Диссертация (1174250), страница 8
Текст из файла (страница 8)
и ночное АД- 120/80 мм рт.ст.43Электрокардиографическое исследованиеИсследование проводилось на 3-х канальном электрокардиографеMedinova (Китай, модель ECG-9803) в состоянии покоя, после 20минутного отдыха пациента. Регистрировались 12 стандартных отведенийпо общепринятой методике.
Скорость протяжки бумаги: 50 мм/секунду;калибровка 10 мм/мВ; запись, по крайней мере трех последовательныхQRS комплексов.Эхокардиографическое исследованиеВсемпациентампроводиласьэхокардиографияидоплерэхокардиография в цветовом, импульсно-волновом, постоянноволновомрежиме,атакжетканеваядопплерография.Эхокардиографическое исследование выполнялось на эхокардиографеTOSHIBA Nemio при стандартном положении пациента на левом бокусекторным датчиком с частотой 2 МГц по общепринятой методике H.Feigenbaum (1986). Исследование проводилось из парастернальногодоступа по длинной и короткой оси левого желудочка, из позиции на 4камеры.
При оценке эхокардиографических параметров учитывалосьсреднее значение из трёх измерений при спокойном дыхании пациента. Увсех больных проведено измерение размеров полостей сердца. Степеньвыраженности митральной и трикуспидальной регургитации оценивали спомощью цветового допплера из апикальной четырехкамерной позиции попроцентному соотношению площади струи регургитации к площадилевого (для митральной регургитации) или правого (для трикуспидальнойрегургитации) предсердий. Исследование кровотока в выносящем трактеправого желудочка проводили в парастернальной позиции по короткойоси, на уровне конца створок аортального клапана с помощьюдоплерэхокардиографии в импульсволновом режиме.
Расчет среднегодавления в легочной артерии (мм рт. ст.) проводили по отношению АТ/АЕс помощью специальной таблицы. При проведении ЭхоКГ исследования44придерживалисьрекомендаций,предложенныхАмериканскойАссоциацией эхокардиографистов [140].Ультразвуковое исследование брахиоцефальных артерийЦветовое дуплексное сканирование брахиоцефальных артерийпроводилось на аппарате TOCHIBA Nemio при стандартном положениипациента лежа на спине линейным датчиком с частотой 6 МГц.Сканированиесонныхартерийосуществлялосьвпродольной,переднебоковой, заднебоковой и поперечной плоскости в В-режиме,цветовом допплеровском режиме и в импульсно-волновом допплеровскомрежиме.Лодыжечно-плечевой индексЛодыжечно-плечевой индекс (ЛПИ) рассчитывали как соотношениесистолического артериального давления в дистальном участке заднейбольшеберцовой артерии к систолическому артериальному давлению вплечевой артерии.Систолическое артериальное давление измеряли линейным датчикомвимпульсно-волновомдопплеровскомрежимепутёмналоженияпневматической манжеты и нагнетания воздуха до прекращения кровотокаспоследующимвыпусканиемвоздухаизманжетыдомоментавосстановления кровотока.
Момент прекращения и восстановлениякровотокарегистрировалидопплеровскимсигналомотдатчика,расположенного в проекции плечевой и задней большеберцовой артерии.Лабораторные методы исследования включали:Общеклинические исследования:Биохимический анализ кровивыполняли на автоматическомбиохимическом анализаторе «Hitachi» («BoehringerMannheim», Германия)по стандартным методикам с использованием реагентов производителя. В45сыворотке крови определяли содержание альбумина, электролитов(натрия, хлора), мочевой кислоты, глюкозы, показатели липидногоспектра: ОХС, ЛПВП, ЛПНП, ТГ, АпоА и АпоВ.
Функциональноесостояние почек оценивалось по уровню креатинина, мочевины и калиякрови. Проводился расчет скорости клубочковой фильтрации (СКФ) поформуле CKD-EPI, учитывающейрасу, пол, возраст, креатининсыворотки.былДлярасчетаСКФиспользованкалькулятор,представленныйвинтернете https://www.kidney.org/professionals/KDOQI/gfr_calculator.Для оценки функции щитовидной железы определялся уровеньтиреотропного гормона (ТТГ), свободного тироксина (свТ4), свободноготрийодтиронина (свТ3).Определялсяуровень базального кортизола ипролактинавсыворотке венозной крови. Забор крови осуществлялся процедурнойсестрой отделения с 08 до 10 часов. В качестве подготовки к исследованиюпациентам давались рекомендации исключить прием лекарственныхпрепаратов за 48 часов, жирную пищу, тяжелую физическую иэмоциональную нагрузку за 24 часа до проведения анализа (посогласованию с лечащим врачом), не принимать спиртные напитки и некурить за 3 часа до проведения забора биоматериала, исключитьфизиотерапевтические процедуры.
