Диссертация (1174250), страница 9
Текст из файла (страница 9)
В работе использовался набор «ОТ1»дляпроведенияобратнойтранскрипции(Синтол,РоссийскаяФедерация). Протокол реакции:1. В пробирках типа Эппендорф приготовить смесь праймеров: по 1 мкл напробу Oligo-dT и Random праймеров.2. К смеси праймеров добавить образец выделенной РНК в объеме 10 мкли деионизированную воду до суммарного объема смеси, равного 20 мкл.3.Пробирки инкубировать в термостате 3 минуты при температуре75˚С (термостат «Термит», ДНК-Технология, Российская Федерация).4. Приготовить и внести в пробирки смесь объемом 15 мкл, состоящую из1 мкл фермента M-MuLV Reverse Transcriptase, 3 мкл 10-кратного буферадля ревертазы, 1 мкл dNTP и деионизированной воды до конечногообъема.5. Пробирки с готовой смесью инкубировать в течение 40 минут при 37˚С,а затем 5 минут при 92˚С для инактивации фермента.
Полученную в ходе49реакции кДНК можно сразу использовать для проведения ПЦР илихранить при температуре - 80˚С.ДляопределенияэкспрессиигенаHSP70применялсявысокотехнологичный метод капельной цифровой ПЦР – DropletDigital(ddPCR™)[141].Методикавыполняласьсогласнопротоколупроизводителя c использованием системы QX200™ DropletDigital™ PCRSystem (Bio-Rad, США) при следующих условиях амплификации: 95⁰С – 5минут, (95⁰С – 30 сек., 60⁰С – 1 минута) × 40, 4⁰С – 5 минут, 90⁰С – 5минут.
Результаты подсчитывались автоматически и выражались вколичестве копий гена HSP70 на микролитр образца кДНК пациента.Определение полиморфизма +1267A>G (rs754888705) в гене HSP70-2Дляопределениягенетического(rs754888705) гена HSP70-2полиморфизма+1267A>Gприменялся метод ПЦР с последующимрестрикционным гидролизом образующихся фрагментов с использованиемэндонуклеазы рестрикции PstI (СибЭнзим, Российская Федерация).Выбор данного полиморфизма обусловлен имеющимися в научнойлитературе сведениями о том, что определенные аллельные вариантыданного полиморфного маркера чаще встречаются у пациентов с ИБС,инфарктом миокарда [19, 23].
В связи с этим полиморфный маркер+1267A>G (rs754888705) в гене HSP70-2 был выбран с целью изучения егороли у пациентов с эпизодами повышения артериального давления.Суть используемого метода ПЦР заключается в амплификацииопределенного фрагмента ДНК, содержащего анализируемую точковуюмутацию,сдальнейшимрасщеплениемнаработанногоампликонарестриктазой для идентификации аллелей анализируемого гена. Врезультате после амплификации, рестрикции и процедуры плавления накривых плавления наблюдаются пики, количество которых можетсвидетельствовать о наличии или отсутствии однонуклеотидной замены.
Вработе использовались праймеры - 5’-CATCGACTTCTACACGTCCA-3’ и505’-CAAAGTCCTTGAGTCCCAAC-3’ (сайты узнавания CTGCA▼G иG▲ACGTC) [142]. Определение аллельных вариантов в исследуемыхобразцах осуществлялось путем сравнительного анализа кривых плавленияобразцов до обработки рестриктазой и после.Протокол постановки реакции:1.Провести реакцию ПЦР-РВ с добавлением праймеров для генаHSP70-2. Программа амплификации: 95˚С – 5 минут, (95˚С – 20 секунд,61˚С – 30 секунд, 72˚С – 20 секунд).2.Осуществить плавление образцов после окончания реакции.3.Внести в каждую пробирку с образцом по 2 мкл Buffer O и BSA, 0,7мкл рестриктазы, дополнить ddH20 до суммарного объема смеси впробирке, равного 20 мкл.4.Провести инкубацию образцов при температуре 37˚С в течение 1часа.5.Поместить пробирки в амплификатор и снова провести процедуруплавления.2.4.Статистическая обработка данныхДля выполнения статистической обработки данных была созданаэлектронная таблица с помощью программы «Microsoft Excel 2007» споследующей обработкой в пакете прикладных программ для научнотехнических расчетов STATISTICA 10.0.
