Диссертация (1174230), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Построить для калибровочных проб графикзависимости оптической плотности в единицах оптической плотности отконцентрации ИЛ в пг/мл.7. Определить содержание ИЛ в пробах по калибровочному графику.2. Оценка обмена кортизола: определение уровня кортизола в сывороткекрови и определение соотношения ГКРIII/ГКРII. Исследование проводилось наиммунологическом анализаторе «Multiskan GO», Финляндия.Метод определения уровня кортизола основан на конкуренции междунемеченым антигеном и энзим-меченым антигеном на определенное количествосвязей с антителом. Количество энзим-меченых антигенов, связанных сантителами, обратно пропорционально концентрации немеченого исследуемого.Реактивы: 96 микротитрационных ячеек (12 стрипов);- кортизол-антисыворотка (голубая) — 1 флакон (11 мл) содержит кроличьюантикортизоловую сыворотку в протеиновом (BSA) буфере с нертутнымконсервантом;- кортизол-стандарты — 1 флакон (0,5 мл), обозначенный А, содержит 0мкг/дл кортизола; 7 флаконов (по 0,5 мл каждый), обозначенные В—Н, содержаткортизолвпротеиновомбуфере(BSA)снертутнымконсервантомвконцентрациях 0,5, 1,5, 4,0, 10,0, 20,0 и 60,0 мкг/дл;- кортизол-контроль — 2 флакона (по 0,5 мл каждый) с уровнями I и IIсодержат кортизол низкой и высокой концентрации в протеиновом буфересыворотки с нертутным консервантом;73- кортизол-энзимный конъюгатный концентрат — 1 ампула (0,3 мл)содержит раствор кортизола в протеиновом буфере с нертутным консервантом.Перед исследованием разводят конъюгатным растворителем;- конъюгатный растворитель — 1 флакон (11 мл) содержит основанный напротеине буфер с нертутным консервантом;- ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит раствортетраметилбензидина (ТМБ) в цитратном буфере с водорода пероксидом;- моющий концентрат — 1 флакон (100 мл) содержит буферные соли снеионнымдетергентом.Передиспользованиемразводятв10объемахдеионизированной или бидистиллированной воды;- стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор серной кислоты;- бидистиллированная вода.Все реагенты и пробы перед началом анализа должны быть приведены ккомнатной температуре (25 °С) и тщательно перемешаны.Пониженнаятемпература реагентов и проб дает заниженные результаты оптическойплотности.
Сыворотку (плазму) крови, свободную от гемолиза, можно хранитьпри 2—8 °С 24 ч или более длительное время при минус 20 °С.Оборудование:микропланшетныйиммуноферментныйанализатор«Multiskan GO», Финляндия, настраиваемый на длину волны 450 нм и 600 или 620нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) Б1а1 Рах-2200, настраиваемый на 500—700 движений в 1 мин; автоматическое промывающее устройство Б1а1 Рах-2600;полуавтоматические дозаторы на 5—50, 50—200 и 200—1000 мкл, наконечники;градуированная лабораторная посуда; фильтровальная бумага для просушиваниястрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (приотсутствии программного обеспечения).В используемые ячейки микропланшета дозатором вносят по 25 мклстандартов,контролейсвежеприготовленногоисывороткиэнзимногокрови.Добавляютконъюгатногопораствора.100мклОсторожновстряхивают штатив с ячейками 5—10 с, перемешивая содержимое ячеек.74Дозатором (лучше многоканальным) вносят в каждую ячейку по 100 мклкортизол-антисыворотки.
Микротитрационную плашку со стрипами помещают винкубатор-шейкер для инкубации (~ 25 °С) в течение 45 мин, одновременновстряхивая со скоростью 500—700 встряхиваний в 1 мин. Используяавтоматическое моющее устройство, аспирируют и пятикратно тщательнопромывают каждую ячейку моющим раствором по 350 мкл, избегая попаданияпузырьковвоздуха.Послеэтогоудаляютостаткижидкостисячеек,переворачивая плашку на фильтровальную бумагу.
