Диссертация (1174185), страница 16
Текст из файла (страница 16)
ДНК-маркер 100 bp (10 фрагментов ДНК от 100 до 1000 п.н.);2. Отрицательный контроль;3-8. Амплификаты с областью мутации m.1555A>G.110Рисунок 8. Электрофорез в агарозном геле амплификатов с областьюмутаций m.3256C>T, m.3258T>C, m.3271T>C, m.3280A>G, m.3285C>T,m.3316G>A и m.3336T>C [89]:1. Маркер ДНК 100 bp (10 фрагментов ДНК от 100 до 1000 п.н.);2.
Отрицательный контроль;3-8. Амплификаты с областью мутаций m.3256C>T, m.3258T>C,m.3271T>C, m.3280A>G, m.3285C>T, m.3316G>A и m.3336T>C.СоставреакционнойсмесидляПЦР:смесьдезоксинуклеотидов(десятикратная), с концентрацией каждого дезоксинуклеотида (dATP, dTTP,dGTP, dCTP) 2 мМ четыре микролитра; MgCl2 (концентрация 25мМ) 2,4мкл (при необходимой концентрации 1,5 мМ) или четыре микролитра (принеобходимой концентрации 2,5 мМ); Taq-полимераза 1,33 мкл; H2O (MQ) 4,6 мкл; десятикратный буфер (67 мM tris-HCl (pH 8,8), 16,6 M (NH4)2SO4) четыре микролитра; по 2,7 мкл прямого и обратного праймера, ДНК четыремикролитра [89, 111, 114-116, 120, 494, 495, 501, 502, 504, 530].Общий объем реакционной смеси для полимеразной цепной реакциисоставлял сорок микролитров [89, 111, 114-116, 120, 494, 495, 501, 502, 504,530].111Рисунок 9.
Электрофорез в агарозном геле амплификатов с областьюмутаций m.5132insAA и m.5178C>A [89]:1. ДНК-маркер 1 Kb (13 фрагментов ДНК от 0.25 до 10 т.п.н.);2. ДНК-маркер 100 bp (10 фрагментов ДНК от 100 до 1000 п.н.);3 и 7. Отрицательный контроль;4-6 и 8-10. Амплификаты с областью мутаций m.5132insAA иm.5178C>A.Рисунок 10. Электрофорез в агарозном геле амплификатов с областьюмутации m.12315G>A [89]:1. ДНК-маркер 100 bp (10 фрагментов ДНК от 100 до 1000 п.н.);2. Отрицательный контроль;3-8. Амплификаты с областью мутации m.12315G>A.112Рисунок 11. Электрофорез в агарозном геле амплификатов с областьюмутации m.13513G>A [89]:1. ДНК-маркер 100 bp (10 фрагментов ДНК от 100 до 1000 п.н.);2.
Отрицательный контроль;3-8. Амплификаты с областью мутации m.13513G>A.Рисунок 12. Электрофорез в агарозном геле амплификатов с областьюмутаций m.14459G>A, m.14482C>G, m.14482C>A, m.14484T>C и m.14487T>C[89]:1. ДНК-маркер 1 Kb (13 фрагментов ДНК от 0.25 до 10 т.п.н.);2.
ДНК-маркер 100 bp (10 фрагментов ДНК от 100 до 1000 п.н.);3 и 7. Отрицательный контроль;4-6 и8-10. Амплификаты с областью мутаций m.14459G>A,m.14482C>G, m.14482C>A, m.14484T>C и m.14487T>C.113Рисунок 13. Электрофорез в агарозном геле амплификатов с областьюмутаций m.14709T>C, m.14846G>A, m.15059G>A и m.15084G>A [89]:1. ДНК-маркер 100 bp (10 фрагментов ДНК от 100 до 1000 п.н.);2. ДНК-маркер 1 Kb (13 фрагментов ДНК от 0.25 до 10 т.п.н.);3. Отрицательный контроль;4-10. Амплификаты с областью мутаций m.14709T>C, m.14846G>A,m.15059G>A и m.15084G>A.В таблице 18 содержатся ппоследовательностиоследовательности праймеров, необходимыхдля получения ПЦР-фрагментов, содержащих области исследованных мутаций[89, 111, 114-116, 120, 141, 158, 159, 179, 207, 252, 287, 294, 297, 330, 341, 391,402, 439, 494, 495, 501, 502, 504, 540, 551, 575, 594, 595, 601].Таблица 18.
