Диссертация (1174185), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Так как используется обратныйпраймер, то на самом деле будет проводиться анализ процента гетероплазмиимутаций m.8362A>C и m.8363C>T, причем в обратном порядке.В случае 100% нормальных аллелей (C/C, A/A) пики нуклеотидов будутследующих размеров: 0 ед. T (пик №2), 1 ед. C (№3), 1 ед. A (№4), 1 ед. C (№5).При 100% аллелей с заменой m.8363C>T (T/T, A/A) размеры пиков будутсоставлять: 1 ед. T, 0 ед. C, 1 ед. A, 1 ед. C.
При 100% аллелей с мутациейA8362C (C/C, C/C) размеры пиков будут составлять: 0 ед. T, 3 ед. C, 0 ед. A,0 ед. C. Следует подчеркнуть, что при 100% замене CT, по сравнению снормой, на 1 ед. увеличивается пик T; а при 100% замене AC – на 2 ед.увеличивается пик C. Сумма пиков составляет 3 ед. Мы подсчитываем размерисследуемых пиков в единицах, выясняем, на сколько единиц они отличаютсяот размера этих пиков при 100% нормальных аллелей (обозначим это значениечерез “y”), а затем подсчитываем процент гетероплазмии по каждой из мутаций[89]:а) для m.8363C>T (расчет производится по формуле №1);б) для m.8362A>C.Следует отметить, что при данной мутации затруднена оценка процентагетероплазмии по пику нуклеотидов C, т.к.
имеется, кроме исследуемого (пика№3), дополнительный пик C (№5). Данный пик (№5) при замене ACсливается с исследуемым пиком (№3), т.е. компьютерная программапоказывает размер пика, соответствующий сумме их значений. Значенияостальных пиков при этом равны нулю. Все это очень осложняет расчеты.Поэтому, значительно проще провести оценку гетероплазмии по пику A (по142формуле №1), после чего вычесть данное значение из 100% .
Полученная цифра(z%) и будет процентом гетероплазмии по m.8362A>C. Расчет производится поформуле №3: z=100%yx100%/1, где «z» – процент гетероплазмии по мутацииAC; «y» – разница между количеством единиц исследуемого и нормальногопика A [89].3.2.2 Общая формула для подсчета процента гетероплазмиимутациймитохондриального генома3.2.2.1 Общая формулаПосле анализа всех разработанных формул была создана общая формуладля подсчета процента гетероплазмии любых мутаций митохондриальногогенома (формула № 4) [13, 27, 45, 83, 87-98, 100-102, 104-116, 119, 120, 160, 463,482, 483, 493, 495-500, 502, 505, 528-532]:P =h N 100M Nгде M – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличиюв образце 100% мутантных аллелей;h – высота пика исследуемого нуклеотида;P – процент гетероплазмии;N – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию вобразце 100% нормальных аллелей [13, 27, 45, 83, 87-98, 100-102, 104-116, 119,120, 160, 463, 482, 483, 493, 495-500, 502, 505, 528-532].1433.2.2.2 Пример расчета процента гетероплазмии мутации m.1555A>Gмитохондриального генома по общей формуле (рисунок 22)Мутацию m.1555A>G можно определить по пикам нуклеотидов G и A,располагающимся в анализируемой последовательности под номерами 2 и 3,соответственно.
По данным компьютерной программы, при 100% нормальныхгеномов (G/G) пики G2 и A3 составляют по 1 единице (рисунок 22а), а при100% геномов с мутацией (A/A) пик A3 составляет 2 единицы, а пик G2 – 0единиц (рисунок 22б) [89, 91-93, 108, 119].Таким образом, сумма величин пиков G2 и A3 составляет 2 единицы.Величина исследуемого пика A3 в образце ДНК оказалась равной 1,27; а пикаG2 – 3,43. Рассчитываем величину пика, соответствующую одной единице. Онаравна 2,35 [89, 91-93, 108, 119].Подставляем значения в формулу №4: P 1,27 2,35 100% 27%3.43 2,35Таким образом, процент гетероплазмии по мутации m.1555A>G в образцеДНК, взятом из интимы аорты 70-летней женщины, оказался равен 27%(рисунок 22в) [89, 91-93, 108, 119].а) Гомоплазмия по G (100% нормальных геномов)2.01.00.0CGAGCAGб) Гомоплазмия по A (100% мутантных геномов)2.01.00.0CGAGCAG144в) Гетероплазмия по AРисунок22.Детекциямутацииm.1555A>G.Анализируемыйприпиросиквенсе фрагмент – G/AACAAG [89, 91-93, 108, 119]:а) теоретическая высота пиков нуклеотидов пригомоплазмии понормальному аллелю 1555G в митохондриальном геноме;б) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по мутантномуаллелю 1555A в митохондриальном геноме;в) практическая пирограмма исследуемого образца ДНКиз участкасосудистой стенки (гетероплазмия по мутации m.1555A>G составляет 27%).3.2.3Примерыгистограммисследованныхмутацийиуровнягетероплазмии, определенного по пирограммам ПЦР-фрагментов образцовДНК3.2.3.1 Для мутации m.3336T>CДля данной однонуклеотидной замены используется обратный праймер длясиквенса, поэтому анализируется замена A на G (рисунок 23) [27, 89, 105, 107,160, 497].145а) Гомоплазмия по A (100% нормальных геномов)2.01.00.0CGACTGAб) Гомоплазмия по G (100% мутантных геномов)2.01.00.0CGACTGAв) Гетероплазмия по GРисунок 23.
