Диссертация (1174185), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Демонстрация достоверности отличий уровня гетероплазмиимутации m.12315G>A в липофиброзной бляшке и нормальной интиме аортна блочной диаграмме [89, 114].Рисунок 31. Демонстрация достоверности отличий уровня гетероплазмиимутации m.13513G>A в липофиброзной бляшке и нормальной интиме аортна блочной диаграмме [89].166Рисунок 32. Демонстрация достоверности отличий уровня гетероплазмиимутации m.14846G>A в липофиброзной бляшке и нормальной интиме аортна блочной диаграмме [89].Рисунок 33. Демонстрация достоверности отличий уровня гетероплазмиимутации m.15059G>A в липофиброзной бляшке и нормальной интиме аортна блочной диаграмме [89, 114].167Таблица 24.
Бутстрэп-анализ коэффициента корреляции между уровнемгетероплазмии и наличием липофиброзной бляшки [89, 114]Значение коэффициентаАсимптотическаякорреляциизначимость (двусторонняя)m.652delG0,4850,012**m.652insG0,0750,186m.1555A>G-0,4010,001**m.3256C>T0,6080,001**m.3336T>C0,0860,175m.5178C>A-0,3020,024**Мутацияm.12315G>A 0,4010,042**m.13513G>A 0,3350,097*m.14459G>A 0,4700,015**m.14846G>A 0,3150,101*m.15059G>A 0,4360,026**Примечание: высокодостоверная корреляция мутаций с атеросклеротическимибляшками (p≤0,05); корреляция мутаций с атеросклеротическими бляшками значима на уровнеp≤0,1.Таблица 25.
Сравнение процента 11 митохондриальных мутаций ватеросклеротических бляшках и нормальной интиме аорт [13, 27, 45, 83, 8798, 100-102, 104-116, 119, 120, 160, 463, 482, 483, 493, 495-500, 502, 505, 528532]ГенMT-TL1Мутацияm.3256C>T№ аортыНормаБляшкаA1818A31122A51227168MT-ND5m.13513G>Am.652delGMT-RNR1m.652insGm.1555A>GMT-TL2MT-ND2m.12315G>Am.5178C>AA61334A14560A22030A32040A41525A64560A73045A102A2017A3422A5228A609A708A11411A2157A3548A5197A1835A205A306A4015A51235A2147169MT-ND6MT-ND1m.14459G>Am.3336Т>Сm.14846G>AA3148A5105A63118A324A5210A6053A136A3017A1814A227A638A13141A32852A54366MT-CYTBm.15059G>A3.4 Теоретическое обоснование дальнейших исследований интимы артерийТеоретическим обоснованием для проведения дальнейших исследованийинтимы аорт послужили выявленные отличия в уровне гетероплазмии мутациймитохондриального генома при сравнении участков атеросклеротическогопоражения и нормальной интимы аорт [89].
Возможными механистическимиобъяснениями подобных различий могут быть следующие:1.Согласноатеросклеротическихмоноклональнойпораженийвгипотезе,интимемозаичноесосудистойрасположениестенкиможетвозникнуть из-за клеток, имеющих высокий уровень мутантных копий170митохондриального генома. Возможно, в мутантных клетках начинаетсяошибочная интерпретация внешних сигналов и выделение провоспалительныххемокинов, что привлекает к потенциальному очагу атеросклеротическогопоражения клетки из сосудистого русла. Усугублению процесса можетспособствовать наличие в клетках крови высокого уровня гетероплазмиимутаций, связанных с атеросклерозом [89, 114].2.
Избирательное выживание в возникающем атеросклеротическомпоражении мутантных клеток. Данные клетки начинают неограниченнопролиферировать из-за угнетения их собственного дыхания, в связи свозникшими дефектами ферментов дыхательной цепи митохондрий. Такимобразом, у них появляется преимущество перед нормальными клетками [89,114].3.Избирательноеатеросклеротическогопопаданиепоражения,амутантныхклеток,клетокимеющихвочагнормальныймитохондриальный геном в область непораженной интимы артерий [89, 114].В целях понимания, имеет ли гетероплазмия митохондриального геномапатогенетическое значение, необходимо было провести анализ уровнягетероплазмии мутаций:1) В суммарном (общем) атеросклеротическом поражении, сравнив его суровнем гетероплазмии данных мутаций в суммарной нормальной интиме [89].2) В морфологически картированной интиме нескольких аорт, разделив еена участки с различной степенью поражения и нормальной интимой. Вподобном исследовании можно было получить подтверждение мозаичногорасположения атеросклеротических поражений в сосудистой стенке, в томслучае, если уровень гетероплазмии мутаций в различных как пораженных, таки нормальных участках окажется разным [89].3) В образцах, выделенных из клеток крови [89].Существует предположение, что не только клетки интимы, но и клеткикрови участвуют в атерогенезе.
Из сосудистого русла моноциты могутмигрировать сквозь эндотелий в протеогликановый слой интимы. Там171моноциты становятся макрофагами и начинают удалять лишнее количествомодифицированных липопротеидов. Попадающие в стенку сосуда лимфоциты,вероятно, предназначены для выполнения сигнальной роли в то время, когдаформируется иммунный ответ и локальная воспалительная реакция [89].Вследствие того,что атеросклероз это мультифакториальноезаболевание, вполне вероятно, что различный уровень гетероплазмии в клеткахинтимы может возникать под влиянием целого ряда факторов [89].3.5 Анализ уровня гетероплазмии мутаций мтДНК в гомогенатахнормальной и пораженной атеросклерозом интимы аортДальнейшиеисследованиябылипосвященысравнениюсреднегопроцента выбранных 11 мутаций в образцах ДНК, выделенных из суммарныхгомогенатов пораженной и нормальной интимы 10 аорт [45, 88-90, 92, 100, 101,107.
