренияВ химической пробирке гемолизируют исследуемую сыворотку холоднойдистиллированной водой и приливают 2 мл р-ра окисленного глутатиона.

По 1 млполученной смеси вносят в центрифужные пробирки и инкубируют их на водянойбане. В опытную пробирку вносят 0,1 мл р-ра НАДФН2с последующимвливанием, как в опытную, так и в контрольную пробирки 1 мл 10 %-й ТХУ ицентрифугированием проб. К надосадочному раствору из обеих проб приливаютфосфатный буфер, рН 8,0, а затем реактив Эллмана. Измерение активности ГРУпроводится в среде спектрофотометрирования при λ = 412 нм.В Таблице 2.1 отражены референтные значения исследованных намилабораторных маркеров окислительного стресса.Данное клинико-лабораторное исследование в необходимом объеме былопроведено 160 больным с геморрагическим и ишемическим инсультом. Эти жеисследования проводились и у 30 здоровых доноров контрольной группы.49Таблица 2.1Референтные значения лабораторных маркеров окислительного стресса50ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ3.1.

Результаты лабораторных исследованийв двух клинических группах пациентов с гемморагическими ишемическим инсультом в сравнении с донорами3.1.1. Статистическая обработка полученных данных исследованияПациентам обеих клинических групп и контрольной группы, в которуювошли доноры, был проведен необходимый объем лабораторных исследований,включающийизмерение14параметровипоказателейдляоценкиинтенсификации процессов СРО и активности эндогенной системы АОЗ,результаты которого представлены в таблицах 1-3 Приложения 3.Для оценки достоверности различия значений показателей в исследуемыхгруппах пациентов с ишемическим инсультом, геморрагическим инсультом идонорами, по каждому исследуемому параметру рассчитывались выборочныесредние и 95-процентные доверительные интервалы для генеральных среднихвеличин.Дляколичественныхпоказателейдостоверностьихразличияоценивалась на основе t-критерия Стьюдента, а для качественных признаковиспользовался критерий «хи-квадрат» (²), в том числе с поправкой Йейтса.Степень достоверности принималась при p<0,05.

Математические вычисленияпроизводились с использованием следующих выражений:~x  x  x  ~x  x ,x(3.1)t ,(3.2)s,n(3.3)xxгде x – генеральная средняя величина, x~ – выборочная средняя величина,  x –предельная ошибка выборочной средней величины,x– среднеквадратическаястандартная ошибка, t – коэффициент доверия (t-статистика Стьюдента, при51доверительной вероятности p=0,95, t=1,96), s – среднееквадратическое отклонениев выборке, n – объем выборки.По каждому анализируемому показателю проводилось сравнение значенийвыборочных средних для всех исследуемых групп.Критерий для проверки гипотезы о равенстве (неравенстве) выборочныхсредних базируется на статистике:tx x121 1sn m,(3.4)которая имеет распределение Стьюдента с n+m-2 степенями свободы.В таблицах 3.1 – 3.18 приведены результаты расчетов: 95-ти процентныедоверительные интервалы для выборочных средних, значения критерия t,выдвинутые гипотезы и их вероятности.3.1.2.

Сравнительная динамика параметров первичных, вторичных иконечных продуктов свободнорадикального окисления белков, липидов ипоказателей метаболитов оксида азота при геморрагическом и ишемическоминсульте относительно доноровРезультаты сопоставления параметров первичных продуктов СРО белков илипидов у пациентов с ГИ, ИИ (клинические группы) и доноров (контрольнаягруппа) представлены в таблицах 3.1 – 3.3.Кетодиеныидиеновыеконъюгаты–первичныеметаболитысвободнорадикального окисления липидов. Это нестойкие вещества, которыебыстро подвергаются распаду до малонового диальдегида.

Они обладают высокойбиологической активностью, инициируя и активируя СРО липидов по типуфеномена «снежной лавины». Первичными продуктами СРО белков выступаютСО-концевые остатки аминокислот. Они также являются нестойкими, быстроразрушаются с образованием битирозина и наделены высокой реакционнойактивностью, оказывая негативное деструктивное воздействие на биомолекулы.52Как видно из Таблиц 3.1 и 3.2, по всем перечисленным показателям имеютсядостоверные различия (при p<0,05) между пациентами с геморрагическим иишемическим инсультом и донорами. При этом следует отметить, что результатысравнения групп с ГИ и ИИ показали, что у пациентов с геморрагическиминсультом достоверно выше уровень диеновых конъюгатов (44,07±0,23 против40,07±0,16отн.ед.опт.пл./мл*100)иСО-концевыхостатковаминокислот(0,43±0,01 против 0,40±0,01 отн. ед.опт.пл/мл) и ниже уровень кетодиенов(16,42±2,70 против 21,25±0,60 отн.ед.опт.пл./мл*100) (Таблица 3.3).Таблица 3.1Результаты сравнения значений параметров первичных продуктов СРО белков(х2)гипотезы, %(х1)tВероятностьГИгипотезаДонорыВыдвинутаяПоказательОтличиеДоверительный интервалпоказателейи липидов у доноров (х1) и пациентов с геморрагическим инсультом (ГИ – х2)Кетодиены,(отн.ед.опт.пл./мл19,6243±0,166 16,4166±2,6913,20772,0177х1>х295,230,4635±0,0050,02887,4472х1>х299,99-44,9219х1<х299,99*100)СО-концевые остаткиаминокислот,0,4347±0,005(отн.

Характеристики

Список файлов диссертации