Диссертация (1174185), страница 17
Текст из файла (страница 17)
После этого происходило добавление следующего нуклеотида вреакционную смесь для пиросиквенса (рисунок 15) [89, 111, 114-116, 120, 132,312, 474, 494, 495, 501, 502, 504, 530].2.3.7.2 Пробоподготовка для пиросиквенсаБиотинилированный праймер для ПЦР (таблица 2) был необходим, чтобык одной цепи ПЦР-фрагмента могла присоединиться частица стрептавидинсефарозы. Это давало возможность исследовать мутации в одноцепочечномамплификате [89, 111, 114-116, 120, 132, 312, 474, 494, 495, 501, 502, 504, 530].Рисунок 16. Технология пиросеквенирования:пример пирограммыисследуемого фрагмента ДНК [89, 111, 114-116, 120, 132, 312, 474, 494, 495,501, 502, 504, 530].121Использовали следующие растворы для пробоподготовки [89, 111, 114116, 120, 132, 312, 474, 494, 495, 501, 502, 504, 530]:1) 2Х Binding buffer (BB)100 мл раствора содержали EDTA 0,0292 г; С4Н11NO3 0,121 г; Tween20 100 мкл; NaCl 11,7 г.
Доводили рН буфера до 7,6 с помощью 1 М НСl[89, 111, 114-116, 120, 132, 312, 474, 494, 495, 501, 502, 504, 530].2) 1Х Annealing buffer (AB) (на 100 мл раствора С4Н11NO3 0,242 г;C4H6MgO4x4H2O 0,043 г. Доводили рН буфера до 7,6 с помощью 4 МCH3COOH) [89, 111, 114-116, 120, 132, 312, 474, 494, 495, 501, 502, 504, 530].3) Washing buffer (WB) (на 100 мл раствора С4Н11NO3 0,121 г.Доводили рН буфера до 7,6 с помощью 4 М CH3COOH) [89, 111, 114-116, 120,132, 312, 474, 494, 495, 501, 502, 504, 530].4) 0,2 М NaOHРастворяли 0,8 г гранул NaOH в 100 мл воды [89, 111, 114-116, 120, 132,312, 474, 494, 495, 501, 502, 504, 530].Стрептавидин-сефарозу готовили в растворе. Для каждой пробы былонеобходимо семь микролитров µQ Н2О, три микролитра частиц стрептовидинсефарозы,сорок микролитров 2Х ВВ,Затем, с помощьюкомпьютернойпрограммы, задавали необходимый режим для проведения пиросиквенса.
Вкаждую пробу добавляли 50 мкл раствора, содержащего страптавидин-сефарозу[89, 111, 114-116, 120, 132, 312, 474, 494, 495, 501, 502, 504, 530]. Пробыперемешивали на шейкере в течение 5 минут. В лунки плашки дляпиросеквенирования было добавлено по тридцать девять микролитров 1Х АВ ипо три микролитра праймера (2 о.е.). Следует отметить, что в лунку добавлялсяпраймер для пиросиквенса, соответствующий исследуемой мутации.
Плашкупомещали в вакуумную станцию, используемую при пробоподготовке. Крометого, в данную станцию были помещены ванночки с такими реактивами, какспирт ректифицированный 70%; Washing buffer; µQ Н2О и 0,2 М NaOH. Было122проведено помещение насадки, содержащей фильтры, в µQ Н2О, с включениемвакуума, на двадцать секунд. Затем насадка 10 секунд просушивалась навоздухе. Потом данная насадка была помещена в плашку, содержащую пробы.Через тридцать секунд насадка была последовательно помещена на пять секундв ванночки, содержащие следующие реактивы [89, 111, 114-116, 120, 132, 312,474, 494, 495, 501, 502, 504, 530]:1)Спирт ректифицированный 70%;2)0,2М NaOH;3)Washing buffer;4)µQ Н2О.Затемданнаянасадкабыларасположенанадплашкойдляпиросеквенирования.
