Диссертация (1174301), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Средний размер дистально расположенных ATV составил11,22±1,5 мм, медиана 9 мм (Таблица 12).602.2. Методики, шкалы и критерии оценки иммуногистохимическихреакций.Дляосуществленияиммуногистохимическогоэтапаработыбылииспользованы моноклональные антитела к анти-апоптотическому белку bcl-2,транскиптационнымфакторам(бета-катенин,р53),маркерамкишечнойдифференцировки (CDX2, СК20) и маркеру клеточной пролиферации Ki67.Данные об использовавшихся в исследовании антителах отражены в таблице 13.Таблица 13.
Характеристики антител.БелокКлон антителРазведениеБуфер, pHПроизводительKi67MIB1RTU6,0Dako (Denmark)Bcl-2124RTU8,0Dako (Denmark)β-Catenin-1RTU8,0Dako (Denmark)DO-7RTU8,0Dako (Denmark)CDX2DAK-CDX2RTU8,0Dako (Denmark)СК20Ks20.8RTU8,0Dako (Denmark)Бета-катенинр53На основании ориентации и объема материала в препаратах, а такженаличия достаточного для проведения реакций объема материала в парафиновыхблоках были отобраны образцы 131 образования (Таблица 14).Таблица 14.
Типы предопухолевых образований, отобранных для иммуногистохимическогоисследования.Тип предопухолевых образованийКоличество наблюденийНР28SSA/P30TSA15АТ30ATV28Изготовленные с подобранных парафиновых блоков срезы толщиной 34 мкм монтировали на высокоадгезивные предметные стекла (Polysine Slides,Menzel GmbH&Co KG, Germany). Депарафинирование и регидратация материала,демаскировка антигенов проводилась в модуле предобработки (PT-Module,Thermo, England) с использованием буферного раствора Dewax and HIER Buffer L61(pH 6,0) или Dewax and HIER Buffer M (pH 8,0) (Thermo, England) в течение20 минут при температуре 95-98ºС.
Данные о типе применявшегося буферногорастворе включены в таблицу 14. Иммуногистохимические реакции осуществлялив автоматизированном режиме с применением автостейнера Thermo Scientific LabVision Autostainer 480S (Thermo, England).Время инкубации с первичными антителами составило 20 минут,использовались положительные и отрицательные контроли. Детекцию проводилис применением DAB-хромогена в составе системы EnVision Flex (Dako, Denmark).После завершения автоматизированного этапа срезы окрашивали растворомгематоксилином в течение от 1 до 3 минут, после чего заключали вконсервирующую среду под покровное стекло.
Готовые препараты исследовали спомощью светового микроскопа Leica DM 4000B, использовали цифровую камерувысокого разрешения Leica DFC 495 и программу Leica Application Suite 8.0.Оценку экспрессии Ki67 проводили по общепринятой методике путемподсчетасреднегоколичестваположительноокрашенныхядерлюбойинтенсивности в 3 криптах, расположенных в разных участках препарата приувеличении х40, выраженного в процентах, отдельно для нижней и верхнейполовин крипт. В прилежащих к образованиям фрагментах интактной слизистойоболочки оценка проводилась только в нижней половине крипт. Отдельнооценивалась экспрессия Ki67 в расширенных и нерасширенных криптах SSA/P,эктопических криптах TSA.Общепринятойсистемыоценкиреакцииостальныхисследованныхмаркеров не существует. В большинстве исследований для оценки реакций с бетакатенином, р53, CDX2, bcl-2 и СК20 использовался качественные метод –отмечалось наличие или отсутствие реакции. На наш взгляд, для выявлениядиагностически значимых особенностей и уточнения характера биологическихвзаимосвязей между предопухолевыми образованиями толстой кишки требуетсяболее детальная оценка иммуногистохимических реакций.Для оценки ядерной экспрессии бета-катенина, р53 и CDX2 учитывалось:62- интенсивность окрашивания (отсутствует, слабая, умеренная иливыраженная);- среднее количество окрашенных ядер на 100 клеток препарата в трехполях зрения (об.
х40) в зонах с наибольшей экспрессией, выраженное впроцентах;- преимущественная локализация окрашенных ядер (верхняя/нижняяполовина или все протяжение крипт) в зонах с наибольшей экспрессией.Значимой реакцией для р53 мы приняли окрашивание 5% и более клетокумеренной или выраженной интенсивности.На основании характера экспрессии в интактной слизистой оболочкенормальным уровнем экспрессии CDX2 было принято считать окрашивание 90%и более ядер умеренной или выраженной интенсивности.Для описания экспрессии bcl-2 производилась оценка:- интенсивность окрашивания (отсутствует, слабая, умеренная иливыраженная);- преимущественная локализация окрашенных клеток (базальные отделы,базальные отделы и нижняя половина крипт или все протяжение крипт).На основании характера экспрессии в интактной слизистой оболочке занормальный уровень экспрессии было принято наличие немногочисленных слабоокрашенных клеток в базальных отделах крипт.Для оценки экспрессии СК20 учитывалось:- интенсивность окрашивания по шкале от 0 до 5 (0 – отрицательная; 1 –очень слабая; 2 – слабая; 3 – умеренная; 4 – яркая; 5 – очень яркая) в связи сбольшим разбросом показателей;- преимущественная локализация окрашенных клеток (поверхностная,верхняя 1/3 крипт, верхние 2/3 крипт или все протяжение крипт);- характер окрашивания (диффузный или очаговый).Длявсехмаркеровпроводилосьпопарноесравнениеполученныхрезультатов между НР, SSA/P, АТ, ATV и TSA.