В каждую ячейку дозаторомдобавляют по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора. Закрывают микропланшет иинкубируют ячейки в шейкере (встряхивание с частотой 500—700 движений в1мин) при t ~ 25 °С 10—15 мин. В каждую ячейку дозатором добавляют по 100мкл стоп-раствора (0,2 М раствор серной кислоты).
Встряхивают плашку 5—10 с.Измеряют оптическую плотность раствора в ячейках при длине волны 450 и620 нм (в течение 30 мин после добавления стоп-раствора).Перед считыванием абсорбции необходимо установить прибор на «0»соответственно с нулевым стандартом (Blank).Полученные значения стандартов кортизола используют для построениястандартнойкривой, покоторой определяют концентрацию гормона висследуемых образцах. Пробы, значения которых превышают наивысшийстандарт, необходимо дополнительно развести стандартом 0 мкг/дл и повторноисследовать.Глюкокортикоидный рецептор (ГКР) является рецептором кортизола идругих глюкокортикоидов.
После активации глюкокортиоидный рецептор, как идругие стероидные рецепторы, димеризуется, перемещается в ядро клетки и тамактивирует транскрипцию соответствующих генов, что определяется с помощьюиммуноферментного анализа. ГКР выполняют центральную роль в механизмахреализации глюкокортикоидного эффекта.ГКР II типа – «истинные» глюкокортикоидные рецепторы, реализующиеметаболическийэффектГК.ГКРIIтипасвязываютГКиэтот75стероидорецепторныйкомплекстранслоцируетсявядроклетки.Ткани,содержащие высокий уровень ГКР II, под воздействием ГК усиливаютвнутриклеточный глюкокортикоидозависмый метаболизм (S. Okret et al., 1989; П.П.
Голиков, 1993). Таким образом, ГК и ГКР II представляют собой индукторнуюстресс-реализующую систему.ГКР III - транскортиноподобные глюкокортикоидные рецепторы, имеющиепрямое отношение к внутриклеточной транспортировке ГК (Е. А. Корнева, 2003).Их следует отнести к срочным механизмам транспортировки ГК через клеточнуюмембрану. Скорость ассоциации кортизола с ГКР III значительно выше, чем с ГКРII (П. П.
Голиков, 1993). Кроме того, насыщение ГКР III происходит при болеевысоких концентрациях кортизола, чем насыщение ГКР II. Высокая скоростьассоциации кортизола с ГКР III препятствует связыванию его с ГКР II до тех пор,пока не закончится насыщение кортизола ГКР III. Контрэффект ГКР III поотношению к ГКР II идет двумя путями: во-первых, ГКР III ингибируетаккумуляцию ГК в клетки. Снижение внутриклеточного уровня препятствуетнасыщению ГКР II и, таким образом, уменьшает транслокацию комплексовкортизол-рецептор, а, следовательно, и глюкокортикоидный эффект.
Во-вторых,ГКР III препятствует образованию комплекса кортизол – ГКР II, то естьреализацию глюкокортикоидного эффекта. Таким образом, ГКР III и КСГсоставляютэндогеннуюантиглюкокортикоиднуюсистемузащиты,и,следовательно, относятся к стресс-протективной системе.Анализлитературыпоглюкокортикоиднойрегуляциииммунитетапоказывает, что в конечном счете модуляция реакций ГГАС на стресс зависит отбаланса рецепторов обоих типов [Селье Г. , 1977, Гаркави Л. Х., Квакина Е. Б.,Уколова М.
А.,1990, Резников А. Г. , 2007], что побудило нас в рамках данногодиссертационного исследования, помимо оценки уровня кортизола в сывороткекрови, рассмотреть отношение активности глюкокортикоидных рецепторов уизучаемых пациентов для поиска новых путей оценки обмена кортизола приоперационном стрессе, несмотря на условность данного метода исследования.763. Клинические методы:3.1.Специализированныйраспространённостигериатрическихсиндромасиндромовгериатрическийстарческойвосмотр.астениипроведенномиДлявыявленияисследованиибылизучениядругихизученгериатрический статус пациентов на следующие сутки после проведенияоперативноговмешательства.Выявлениесиндромастарческойастениипроводилось с помощью осмотра и опроса пациентов пожилого и старческоговозраста по оригинальной компьютерной программе «Оптимизация ухода вгериатрии в зависимости от степени старческой астении» на основаниипроведения специализированного гериатрического осмотра (свидетельство огосударственной регистрации № 2013660311) [Ильницкий А.