108, 110, 119, 482].При неформальном статистическом подходе выявлено 6 мутаций,процент которых в гомогенатах ткани пораженной интимы был значительновыше по сравнению с гомогенатами ткани нормальной интимы. Этонуклеотидные замены m.12315G>A(6 из 10 аорт), m.14459G>Am.5178C>A (4/10), m.15059G>A(3/10),(5/10),m.1555A>G и m.3336T>C (2/10).Данные по гомогенатам интимы аорт, в которых имеются такие отличия,представлены в таблице 26 [45, 88-90, 92, 100, 101, 107. 108, 110, 119, 482].Обращают на себя внимание множественные митохондриальные мутациив 7 из 10 исследованных аорт, процент которых в несколько раз выше вгомогенатах из пораженной атеросклерозом интимы, чем из нормальной.Например, в аорте B1 процент гетероплазмии пяти мутаций значительно вышев гомогенате атеросклеротического поражения, чем в гомогенате нормальнойинтимы.
В гомогенатах из пораженных участков аорт B2 и B7 преобладают потри мутации, а в B4, B8, B9 и B10 – по две митохондриальные мутации [45, 8890, 92, 100, 101, 107. 108, 110, 119, 482].172Таблица 26. Сравнение уровня гетероплазмии шести митохондриальныхмутаций в гомогенатах из нормальной интимы и атеросклеротическихпоражений аорт [45, 88-90, 92, 100, 101, 107.
108, 110, 119, 482].ГенМутацияMT-RNR1m.1555A>GMT-ND2MT-ND1MT-ND6MT-TL2MT-CYTBm.5178C>Am.3336Т>Сm.14459G>Am.12315G>Am.15059G>A№ аортыНормаПоражениеB1651B10016B1525B72577B82030B91823B2613B7630B1316B449B525B6510B10610B1514B2610B3916B436B71624B81762B13143173B23045B94156Формальный статистический анализ был проведен с помощью бутстрэпоценки сравнения средних значений зависимых выборок (таблица 27).
Анализзаключался в оценке среднего различия в уровне гетероплазмии в нормальныхучастках интимы и участках атеросклеротического поражения, и оценкедостоверности данных различий. Бутстрэп-анализ проводился с помощьютиражирования выборки, моделирования процесса воспроизводства случайногоотбора с возвращением. Знак представленной оценки отражал направлениесвязи [45, 88-90, 92, 100, 101, 107. 108, 110, 119, 482].Таблица 27. Сравнение суммарных гомогенатов нормальной интимыи атеросклеротического поражения методом бутстрэп-анализа [45,88-90, 92, 100, 101, 107.
108, 110, 119, 482]КоличествоПарныеДостоверностьаортразличияотличийm.652delG109,140,068*m.652insG100,730,725m.1555A>G109,860,001**m.3256C>T103,570,048**m.3336T>C100,690,003**m.5178C>A103,290,045**m.12315G>A1010,710,004**m.13513G>A102,0740,839m.14459G>A108,140,050**m.14846G>A10-2,000,075*m.15059G>A100,450,103*Мутация174Примечание: высокодостоверная корреляция мутаций с гомогенатамиатеросклеротического поражения (p≤0,05); корреляция мутаций с гомогенатами атеросклеротического поражениязначима на уровне p≤0,1.Согласностатистическимданнымпосуммарнымгомогенатампораженной и нормальной интимы, мутации митохондриального геномаm.3256C>T, m.14459G>A, m.1555A>G, m.12315G>A, m.3336T>C и m.5178C>Aвысокодостоверноассоциированыссуммарныматеросклеротическимпоражением аорты (p≤0,05), а мутации m.15059G>A и m.652delG – на уровнезначимости p≤0,1.
В то же время мутация m.14846G>A связана с отсутствиематеросклероза (p≤0,1). [45, 88-90, 92, 100, 101, 107. 108, 110, 119, 482]. Для рядазначимых мутаций достоверность отличий отображена на блочных диаграммах(рисунки 34-38) [89].3.6АнализуровнягетероплазмиимутациймтДНКвучасткахморфологически картированной стенки аорт3.6.1 Морфологическое и мутационное картирование аортСцельювыявлениясвязиодиннадцатимутациймтДНКсатеросклеротическими поражениями различной степени тяжести, проведеноморфологическое и мутационное картирование аутопсийного материала,представлявшего собой 5 образцов аорты, взятых у индивидов, которыепогибли из-за внезапной сердечно-сосудистой смерти или несчастного случая[89, 113, 116, 500, 502].Интима каждой из аорт имела приблизительный размер 7х9 см. В каждойаорте были выявлены зоны как с нормальной интимой, таки сатеросклеротическим поражением различной степени тяжести.
Им присвоеныранги. Первый ранг соответствовал нормальной интиме, второй ранг жировой175инфильтрации,третийрангжировойполосе,четвертыйранглипофиброзной бляшке, 5 фиброзной бляшке). В каждой исследованной аортебыло выявлено 38-70 подобных зон (рисунки 3943) [89, 113, 116, 500, 502].Общее количество проанализированных зон (участков сосудистой стенки) былоравно 265 (таблица 28) [89, 113, 116, 500, 502].Рисунок 34. Демонстрация достоверности отличий уровня гетероплазмиимутации m.1555A>G в нормальных и пораженных атеросклерозомсуммарных гомогенатах интимы аорт на блочной диаграмме [89].176Рисунок 35.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