Вакуум отключали. Потом фильтры, находящиеся нанасадке, были опущены в плашку на две минуты. Затем фильтры насадки быливынуты из плашки с пробами. Проводилась инкубация проб в течение двухминут при восьмидесяти градусах Цельсия [89, 111, 114, 132, 312, 474, 495, 501,502,504, 530]. Потом плашке с пробами давали остыть до комнатнойтемпературы. Помещали предварительно разведенные в µQ Н2О фермент Е,субстрат S, dCTP dATP, dGTP и dTTP в кювету в количестве, которое былоуказановкомпьютернойпиросеквенирования.программеЗаполненнуюпослезаданиянеобходимымирежимареактивамидлякюветупомещали в соответствующее место пиросеквенатора.
Аналогично поступали сплашкой, содержащей исследуемые пробы [89, 111, 114-116, 120, 132, 312, 474,494, 495, 501, 502, 504, 530].Последовательности праймеров для пиросиквенса приведены в таблице20 [89, 111, 114-116, 120, 132, 312, 474, 494, 495, 501, 502, 504, 530].Компьютернаяпиросеквенатора,программа,былакотораяиспользованаприлагаласьдляпривизуализацииустановкепирограммисследуемых образцов [89, 111, 114-116, 120, 132, 312, 474, 494, 495, 501, 502,504, 530].1232.3.7.3 Оборудование для пиросеквенированияПиросиквенированиеосуществлялосьспомощьюпиросеквенатора«PSQ96MA», вакуумной станции для пробоподготовки «Biotage», термостата«НК-120», микроцентрифуги «ЦиклоТемп-901» шейкера «ST-3» [89, 111, 114116, 120, 132, 312, 474, 494, 495, 501, 502, 504, 530].Таблица 20. Праймеры для пиросиквенса [89, 111, 114-116, 120, 132,312, 474, 494, 495, 501, 502, 504]№ п/пМутацииПраймеры для сиквенса1m.961delCAAAGAGTGTTTTAGATCA (939 956)2m.15723G>ACACTAAGCCAATCACTTT (15701 15719)3m.3316G>AGGAGTAGGAGGTTGG (3331 3317)4m.14482C>AATATCCAAAGACAAC (14467 14481)5m.750A>GTCACCACGATCAAAA (734 748)6m.5178C>AATTAAGGGTGTTAGTCATGT (5200 5181)7m.14459G>AGATACTCCTCAATAGCCA (14439 14456)8m.652insGCCCATAAACAAATA (639 651)9m.3280A>GAAGAAGAGGAATTGA (3300 3286)10m.716T>GGCATCCCCGTTCC (702 714)11m.14484T>CATATCCAAAGACAAC (14467 14481)12m.8363G>ATTTAGTTGGGGCATTT (8379 – 8364)13m.1555A>GACGCATTTATATAGAGGA (1537 1554)14m.9537insCCCAGTGCCCTCCTAAT (9554 – 9539)15m.652delGCCCATAAACAAATA (639 651)16m.8993T>GCATTCAACCAATAGCC (8976 8991)17m.961insCAAAGAGTGTTTTAGATCA (939 956)18m.14709T>CATACAACGATGGTTTTTC (1472714710)12419m.3258T>CAAGAAGAGGAATTGA (3300 3286)20m.15498del24GTGTTTAAGGGGTTGG (15537 15522)21m.3256C>TAAGAAGAGGAATTGA (3300 3286)22m.5692T>CACCCACAAACACTTA (5676 5690)23m.15059G>A24m.3336T>CTGCGATTAGAATGGGTAC (3354 3337)25m.12315G>ATTTGGAGTTGCAC (12328 – 12316)26m.5132insAATCGTGGTGCTGGAG (5148 5135)27m.9379G>ATCTCGTGTTACATCGC (9397 9382)28m.5540G>ATAAATACAGACCAAGA (5524 5539)29m.14487T>CATATCCAAAGACAAC (14467 14481)30m.5814T>CTTGCAATTCAATATGAAAA (5795 5813)31m.13513G>AAGGTTTCTACTCCAA (13497 13511)32m.3285C>TAAGAAGAGGAATTGA (3300 3286)33m.6489C>AAATCACAGCAGTCCTACT (6470 6487)34m.15452C>AATGTCATTAAGGAGAGAA (15470 – 15453)35m.14846G>AGCGCCAAGGAGTGA (14861 14848)36m.3271T>CAAGAAGAGGAATTGA (3300 3286)37m.9480del15TGGTAAAAGGCTCAGAA (9514 9498)38m.15084G>AGGATAATGCCGATGTT (1510115086)39m.8362T>GTTTAGTTGGGGCATTT (8379 – 8364)40m.14482C>GATATCCAAAGACAAC (14467 14481)41m.8993T>CCATTCAACCAATAGCC (8976 8991)42m.15762G>ATCATTCTAACCTGAATCG (15744 – 15761)TTTCTGAGTAGAGAAATGAT(1508015061)1252.3.8 Определение митохондриальных гаплогруппГаплогруппы митохондриального генома в образцах ДНК, выделенных излейкоцитов крови участников исследования, были определены согласнообщепринятым в мире стандартам.