Числовые данные представлены ввиде Mе (медиана), [25; 75] – 25-й и 75-й перцентиль. Для оценкидостоверностиразличиймеждудвумягруппамииспользовалсянепараметрический критерий Манна – Уитни, внутри группы - критерийУилкоксона. Различия считали достоверными при p<0,05.N/S¹ - недостоверно для группы 1а в сравнении с группой контроля, N/S² - недостоверно для группы 1б в сравнении с группой контроля. Зависимостьмеждуисследуемымипоказателямиопределялиспомощью51корреляционного анализа. Сила связи оценивалась по критерию ранговойкорреляции Спирмена. Направленность связи оценивалась по знакукоэффициента корреляции.СравнительныйизучаемогогенадостоверностьанализHSP70различийраспределениявлейкоцитахвчастотахаллелейипериферическойвстречаемостигенотиповкровиипроводилисиспользованием критерия Манна-Уитни и Фишера.
Проводился расчетотношения шансов (ОR).52ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ3.1.Анализ факторов риска развития артериальнойгипертонии у женщин, подверженных воздействию длительногостресса в сравнении с группой контроляАнализ факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний выявил,что курение незначительно преобладало в группе контроля (6,3 %). ИМТбыл выше в группе женщин 1а, с эпизодами повышения АД (р>0,05).Абдоминальное ожирение и ожирение преимущественно также выявлялосьв группе женщин 1а (р>0,05).Отягощенная наследственность по ССЗпреобладала у пациентов основной группы в сравнении с группойконтроля. Однако данные носили не достоверный характер (р>0,05).Все женщины, матери тяжелобольных детей вели малоподвижныйобраз жизни. В группе контроля малоподвижный образ жизни выявлен у29,4 % женщин.При оценке общего сердечно-сосудистого риска в основной группе67,5 % женщин имели низкий сердечно-сосудистый риск, 21 % - среднийриск и 11,5 % женщин - высокий сердечно-сосудистый риск.
Рискоценивался в зависимости от уровня САД и ДАД, наличия факторов рискаи бессимптомного поражения органов-мишеней. В группе пациентов 1апроцентное распределение составило 58,3 % женщин с высоким сердечнососудистым риском, 25 % со средним сердечно-сосудистым риском и 16,7% с низким риском. В группе 1б было 80 % пациентов с низким и 20 % сосредним сердечно-сосудистым риском.Из анамнеза пациенток основной группы известно, что повышениеАД во время беременности отмечалось у 10 женщин.
Гестоз – у 3 женщин.Из них в группе 1а оказалось 7 пациенток и в группе 1б – 6 человек.Анализ семейного статуса выявил, что за время наблюденияпациенток основной и контрольной группы разводов не было.53Всем женщинам была проведена оценка липидного спектра, обменаглюкозы, пуринового обмена (мочевая кислота), электролитного составакрови (K, Na), оценка функции почек с определением СКФ CKD-EPI,свертываемостикрови(фибриноген),уровняС-реактивногобелка.Статистически значимых различий между группами выявлено не было(таблица 3).Таблица 3. Клинико-лабораторная характеристика групп сравненияФакторы рискаОсновная группа,Группар1<0,05n = 76контроля, n =р2<0,051а, n= 121б, n= 64634,854,7[3,8-5][4,3-5,7][4,34-5,23]3,083, 223,26[2,7-3,6][3,1-3,88][2,8-3,65]1,441,351,51[1,1-1,68][1,09-1,59][1,26-1,68]Триглицериды,0,670,890,4мМоль/л[0,5 -0,91] [0,62-1,09][0,36 - 1,06]Аполипопротеин А1,431, 541,48[1,2-1,55][0,39-0,69][1,33-1,64]0,980,740,74[0,7-1,34][0,62-0,9][0,66-0,86]Глюкоза плазмы4,444,524,35натощак, мМоль/л[3,9-4,66][4,09-5,08][4-4,6]Мочевая кислота,254,7244, 4262, 3мкМ/л[208-298][229-259,7] [225,8-290]ОХС, мМоль/лХС ЛПНП, мМоль/лХС ЛПВП, мМоль/лАполипопротеин ВС-реактивный белок, 0,610,80,385мг/л[0,14-1, 8][0,1-1,825][0,1-1,79]N/S¹,N/S²N/S¹,N/S²N/S¹,N/S²N/S¹,N/S²N/S¹,N/S²N/S¹,N/S²N/S¹,N/S²N/S¹,N/S²N/S¹,N/S²54Продолжение таблицы 3К, мМ/л4,34,374,73[4,07-4,5][4,1-4,74][4,41-5,0]137136,85137,5[135-141][135-138,3] [136,2-139,1]СКФ CKD-EPI,9090,591мл/мин/1,73 м2[83-104][82-104,5][83-100]Фибриноген, мг/дл288,5289291[251-312][261-303][262,5-332,5]Na, мМ/лN/S¹,N/S²N/S¹,N/S²N/S¹,N/S²N/S¹,N/S²* для р1<0,05, 1а в сравнении с группой контроля; ** для р1<0,05, 1б всравнении с группой контроля.3.2.Оценка выраженности тревоги и депрессии у женщин,подверженных воздействию длительного стресса в сравнении сгруппой контроляПри оценке выраженности тревоги по шкале HADS у женщинрепродуктивноговозраста,матерейдетейсонкологическимиигематологическими заболеваниями, в условиях длительного стрессавыявлен достоверно более высокий уровень тревоги по сравнению сгруппой контроля.
