Диссертация (1174185), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Полагают, что именно последостижения определенного порога мутационной нагрузки организма начинаютвозникать симптомы заболевания. Эти сведения могут помочь в поискевозможных причин такого тяжелого и грозного заболевания, как атеросклероз[89].96ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1 Исследуемые мутацииМутации митохондриального генома, исследованные в настоящей работе,приведены в таблице 17. Алгоритм исследования включал выделение ДНК изобразцов интимы аорты или клеток крови, получение и пиросиквенс ПЦРфрагментов, содержащих область мутации [89].Таблица 17. Локализация исследуемых мутаций в митохондриальномгеноме [13, 27, 88, 89, 90-116, 119, 123.
495, 502, 504, 527, 528, 531, 532, 534]№ п/пМутацииГены1m.961insC2m.652insG3m.716T>G4m.750A>G5m.652delG6m.961delC7m.1555A>G8m.3258T>C9m.3271T>C10m.3280A>G11m.3256C>T12m.3285C>T13m.3336T>C14m.3316G>A15m.5692T>CMT-TN16m.5814T>CMT-TC17m.6489C>AMT-CO1MT-RNR1MT-TL1MT-ND19718m.5540G>AMT-TW19m.8362T>G20m.8363G>A21m.8993T>G22m.8993T>C23m.9379G>A24m.9480del1525m.9537insC26m.12315G>AMT-TL227m.13513G>AMT-ND528m.5178C>A29m.5132insAA30m.14459G>A31m.14482C>G32m.14482C>A33m.14484T>C34m.14487T>C35m.14709T>C36m.14846G>A37m.15059G>A38m.15084G>A39m.15452C>A40m.15498del2441m.15723G>A42m.15762G>AMT-TKMT-CO3MT-ND2MT-ND6MT-TEMT-CYTB982.2 МатериалыДля проведения данной работы были использованы [89]:I. Образцы нормальной интимы и липофиброзные бляшки 7 аорт индивидов,которые погибли из-за внезапной смерти или несчастного случая [13, 27.
83. 87,89, 91, 93-98, 102-106, 109, 111, 112, 114-116, 120, 121, 123, 160, 463, 483,493498, 505, 528-531].II.265 участков морфологически картированной стенки аорт пяти индивидов,среди которых были как участки нормальной интимы, так и участки сосудистойстенки, пораженные атеросклерозом различной степени тяжести [89, 113, 116,500, 502].Аутопсийный материал был взят из грудного отдела интимы аорты людей,возраст которых составлял от 30 до 65 лет. Данные индивиды погибли из-завнезапной смерти или несчастного случая [89]. Отметим, что в исследование небрались люди, погибшие из-за электротравм или отравления. У индивидов былопроведено продольное вскрытие аорт с последующим промыванием сосудовизотоническим фосфатным буфером, рН 7,6 [89].Был проведен анализ пораженных атеросклерозом и нормальныхучастковаорт,прикоторомиспользоваласьклассификацияатеросклеротических поражений, разработанная Советом по атеросклерозуАмериканского Общества по исследованию сердца [89, 116, 274].Гладкая люминальная поверхность была характерна для нормальныхучастков аорт.
Наблюдалось два слоя на вертикальных срезах интимы:протеогликановый, который прилежал к просвету сосуда, и мышечноэластический, который прилежал к медии [89, 116].I тип (начальное поражение) был представлен участками интимы сгладкой желтоватой поверхностью, реже имел мелкие желтые точки.Микроскопические изменения были минимальны. В соединительно-тканномматриксе наблюдались накопления капель липидов вне клеток.
Имелось99большее, по сравнению с нормальной интимой, количество мононуклеарныхклеток. Отсутствовали дефекты в структуре ткани [89, 116].II тип (жировые полосы) имели вид желтых полосок и точек, слегкавыступавших над поверхностью интимы. Иногда, при слиянии жировыхполосок, происходило образование более крупных структур (кластеров). Наполученных вертикальных срезах ткани обнаруживалось внутриклеточноенакопление липидов. Внеклеточные липиды были видны в матриксесоединительной ткани.
В ряде случаев в данном типе поражения обильноразрастался внеклеточный матрикс [89, 116].Va тип поражения (липофиброзные бляшки). Имели вид сильновыступающих над поверхностью сосуда желтоватых или перламутровых,круглых или эллипсоидных образований при макроскопическом анализе. Примикроскопии внутри клеток выявлялось накопление липидов, имелосьразрастание внеклеточного матрикса. В ЛФБ можно было видеть крупноенекротическое ядро, и над ним покрышку из соединительной ткани.