Детекция мутации m.3336T>C (при использовании обратногопраймера для сиквенса AG). Анализируемый при пиросиквенсе фрагмент– A/GATGA [27, 89, 105, 107, 160, 497]:а) теоретическая высота пиков нуклеотидов пригомоплазмии понормальному аллелю 3336A в митохондриальном геноме;б) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по мутантномуаллелю 3336G в митохондриальном геноме;в) практическая пирограмма исследуемого образца ДНКиз участкасосудистой стенки (гетероплазмия по мутации m.3336A>G составила 90%).1463.2.3.2 Для мутации m.5178C>AДля m.5178C>A также используется обратный праймер для сиквенса,поэтому анализируется замена G на T (рисунок 24) [45, 89, 90, 105, 107, 482,497].Рисунок 24.
Анализ уровня гетероплазмии мутации m.5178C>A (GT прииспользовании обратного праймера для сиквенса). Анализируемый припиросиквенсе фрагмент – TAT/GCTTG [45, 89, 90, 105, 107, 482, 497]:а) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по мутантномуаллелю T;147б) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии понормальному аллелю G;в) практическая пирограмма исследуемого образца ДНК из участкасосудистой стенки (гетероплазмия по мутации m.5178C>A составила 32%).3.2.3.3 Для m.15059G>AПри исследовании данной мутации используется обратный праймер длясиквенса, поэтому анализируется замена C на T (рисунок 25) [13, 89, 106, 116,498, 527].3.2.4 Оценка воспроизводимости метода измерения уровня гетероплазмииДля определения воспроизводимости метода был применен подход,использующийтрипоследовательныхнезависимыхизмеренияуровнягетероплазмии в одном и том же образце [89].
Воспроизводимость оценивалипо коэффициенту вариации (отношению стандартного отклонения к среднейвеличине, выраженному в процентах). Результаты измерений представлены втаблице 21. Коэффициент вариации по результатам трехкратного измеренияуровня гетероплазмии по произвольно выбранной мутации на 46 образцахинтимы аорты человека составил 11,4 (SD=6,5); при этом отклонениеиндивидуальных измерений от средней результирующей величины составило1,4 (SD=1,2) [89].Таким образом, показатели чувствительности и специфичности метода,составили 88,2% и 77,1%, соответственно (p≤0,05).
Воспроизводимость методаизмерения уровня гетероплазмии составила 88,6% [89].148а) Гомоплазмия по C (100% нормальных геномов)б) Гомоплазмия по T (100% мутантных геномов)в) Гетероплазмия по T50%Рисунок 25. Анализ уровня гетероплазмии мутации m.15059G>A (CT прииспользовании обратного праймера для сиквенса).
Анализируемый припиросиквенсе фрагмент – CC/TGTAATA [89]:а) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии понормальному аллелю C;б) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по мутантномуаллелю T;в) практическая пирограмма исследуемого образца ДНК из участкасосудистой стенки (гетероплазмия по мутации m.15059G>A составила 50%).149Таблица 21. Результаты экспериментов по оценке воспроизводимостиизмерений уровня гетероплазмии митохондриального генома [89]№ п/пИзмерение 1 Измерение 2 Измерение 3 Среднее SDCV118181617.31.26.7220172019.01.79.1314141213.31.28.7414161816.02.012.5524162220.74.220.1616151415.01.06.7714171615.71.59.8822252423.71.56.5924212924.74.016.41024202322.32.19.31116202420.04.020.01223242323.30.62.51311121512.72.116.41418182018.71.26.21516182218.73.116.41622262323.72.18.81723151718.34.222.71829273430.03.612.01917202219.72.512.82020242222.02.09.12122181919.72.110.62264646464.00.00.02352635757.35.59.62416161616.00.00.02515171917.02.011.82614131714.72.114.21502711121412.31.512.4281291411.72.521.62912151815.03.020.03012121212.00.00.03110171614.33.826.43218192420.33.215.83311111311.71.29.93414111212.31.512.4357676.70.68.7367977.71.215.1378576.71.522.9389121010.31.514.8399888.30.66.9408888.00.00.0418121110.32.120.14223212121.71.25.34313141313.30.64.34422172120.02.613.24525232323.71.24.94619161717.31.58.8Примечание: SD – стандартное отклонение; CV – коэффициент вариации.3.3Исследованиеинтимыаортычеловекаспомощьюметодаколичественной оценки мутантного аллеля митохондриального генома3.3.1 Цель исследования интимы аорт индивидовПолагают,чтооднимизобъяснениймозаичногорасположенияатеросклеротических поражений в интиме сосудов может быть повреждающее151действие гемодинамического стресса [89, 114].