Для всех женщин сдача кровипроисходила на 2-7 день менструального цикла.Для определения уровня фибриногена применялся клотинговыйметод (изменение амплитуды колебаний шарика в электромагнитномполе в зависимости от свертывающихся характеристик исследуемогообразца) на аппарате STA-REVOLUTION с использованием наборареагентов «STA-Fibrinogen 5» Диагностика СТАГО, САС, Франция.Дляоценкифункциииммунохроматографическийпочеквсемэкспресс-тестпациентампроводилсядляопределениямикроконцентраций альбумина в моче «M-ALBU-CHECK-1» (VEDA.46LAB.,Франция).M-ALBU-CHECK-1представляетсобойбыстрыйполуколичественный скрининговый тест для выявления альбумина в моче.Метод основан на конкуренции альбумина в исследуемой пробе сальбумином, входящим в состав конъюгата, за ограниченное количествоместа на тестовой мембране.
Если концентрация альбумина в пробепревышаеткритическийуровень,этопрепятствуетобразованиюокрашенной линии в тестовой зоне. В противном случае образуется четкаяокрашенная линия. Концентрация альбумина определяется при сравнениис контрольной линией.Молекулярно-биологические исследованияОпределениеэкспрессиигенаHSP70влейкоцитахпериферической кровиПроведение исследования по определению уровня экспрессии генаHSP70 в лейкоцитах периферической крови в исследуемых группахосуществлялось на базе кафедры иммунологии МБФ ФГБОУ ВО РНИМУим. Н.И.
Пирогова.Перед постановкой данных реакций проводиласьэкстракция рибонуклеиновой кислоты (РНК) из цельной крови пациенток сиспользованием набора для выделения нуклеиновых кислот «АмплиСенсРИБО-сорб» (ИнтерЛабСервис, Российская Федерация) и проведениереакцииобратнойтранскрипциидляполучениякомплементарнойдезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК). На завершающем этапеисследования применялся метод ddPCR для определения экспрессии генаHSP70.Принципметодаповыделениюнуклеиновыхкислотизпериферической крови основан на сорбции нуклеиновых кислот начастицах силикагеля и многократной отмывке от белков, мембран и другихклеточных компонентов. При участии гуанидин тиоцианата, являющегосяхаотропным агентом и входящим в состав лизирующего буфера,47происходит лизис клеточных белков и сорбция нуклеиновых кислот насиликагеле.
Все действия выполнялись согласно следующему протоколу:1.Подготовить пробирки типа Эппендорф емкостью 1,5 мл на 1-2больше, чем количество исследуемых образцов.2.Прогреть на термостате «Термит» (ДНК-Технология, РоссийскаяФедерация) лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 притемпературе 62˚С до полного растворения кристаллов.3.В пробирки добавить по 450 мкл лизирующего раствора и внести 100мкл образца или деионизированной воды, использующейся в качествеотрицательного контрольного образца.4.Пробирки перемешать с использованием центрифуги-вортекса«Микроспин FV-2400» (Biosan, Латвия), затем центрифугировать 5 секундпри 5000 об/мин..5.Ресуспензировать сорбент на вортексе, внести в пробирки по 25 мклсорбента, перемешать на вортексе и оставить в штативе на 1 минуту, сновавортексировать и оставить на 5 минут.
Центрифугировать 30 секунд при10000 об/мин.6.Не захватывая сорбент отобрать надосадочную жидкость и добавитьпо 400 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на вортексе ицентрифугировать при 10 тыс. об/мин 30 секунд.7.Удалить надосадочную жидкость и добавить по 500 мкл раствора дляотмывки 3, перемешать на вортексе и центрифугировать при 10000 об/мин30 секунд.8.Удалить надосадочную жидкость и повторить отмывку растворомдля отмывки 3.9.Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 4,перемешать на вортексе и центрифугировать при 10 тыс.
об/мин 30 секунд,после чего удалить надосадочную жидкость дозатором с использованиемотдельного наконечника для каждой пробы.4810.Инкубировать осадившийся в пробирках сорбент в термостате при60˚C 15 минут, при этом крышки пробирок должны быть открыты.11.Добавить в пробирки по 50 мкл РНК-буфера, перемешать навортексе и снова поместить пробирки в термостат при температуре 60 ˚Cна 2-3 минуты.12.Перемешать на вортексе и центрифугировать на максимальныхоборотах (13-14 тыс об/мин) 1 минуту.13.Отобрать надосадочную жидкость пипеткой в стерильную пробирку,не захватывая при этом сорбента. Полученная надосадочная жидкостьсодержит очищенную РНК, готовую для дальнейшего исследования.Стерильные пробирки с образцами РНК всех исследуемых пациентовмаркировались и хранились при температуре -80˚С.Реакция обратной транскрипции проводилась с использованиемфермента обратной транскриптазы (ревертазы) и необходима для синтезакДНК на матрице РНК для дальнейшего проведения ПЦР-анализа дляопределения уровня экспрессии генов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