При наличии реакции в63прилежащих фрагментах интактной слизистой оболочки проводилось сравнениесо всеми группами предопухолевых образований толстой кишки.Статистическаяобработкаданныхпроводиласьсиспользованиемпрограммы PASW Statistics 22. Описательные статистики представлялись в видесреднего и стандартного отклонения, медианы и 25-го и 75-го процентилей дляколичественных переменных, а также частот встречаемости и долей в выборкедля качественных переменных. Проверка распределения на нормальностьпроводилась с использованием теста Колмогорова-Смирнова. Для сравненияколичественных данных в двух несвязанных между собой выборках применялсяТ-критерий Стьюдента для параметров, распределённых нормально, и U-критерийМанна-Уитнидляпараметров,распределениекоторыхотличалосьотнормального, а также для параметров, относящихся к порядковой шкале.
Длясравнения номинальных переменных в двух несвязанных совокупностяхиспользовался критерий Хи-квадрат, а при наличии ограничений для егоиспользования – точный критерий Фишера. Для множественных сравненийколичественных данных в несвязанных выборках применялись параметрическийТ-критерий Стьюдента с поправкой Бонферони и непараметрический критерийКраскела-Уоллиса.Еслипослепроведениямножественногосравнениявыявлялись существенные различия, впоследствии проводились попарныегрупповые сравнения в зависимости от вида распределения соответствующихпараметров с использованием Т-критерия Стьюдента или U-критерия МаннаУитни.
Длякритериймножественных сравнений качественных данных использовалсяХи-квадрат. В последствии необходимые попарные сравненияпроводилисьсиспользованиемкритериевХи-квадратилиФишера.Корреляционный анализ качественных данных проводился с использованиемкоэффициентов Фи и Крамера в зависимости от размеров таблиц сопряжённости.Определение значимости качественных признаков по влиянию на качественнуюзависимую переменную применялся метод дискриминантного анализа. Уровеньзначимости (p) принимали равным 0,05 во всех вышеописанных сравнениях.64Глава 3. Результаты собственных исследований.3.1.Морфологическиеииммуногистохимическиекритериидиагностики НР и SSA/P.3.1.1. Анализ морфологических характеристик НР и SSA/P.3.1.1.1. Гиперпластические полипы.При анализе данных, полученных из сопроводительной медицинскойдокументации (глава 2), было установлено, что:-проксимальнорасположенныеHPдостовернокрупнее,чемрасположенные дистально (р<0,05);- выявленная разница в размерах HP плоского и полиповидного типа неявляется достоверной (р>0,05);- HP полиповидного типа достоверно чаще располагались в дистальныхотделах толстой кишки, чем в проксимальных (p<0,05).
Для HP полипов плоскоготипа статистически значимой разницы выявлено не было (Таблица 15).Таблица 15. Взаимосвязь локализации и макроскопического типа гиперпластических полипов.Класс образованияПолиповидныйПлоскийНе указанВсего:Проксимальнаялокализацияn(доля)14(4,5%)100(31,7%)7(2,2%)121(38,4%)Дистальнаялокализацияn(доля)48(15,2%)113(35,9%)33(10,5%)194(61,6%)Всего:n(доля)62(19,7%)213(67,6%)40(12,7%)315(100%)В классификации ВОЗ выделяют следующие морфологические типы HP:- микровезикулярный, характеризующийся наличием в цитоплазмебольшинства клеток мелких капель муцина (Рис. 1);- богатый бокаловидными клетками, эпителий которого представленпреимущественно бокаловидными клетками (Рис.
2);65- бедный муцином, характеризующийся практически полным отсутствиемкапель муцина в цитоплазме клеток (Рис. 3).Рис. 1. Гиперпластический полип, микровезикулярный тип. В цитоплазме большинстваклеток определяются мелкие капли муцина. Окраска гематоксилином и эозином, об.х40.66Рис. 2. Гиперпластический полип, богатый бокаловидными клетками тип. Эпителийпредставлен преимущественно бокаловидными клетками. Окраска гематоксилином и эозином,об.х20.Рис. 3.
Гиперпластический полип, бедный муцином тип. В цитоплазме клеток каплимуцина практически отсутствуют. Окраска гематоксилином и эозином, об.х20.67Среди 315 исследованных HP образования микровезикулярного типасоставили 88,3 % (n=278). Среди остальных 37 HP в 12 случаях (3,8%) быливыявлены очаги бокаловидной дифференцировки, в 10 случаях (3,2%) –бокаловидная дифференцировка преобладала, в 15 случаях (4,8%) – отмечалисьчерты HP, бедного муцином (Таблица 16).
В связи с тем, что количествоописанных «не микровезикулярных» полипов мало, выделение их в отдельныегруппы в ходе дальнейшей работы представляется нецелесообразным.Таблица 16. Морфологические типы гиперпластических полипов.Морфологические типы НРКоличество наблюденийДоляМикровезикулярный27888,3%Богатый бокаловиднымиклетками227,0%Бедный муцином154,8%Всего:315100%В 21,6% HP (n=68) отмечалось наличие сомнительного расширениябазальных отделов крипт (Таблица 17), в том числе в 29 проксимальнорасположенных НР (24,0%) и в 39 дистально расположенных НР (20,1%). Степеньрасширения, по нашему мнению была недостаточна для отнесения образований кгруппе SSA/P (Рис. 4).Таблица 17. Частота выявления сомнительного расширения базальных отделов крипт вгиперпластических полипах.Сомнительноерасширениебазальных отделовкриптОпределяетсяЛокализация НРПроксимальнаяДистальнаяnnдолядоля293924,0%20,1%Всего:nдоля6821,6%Отсутствует9276,0%15579,9%24778,4%Всего:121100%194100%315100%68Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
