Диссертация (1174185), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Достоверными (статистическизначимыми) считались различия средних значений показателей при 95%вероятности безошибочного прогноза [89, 111, 114-116, 120, 494, 495, 501, 502,504].127ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫСобственные данные3.1 Сравнительный электронно-микроскопический анализ митохондрийклетокинтимывнормальныхучасткахсосудистойстенкииатеросклеротических пораженияхДля того, чтобы выяснить, имеются ли отличия между митохондриямиклеток нормальной и пораженной атеросклерозом интимы сосудов,былпроведен ультраструктурный анализ с помощью электронного микроскопа [89,98, 104, 115, 506]. В подавляющем большинстве клеток нормальной интимы,кристы митохондрий в основном были хорошо различимы и окружающиемембраны не имели каких-либо структурных дефектов (рисунок 17а) [89, 98,104, 115, 506]. Напротив, анализ митохондрий в клетках, присутствующих ватеросклеротических поражениях, выявил наличие в них структурныхальтераций (рисунок 17б-17е) [89, 98, 104, 115, 506].
Хотя в некоторыхмитохондриях кристы были различимы и окружающие мембраны изменений неимели (рисунок 17б), другие митохондрии характеризовались нарушениемструктуры крист (рисунок 17б-17е). В матриксе митохондрий с нарушеннойструктурой крист отмечалось формирование вакуолеподобных структур(рисунок 17б-17е). В зонах митохондрий, где отмечалось образованиевакуолеподобных структур, наблюдался также отек матрикса, выражающийся влокальной потере матриксом электронной плотности (рисунок 17б-17е). Внекоторых интимальных клетках, присутствующих в атеросклеротическихбляшках, отмечалось также формирование "миелиноподобных" структур вотечном матриксе митохондрий (рисунок 18а-18г) [89, 98, 104, 115, 506].Сравнительный анализ количеств митохондрий со структурными изменениямив нормальной интиме и в атеросклеротических бляшках показал, что в то времякак количество митохондрий со структурными изменениями в образцах ткани,128полученных из нормальной интимы, варьировало от 0,4% до 3,5%, количествомитохондрий со структурными повреждениями в атеросклеротических бляшкахварьировало от 5,8% до 23,6% [89, 98, 104, 115, 506].Следует отметить, что хотя классические электронно-микроскопическиеисследования содержат описания изменения структуры артериальных клеток ватерогенезе [1-3], ультраструктурные исследования, посвященные изучениюморфологических изменений митохондрий при атеросклерозе, до настоящеговремени отсутствовали.
Данные настоящего исследования выявили большоеразнообразие структурных изменений в митохондриях из атеросклеротическихбляшек [89, 98, 104, 115, 506].129Рисунок 17. Ультраструктура митохондрий в интиме аорты [89, 98, 104,115, 506]:(а): типичный вид митохондрии в нормальной интиме аорты.(б): митохондрия с четко выраженными кристами и хорошо выраженнойокружающей мембраной в клетке атеросклеротической бляшки.(в-е): структурные варианты митохондрий, демонстрирующие наличиедеструктивныхизмененийкристмитохондрийвклеткахатеросклеротических бляшек.На рисунке (в-е), стрелки указывают на вакуолеподобные структуры взонахотечногомитохондриальногоматрикса.(а-е).Электроннаямикроскопия. Линейка = 200 нмРисунок 18.
Миелиноподобные структуры в отечных митохондриях,наблюдаемые в клетках атеросклеротических бляшек (а-г). Электроннаямикроскопия. Линейка = 200 нм [89, 98, 104, 115, 506].130Наличие структурных изменений в митохондриях в клетках, присутствующих ватеросклеротических поражениях, позволяет предполагать, что в митохондрияхмогут иметься нарушения на биохимическом и генетическом уровне.Последующие разделы настоящей работы посвящены анализу генетическиххарактеристик митохондрий при атеросклерозе [89, 98, 104, 115, 506].3.2Разработка методаколичественной оценки мутантного аллелямитохондриального геномаВцеляхопределенияпороговогоуровнягетероплазмиимитохондриальных мутаций, ассоциированного с возникновением и развитиемпатологий в организме человека, автор с коллегами разработали новыйоригинальный метод количественной оценки митохондриального генома,который основан на пиросеквенировании короткоцепочечных фрагментов ДНК[83, 87, 89, 94, 111, 112, 114, 493, 495, 535].В настоящее время описаны различные методы количественной оценкиуровня гетероплазмии, например, с помощью технологии ПЦР в режимереального времени (методов инвазивного расщепления олигонуклеотидногозонда (Invader) и РТ РАСА-кПЦР), методов высокоэффективной жидкостнойхроматографии (HPLC), анализа гетеродуплексов, анализа гетероплазмии сиспользованием Surveyor nuclease, секвенирования по Сенгеру, SNaPshot, HRM,TGGE, секвенирования нового поколения на оборудовании 454/Roche, AppliedBiosystems SOLiD, серии приборов Illumina [89, 154, 158, 179, 202, 215, 231,239, 271, 293, 298, 303, 365, 380, 384, 387, 396, 397, 434, 436, 437, 445, 466, 521,535, 541, 550, 563, 579].