Н., Прощаев К. И.,2012].3.2. Периоперационный гемодинамический мониторинг проводился спомощью мониторных системы фирмы «Draeger» (Германия).3.3. Оценка операционного риска определялась по шкалам Goldman иМНОАР.Шкала оценки состояния пациента МНОАРОценка производится путем подсчета баллов.Критерии:ASA I - 0,5 баллаASA II - 1 баллASA III - 2 баллаASA IV - 4 баллаASA V - 6 балловОбъем и характер операцииМалые полостные или небольшие операции на поверхности тела - 0,5 баллаБолее сложные и длительные операции на поверхности тела, позвоночнике,нервной системе и операции на внутренних органах - 1 балл77Обширные или продолжительные операциив различныхобластяххирургии, нейрохирургии, урологии, травматологии, онкологии - 1,5 баллаСложные или продолжительные операции на сердце, крупных сосудах (безприменения ИК), а также расширенные и реконструктивные операции в хирургииразличных областей - 2 баллаСложные операции на сердце и магистральных сосудах с применением ИКи операции по пересадке внутренних органов - 2,5 баллаОценка характера анестезии.Различные виды местной потенцированной анестезии - 0,5 баллаРегионарная, нейроаксиальная, внутривенная или ингаляционная анестезияс сохранением спонтанного дыхания или с кратковременной вентиляцией черезмаску наркозно-дыхательного аппарата - 1 баллСтандартные варианты комбинированного эндотрахеального наркоза илиТВВА - 1,5 баллаКомбинированный эндотрахеальный наркоз или ТВВА в сочетании сметодами регионарной анестезии и в комплексе со специальными методамикорригирующей интенсивной терапии - 2 баллаКомбинированный эндотрахеальный наркоз или ТВВА в сочетании сметодами регионарной анестезии в условиях ИК, ГБО при комплексномприменении специальных методов анестезии, интенсивной терапии и реанимации- 2,5 балла.Степень риска: I (незначительная) – 1,5 баллов; II (умеренная) – 2-3 балла;III (значительная) – 3,5-5 баллов; IV (высокая) – 5, 5-8 баллов; V (крайне высокая)– 8,5-11 баллов.Все пациенты соответствовали II-III группе кардиального риска поклассификации Goldman (Таблица 4,5).78Таблица 4 - Шкалы оценки состояния пациента GoldmanКритерииБаллыВозраст более 70 лет5Инфаркт миокарда в предшествующие 6 месяцев10Ритм галопа или расширение яремной вены11Выраженный аортальный стеноз7Эктопический ритм или предсердные экстрасистолы на ЭКГ передоперацией или желудочковые экстрасистолы более 5 в минуту,7зарегистрированные когда-либо до опрацииРаО2 менее 60 мм рт.
ст. или РаСО2 более 50 мм рт.ст.К+ менее 3,0 ммоль/л или НСО3 менее 20 мэкв/лАзот мочевины более 50 или креатинин более 3,0 мг/длНенормальный уровень сывороточной глутаминоксалаттрансаминазы,3признаки хронических заболеваний печени или постельный режим всвязи с экстракардиальными заболеваниямиЛапаротомия3Торакотомия или оперативное вмешательство на аорте3Экстренное оперативное вмешательство4Примечание: максимальное количество баллов-53.79Таблица 5 - Оценка степени рискаКлассКоличествобалловОценка степени рискаI0-5Нет риска кардиальных осложненийII6-12Малый риск кардиальных осложненийIII13-25Высокий риск кардиальных осложненийIV>26У этой категории оперативное вмешательство должнобыть выполнено лишь по жизненным показаниям2.4 Статистическая обработка результатовСтатистическаяобработкарезультатовисследованияпроводиласьсопределением средней арифметической и ошибки средней.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