Праймеры для ПЦР [89, 111, 114-116, 120, 141, 158, 159, 179, 207,252, 287, 294, 297, 330, 341, 391, 402, 439, 494, 495, 501, 502, 504, 540, 551, 575,594, 595, 601]Прямые праймерыОбратные праймерыm.716T>GTAGACGGGCTCACATCACbio-GGGGTATCTAATCCCAGTTTGm.750A>G(621 - 638)GGT(1087 - 1064)bio-CACTAACCATATACCAATGACTCCTGATGCGAGTAATACGGATGМутацииm.652delGm.652insGm.961insCm.961delCm.9379G>A114m.9480del15(9358 – 9377)T(9630 - 9605)bio-AGGACAAGAGAAATAAGGCCACGTTGGGGCCTTTGCGTAG(3129 - 3149)(3422 - 3403)m.9537insCm.3285C>Tm.3258T>Cm.3271T>Cm.3280A>Gm.3256C>Tm.3316G>Am.3336T>Cm.1555A>GTAGGTCAAGGTGTAGCCCATGAG bio-GTAAGGTGGAGTGGGTTTGGGGTGGCAA(1326 - 1355)(1704 - 1684)m.8362T>Gbio-AGATTAAGAGAACCAACACCGGGGGTAATTATGGTGGGCCm.8363G>ATCTTTACA(8333 - 8360)(8410 - 8391)GGGCCATCAATTTCATCACAACAbio-CAGCAGCTAGGACTGGGAGAA(6382 – 6405)GATAGGA(6516 - 6490)CCTCACAGGTTTCTACTCCAAAbio-AAGTCCTAGGAAAGTGACAG(13491 – 13512)CGAGG(13825 - 13806)m.5178C>Abio-GCAGTTGAGGTGGATTAAACGGAGTAGATTAGGCGTAGGTAGm.5132insAA(4963 - 4982)(5366 - 5345)CAGCTTCCTACACTATTAAAGTbio-GTTTTTTTAATTTATTTAGG(14303 – 14334)GGG(14511 – 14489)bio-CTCATGCCCCCATGTCTAATTACTTTTATTTGGAGTTGCAC(12230 – 12249)(12337 -12317)m.14846G>Abio-CATTATTCTCGCACGGACTGCTATAGTTGCAAGCAGGAGm.15059G>A(14671 – 14689)(15120 – 15100)m.15452C>Abio-ACCTTCCACCCTTACTACATGTAGGCGAATAGGAAATATCm.15498del24(15401 – 15419)(15581 - 15561)m.5692T>CACACTCATCACCCTTACCAbio-CGAATAAGGAGGCTTAGAGm.5814T>C(5451 - 5469)(6016 - 5998)m.6489C>Am.13513G>Am.14459G>Am.14482C>Gm.14482C>Am.14484T>Cm.14487T>Cm.12315G>Am.14709T>Cm.15084G>A115m.5540G>Am.15723G>AGCCCGAATGATATTTCCTATbio-GCTTTGGGTGCTAATGGTGGm.15762G>A(15553 – 15572)(15996 - 15977)В таблице 19 представлены условия для проведения полимеразнойцепной реакции, необходимые для получения фрагментов ДНК, содержащихобласть исследованных мутаций [89, 111, 114-116, 120, 141, 158, 159, 179, 207,252, 287, 294, 297, 330, 341, 391, 402, 439, 494, 495, 501, 502, 504, 530, 540, 551,575, 594, 595, 601]Таблица 19.