Однако гемодинамическийстресс не может объяснить сосуществования в артерии нормальных ипораженных атеросклерозом участков в области, которая подвержена примерноодинаковому воздействию гемодинамического стресса. В связи с системнымдействием традиционных факторов риска ССЗ, данные факторы тоже неявляются объяснением мозаичности атеросклеротических поражений. Впоследнее время все чаще высказывается предположение, что мозаичностьатеросклероза может быть объяснена генетическими факторами [89, 114].Согласноатеросклероза,моноклональнойвединственнойгипотезевозникновениягладкомышечнойиклеткеразвитиявозникаетсоматическая мутация, что приводит к ее неограниченной пролиферации,возникновению моноклона, экспансии в сосудистую стенку, утолщениюинтимо-медиального слоя, возникновению и росту атеросклеротическойбляшки [89, 114].
Следует подчеркнуть, что интенсивность возникновениясоматических мутаций ядерного генома является невысокой, поэтому не можетслужить объяснением возникновения и развития атеросклероза. В то же времямитохондриальный геном менее стабилен, соматические мутации в немвозникают во много раз чаще. Соответственно, гораздо чаще могут появитьсяклетки интимы артерий, имеющие мутации митохондриального генома,которые могут неограниченно пролиферировать [89, 114]. Спонтанноепоявление подобных мутантных гладкомышечных клеток в различных участкахинтимысосудовможетслужитьобъяснениеммозаичностиатеросклеротических поражений.
Кроме того, есть вероятность избирательногонакопления мутантных копий митохондриального генома, переданных отматери потомкам, при попадании клетки в неблагоприятные условия. Этоможет произойти во время митоза, когда, прислучайном неравномерномраспределении митохондриальной ДНК, мутантные копии попадают, восновном, только в одну дочернюю клетку [89, 114].В результате накопления мутантных копий мтДНК могут появитьсяотличия по уровню гетероплазмии мутаций мтДНК между клетками152пораженных и нормальных участков интимы аорты. С целью проверки данногопредположения был проведен пилотный анализ интимы аорт [13, 27, 45, 83, 8798, 100-102, 104-116, 119, 120, 160, 463, 482, 483, 493, 495-500, 502, 505, 528532].3.3.2 Детекция уровня гетероплазмии 42 мутаций митохондриальногогенома в липофиброзных бляшках и нормальной интиме аортАнализ научной литературы позволил составить список из 42 мутациймитохондриального генома, для которых теоретически могла бы наблюдатьсяассоциация их уровня гетероплазмии с атеросклерозом [13, 27, 45, 83, 87-98,100-102, 104-116, 119, 120, 160, 463, 482, 483, 493, 495-500, 502, 505, 528-532].С помощью разработанного метода прямой количественной оценкимутантного аллеля митохондриального генома проведен анализ данныхмутаций в образцах ДНК из липофиброзных бляшек и участков нормальнойинтимы 7 аорт [13, 27, 45, 83, 87-98, 100-102, 104-116, 119, 120, 160, 463, 482,483, 493, 495-500, 502, 505, 528-532].Следует отметить, что при анализе пирограмм выбранных дляисследования мутаций, с помощью разработанного автором с коллегамиметода, в образцах интимы аорты удалось выявить три новые, ранее неописанные мутации – m.652delG, m.961delC и m.5132insAA [89].Сорокисследованныхмутаций(m.652delG, m.716T>G, m.750A>G,оказалисьгетероплазмичнымиm.961delC, m.1555A>G, m.3256C>T,m.3258T>C, m.3271T>C, m.3280A>G, m.3285C>T, m.3316G>A, m.3336T>C,m.5132insAA, m.5178C>A, m.5540G>A, m.5692T>C, m.5814T>C, m.6489C>A,m.8993T>G, m.8993T>C, m.9379G>A, m.9480del15, m.9537delC, m.12315G>A,m.13513G>A,m.14459G>A,m.14482C>A,m.14482C>G,m.14484T>C,m.14487T>C, m.14709T>C, m.14846G>A, m.15059G>A, m.652insG, m.961insC,m.15084G>A, m.5132delAA, m.15498del24, m.15452C>A и m.15762G>A), а две153(m.8362T>G и m.8363G>A) – гомоплазмичными по отсутствию мутантногоаллеля при атеросклерозе [89].Статистический анализ проводился с помощью непараметрического тестаМонте-Карло, рангового теста Уилкоксона и бутстрэп-анализа [89].Результаты представлены в таблицах 22-24 [44, 8297, 100, 101, 103, 296,436, 464471, 492496].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