Такжеобнаруживались участки, морфологически походящие на жировые полосы,называемые плечами ЛФБ [89, 116].Vcтиппоражения(фиброзныебляшки).Фиброзныебляшкимакроскопически выглядели как высоко приподнятые, жемчужного цвета,овальные или округлые образования. При микроскопии можно было видеть, чтоони состоят, как правило, из грубого соединительнотканного матрикса, вкоторый “замурованы” клетки. Липидный компонент в фиброзных бляшках былминимален или отсутствовал [89, 116].Внастоящемисследованиибылопроведеноморфологическоекартирование интимы аорт. Сосудистая стенка была разделена на участки сатеросклеротическими поражениями различной степени тяжести и участки снормальной интимой [89, 116].III.
Суммарные гомогенаты нормальной или пораженной атеросклерозоминтимы аорты 10 человек [45, 88-90, 92, 100, 101, 107. 108, 110, 119, 482].100Все пораженные атеросклерозом участки интимы гомогенизировались итщательно перемешивались. Аналогично был получен суммарный гомогенатинтимы нормальных участков аорты. Для выделения ДНК использовалось по 10мг образца гомогената [45, 88-90, 92, 100, 101, 107. 108, 110, 119, 482].Следует отметить, что гистологический анализ образцов интимыаорты проводился на базе ФГБУ РКНПК Минздравсоцразвития России [89].IV.
Образцы клеток крови гетерогенной выборки из Московского региона,состоящей из 700 участников исследования [89, 99, 115, 494, 501, 503, 504].Следует подчеркнуть, что всеучастники исследования былипроинформированы о целях и конкретном предмете исследования и далиписьменное информированное согласие на участие в исследовании. Данноеисследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975года (редакция 1983 года). Оно получило одобрение комитета по биоэтикеФГБУ НИИ ОПП [89, 99, 115, 494, 501, 503, 504].Мужчины были старше 40 лет, а женщины – старше 50.
Средний возрастучастников выборки был 62,3 года (SD=8,7). Соотношение мужчин и женщинбыло 362:338 (51,7%/48,3%). Среди участников исследования были какздоровые индивиды, так и пациенты, входящиеатеросклерозу, т.к.они имели однов группу риска поиз заболеваний, наиболее частоассоциированное с данной патологией (артериальную гипертонию, сахарныйдиабет 2 типа, ишемическую болезнь сердца, острый инфаркт миокарда,бронхиальную астму, нарушение мозгового кровоснабжения) [89, 99, 115, 494,501, 503, 504, 530].Критериями исключения были: анатомическая организация шейных исонныхартерий,заболевания,препятствующаяопасныедлояжизникачественнойпациента;отказультрасонографии;отподписанияинформированного согласия на исследование.
Такие пациенты, а также люди, укоторых были диагностированы рак молочной железы, узловая формамастопатии, инсульт, дисфункция печени, хроническая болезнь почек, легочная101эмболия или тромбоз глубоких вен были исключены из исследования [53, 54,137, 342, 427, 530, 537].2.3 Методы2.3.1 Подготовка образцов интимы аорты для анализа2.3.1.1 Пробоподготовка участков интимы аорты для электронномикроскопического исследованияИз пораженных атеросклерозом (начальные поражения, жировые полосы,липофиброзные и фиброзные бляшки) и нормальных участков вырезаликусочки необходимого размера перпендикулярно длинной оси сосуда [89, 98,104, 111, 114-116, 495, 501, 502, 504, 562].
Образцы для вертикальных срезовфиксировали в течение 18 часов метакарне (метанол : хлороформ : ледянаяуксусная кислота в объемных соотношениях 6:3:1). После фиксации образцыдегидратировали в серии спиртов восходящей концентрации, просветляли вхлороформе и заливали в парапласт (Sigma Chemical Co., St-Louis, MS, USA),затем готовили серийные срезы толщиной 5 мкм. Срезы каждого образцаокрашивалигематоксилином-эозиномпостандартнойметодикедляидентификации изучаемого участка методами световой микроскопии [89, 111,114-116, 495, 501, 502, 504, 562].2.3.1.2 Пробоподготовка образцов интимы аорты для выделения ДНКВовсехначальномуобразцахартериальнойатеросклеротическомуткани,поражению,соответствующихнорме,липофибрознойбляшке,жировой полосе и фиброзной бляшке был отделен слой интимы от слоя медии.Интиму замораживали в жидком азоте, а затем растирали, при помощи пестикаи ступки.
Полученные образцы интимы аорты в порошкообразном состоянии102хранили при 75°С [13, 27, 45, 83, 87-98, 100-102, 104-116, 119, 120, 160, 463,482, 483, 493, 495-500, 502, 505, 528-532].2.3.2 Ультрасонографическое исследованиеТип поражения артерий участников исследования из поликлиник Москвыи Московской области определяли с помощью ультрасонографии с высокимразрешением в В-режиме [53, 54, 342, 427, 530, 537].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