Были проанализированыопределенныеоднонуклеотидные полиморфизмы кодирующего региона митохондриальногогенома, а также первый гипервариабельный сегмент (ГВС1) мтДНК (позициигенома 1602416400) [89,142]. При этом основные гаплогруппы былиопределены с помощью анализа однонуклеотидных полиморфизмов, согласноклассификации, разработанной Torroni A. с коллегами [89, 564]. Определениеподгаплогруппы, к которой относится образец ДНК, было проведенопосредствомсеквенирования ГВС1 и детекции мутаций, характерных дляподгаплогрупп [89].2.3.9 Трансмиссионная электронная микроскопияЭлектронномикроскопический анализ проводили на базе ФГБУ РКНПКМинздравсоцразвития России [89, 98, 104, 115, 506].Из нормальных участков интимы и из атеросклеротических бляшек вырезалипо 4-5 кусочков ткани размером 1 мм3.
Проводили их фиксацию с помощью2,5%. глутарового альдегида. При этом использовался какодилатный буфер(имеющий pН, равный 7,2) [89, 98, 104, 115, 506]. После этого в участкахнормальной интимы и атеросклеротических бляшек проводили постфиксацию спомощью 1% OsO4 , использовав тот же самый буфер [89, 98, 104, 115, 506].Затем было проведено последовательное помещение образцов в спирт, каждыйиз которых был более концентрированным, чем предыдущий. Потом образцыбыли помещены в оксид пропилена. После этого исследуемые участкинормальной интимы и атеросклеротических бляшек были помещены в аралдит.С помощью ультрамикротомов Leica SM2400 и LКВ-III, при использованиисвежеприготовленных стеклянных или алмазных ножей, были приготовлены126ультратонкие срезы исследуемых образцов ткани [89, 98, 104, 115, 506].
Дляобработки данных срезов были использованы цитрат свинца и уранилацетат.Потомультратонкиесрезыучастковнормальнойинтимыиатеросклеротических бляшек изучали с помощью электронного микроскопаHitachi H7000 [89, 98, 104, 115, 506].2.3.10 Статистическая обработка данныхПолученные, в ходе настоящего исследования, результаты, обрабатывали спомощью пакета программ IBM SPSS Statistics версии 21.0 (SPSS Inc., США)[311]. Был применен U-тест для независимых выборок Манна-Уитни. Такжеиспользовался Н-тест Краскелла-Уоллиса. Определение границ квартилей прираспределениях уровня гетероплазмии отдельных мутаций было проведено прианализе частот [89, 111, 114-116, 120, 494, 495, 501, 502, 504]. Коэффициенткорреляции Спирмена был вычислен на основе анализа таблиц сопряженности.Методлинейной регрессии и дисперсионный анализприменялидляопределения направления связи между уровнем гетероплазмии мутациймитохондриального генома и стадиями атеросклеротического поражения.Факториальная регрессия была использована для того, чтобы оценить степеньассоциацииуровнягетероплазмиимутациймтДНКсопределеннымиатеросклеротическими поражениями и атеросклерозом в целом [89, 111, 114116, 120, 494, 495, 501, 502, 504].При распределении признака, отличавшегося от нормального, длястатистическойоценкизначимостиразличийиспользовалисьметодынепараметрической статистики (знаково-ранговые тесты по Уилкоксону иМанну-Уитни), а также бутстрэп-анализ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