Условия для проведения полимеразной цепной реакции[89, 111, 114-116, 120, 141, 158, 159, 179, 207, 252, 287, 294, 297, 330, 341, 391,402, 439, 494, 495, 501, 502, 504, 540, 551, 575, 594, 595, 601]РазмерМутацииампли-MgCl2фикатаТемпера-Темпера-тура длятура дляденатура-отжигации ДНКпраймеров940550Температура длясинтезафрагментовДНКm.3256C>T,m.3258T>C,m.3271T>C,m.3280A>G,294 п.н.m.3285C>T,m.3316G>A,2,5 мМm.3336T>C720m.9537delC,m.9480del15,273 п.н.m.9537insC,m.9379G>Am.15498del24181 п.н.116m.15452C>A,m.8993T>G,m.8993T>Cm.15723G>A,m.15762G>A180 п.н.444 п.н.1,5 мМm.15084G>Am.14709T>C,450 п.н.m.15059G>A,m.14846G>Am.13513G>A335 п.н.m.5814T>C,m.5692T>C,566 п.н.2,5 мМ94062072078 п.н.1,5 мМ940450720940500720940600720m.5540G>Am.8363G>A,m.8362T>Gm.12315G>A108 п.н.m.1555A>G379 п.н.m.6489C>A135 п.н.2,5 мМm.14482C>G,m.14487T>C,m.14482C>A,209 п.н.1,5 мМm.14459G>A,m.14484T>Cm.5178C>A,383 п.н.m.5132insAAm.961delC,m.652delG,m.750A>G,2,5 мМ467 п.н.m.961insC,117m.716T>G,m.652insGСледует отметить, что один из двух праймеров, использованных приполимеразной цепной реакции, был подвергнут биотинилированию, т.к.
припоследующем пиросеквенирования использовалась биотинилированная цепьамплификата [89, 111, 114-116, 120, 494, 495, 501, 502, 504].Полимеразные цепные реакции были проведены на приборе «PTC DNAEngine 200» [89, 111, 114-116, 120, 494, 495, 501, 502, 504, 530].2.3.7 Пиросиквенс2.3.7.1 Методика пиросеквенированияПроведение реакции пиросеквенирования включает в себя четыре этапа[89, 111, 114-116, 120, 132, 312, 474, 494, 495, 501, 502, 504, 530].Первый этапПраймер для сиквенса гибридизировался с одноцепочечным ПЦРфрагментом, использовавшимся как матрица. Затем проводилась инкубацияполученного фрагмента ДНК с энзимами, такими как ДНК-полимераза , АТФсульфурилаза, люцифераза и апираза.
Кроме того, была проведена инкубацияисследуемого фрагмента ДНКс субстратами, такими как аденозин-5-фосфосульфат и люциферин (рисунок 14) [89, 111, 114, 132, 312, 474, 495, 501,502, 504, 530].Второй этапПроводилосьпоследовательноедобавлениенуклеотидоввреакционную смесь для пиросиквенса. В частности, при добавлении очередногонуклеотида ферментом ДНК-полимеразой проводилась комплиментарная118достройка его к исследуемой цепи ДНК. При этом выделялся пирофосфат(РРi). Количество молекул пирофосфата было кратно количеству встроенныхнуклеотидов (рисунок 14) [89, 111, 114-116, 120, 132, 312, 474, 494, 495, 501,502, 504, 530].Рисунок 14.
Технология пиросеквенирования: этапы 1 и 2 [89, 111, 114116, 120, 132, 312, 474, 494, 495, 501, 502, 504, 530].Третий этапПроисходилопреобразованиепирофосфатаспомощьюATФ-сульфурилазы в АТФ. Субстратом служил аденозин-5-фосфосульфат. Врезультате этого процесса люциферин преобразовывался в oксилюциферин.Возникала вспышка света, интенсивность которой была кратна количествумолекул АТФ. Программа пиросеквенатора детектировала эту вспышку света ипреобразовывала ее в пик пирограммы. Величина пика нуклеотида была119пропорциональнаинтенсивностисветовойвспышки,и,следовательно,количеству встроенных в цепь ДНК нуклеотидов (рисунок 15).
Например, еслив определенном положении ПЦР-фрагмента находилсяединственныйнуклеотид T размер пика данного нуклеотида на пирограмме соответствовалоднократной вспышке света. Если в определенном положении ПЦР-фрагментанаходились четыре тимина подряд размер пика на пирограмме соответствовалчетырехкратной вспышке света [83, 87, 89, 94, 111, 112, 114, 493, 495, 501, 502,504, 530].Рисунок 15. Технология пиросеквенирования: этапы 3 и 4 [89, 111, 114116, 120, 132, 312, 474, 494, 495, 501, 502, 504, 530].120Четвертый этапПроисходилоразрушениенуклеотидов,которыеоказалисьнеприсоединенными к биотинилированной цепи ПЦР-фрагмента, с помощьюапиразы. Также данный фермент разрушал не вступившие в реакцию молекулыАТФ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