Для группы 1а – 12,5 (8,5; 14,5) баллов, 1б - 9 (6; 12)баллов и 4 (2; 7,5) балла для группы контроля.При оценке уровня депрессии по шкале HADS у женщинрепродуктивноговозраста,матерейдетейсонкологическимиигематологическими заболеваниями в условиях длительного стрессавыявлен достоверно более высокий уровень депрессии по сравнению сгруппой контроля.
Для группы 1а - 9 (7; 10) баллов, 1б – 8 (6; 9) баллов и 3(1; 5) балла для группы контроля (таблица 4).55Таблица 4. Показатели оценки тревоги и депрессии по шкале HADSу женщин, подверженных воздействию длительного стресса в сравнении сгруппой контроляШкала /ГруппаТревога,HAD баллыSДепрессия,Основная группа, n = 76Группар1<0,05контроля, n = 63 р2<0,051а, n = 121б, n = 6412,594р1<0,05[8,5;14,5]*[6;12]**[2;7,5]р2<0,059 [7;10]*8 [6;9]**3 [1;5]р1<0,05баллыр2<0,05* для р1<0,05, 1а в сравнении с группой контроля; ** для р2<0,05, 1б всравнении с группой контроля.Из 76 женщин основной группы субклинически выраженная тревогавстречалась у 42,2 % (32) женщин, клинически выраженная тревоганаблюдалась у 28,9 % (22) человек. Субклинически выраженная депрессиявстречалась у 35,5 % (27) человек.
Клинически выраженная депрессия у32,9 % (25) женщин (рисунок 1).Рисунок 1. Оценка уровня тревоги и депрессии по шкале HADS у женщин,подверженных воздействию длительного стресса56По шкале Ч.Д. Спилбергера, Ю.Л. Ханина в двух группах выявленыдостоверно более высокие уровни реактивной и личностной тревожности упациенток основной группы. В основной группе 57,5 % имели высокийуровень тревожности и 42,5 % имели умеренную тревожность впоказателяхреактивной(ситуативной)тревожности.Поуровнюличностной тревожности процентное распределение для высокого уровнятревожности составило 60 %, для умеренной тревожности 40 %.При сравнении уровня реактивной тревожностибыли выявленыдостоверно более высокие показатели по умеренному и высокому уровнютревожности в группах 1а - 39 (37; 43) и 54 (50; 56) балла (соответственно)и 1б - 39 (38; 42,5) и 55 (52; 58) баллов (соответственно); в контрольнойгруппе показатели были ниже и составили 35 (32; 40) и 49 (48; 56) баллов(соответственно).При сравнении уровня личностной тревожности были выявленыдостоверно более высокие показатели по умеренному и высокому уровнютревожности в группах 1а - 50 (48; 54) и 53 (50; 57) балла (соответственно)и 1б - 49 (42; 55) и 51 (45; 55) балла (соответственно), в контрольнойгруппе показатели личностной тревожности были ниже и составили 41(38; 43) и 45 (41; 50) балла (соответственно) (таблица 5).Таблица 5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