Однако эти методы имеют довольно существенныйнедостаток–значительноменьшуюточность(чувствительностьиспецифичность). Кроме того, пиросеквенирование обеспечивает возможностьанализа области исследуемой мутации на очень короткой последовательностинуклеотидов – 5-10 п.н., что значительно увеличивает точность измерения131уровня гетероплазмии мутантного аллеля [83, 87, 89, 94, 111, 112, 114, 493, 495,535].Метод количественной оценки мутантного аллеля митохондриальногогенома, разработанный и апробированный автором с сотрудниками, базируетсяна детекции высоты пиков нуклеотидов на исследуемой пирограмме ванализируемом районе одноцепочечного амплификата ДНК [83, 87, 89, 94, 111,112, 114, 493, 495, 535].
Пирограммы митохондриальных и ядерных геновотличаются между собой. Для ядерного гена имеется четкое разделение нагомо- и гетерозигот по мутантному аллелю, которое делает фиксированнойвысоту пиков пирограммы (0% гомозигота, в обоих аллелях мутации нет;50% гетерозигота, один из аллелей имеет мутацию; и 100% гомозигота, вкоторой оба аллеля несут мутацию). В то же время, вследствие большогоколичества копий митохондриального генома в митохондриях, уровеньгетероплазмии мутаций в них может варьировать от 0% до 100%.
Определитьуровень гетероплазмии исследованной мутации в образце мтДНК индивидаможно, сравнив размер пиков пирограммы при 100% гомоплазмии по наличиюисследованной мутации и 100% гомоплазмии по ее отсутствию [83, 87, 89, 94,111, 112, 114, 493, 495, 535].Вначале для каждой из исследованных мутаций был разработан способопределения уровня гетероплазмии в ПЦР-фрагменте ДНК индивида [83, 87,89, 94, 111, 112, 114, 493, 495, 535].3..2.1 Способы определения уровня гетероплазмииможно разделить на несколько типов [89]:I типДелеция одной пары основанийВисследуемомодноцепочечномфрагментеДНКисчезаетодиннуклеотид.
Таким образом, в случае 100% нормальных молекул ДНК мы видим132исследуемый пик равным “n” единиц, а в случае 100% мутантных молекулДНК мы видим исследуемый пик равным “n-1” единиц. В качестве контроляиспользуется ряд контрольных негетероплазмичных пиков из того же участкаДНК, до или после полиморфного фрагмента. Следует отметить, что, еслисреди контрольных пиков нет пика, одноименного исследуемому, выбираем длясравнения пуриновый или пиримидиновый контрольный пик, в зависимости оттого, каким является пик исследуемый [89, 93, 96, 108].Определяем, сколько единиц составляет исследуемый пик нуклеотидовв определенном образце ДНК и, на сколько единиц он отличается от пика,характерного для 100% нормальных молекул ДНК.
Процент гетероплазмиипо данному типу мутаций вычисляется по формуле p = yx100%/1 (формула№1), где «p» – процент гетероплазмии по мутации; «y» – разница междуколичеством единиц нормального и исследуемого пика (или наоборот, междуколичеством единиц исследуемого и нормального пика) [89, 93, 96, 108].В качестве примера приведем анализ гетероплазмии по мутацииm.652delG.
Данную мутацию можно определить по пику нуклеотидов G. Ванализируемой последовательности он находится под номером 2. По даннымкомпьютерной программы, при 100% нормальных геномов (G/G) пик Gсоставляет 2 единицы (рисунок 19а), а при 100% геномов с делецией (-/-) пик Gсоставляет 1 единицу (рисунок 19б). В качестве контроля берем пик G №5,составляющий 2 единицы [89, 93, 96, 108].Например, определим процент данной мутации в образце ДНК, взятомиз стенки сосуда 50-летнего мужчины. Размер исследуемого пика G в данномобразце составляет 15,73 (рисунок 19в).
Размер контрольного пика G – 18,29.Полагая, что 18,29 составляет 2 единицы, вычисляем размер исследуемогопика G в единицах. Он равен 1,72 ед. Это на 0,28 ед. меньше пика, характерногодля 100% нормальных молекул ДНК. Далее вычисляем процент гетероплазмиипо m.652delG (формула №1): 0,28x100%/1=28% [89, 93, 96, 108].Таким образом, данный образец ДНК имеет 28% гетероплазмии поm.652delG [89, 93, 96, 108].133II типДелеция двух пар нуклеотидовДетекция данных мутаций проводится аналогично методу анализамутаций первого типа, за исключением того, что разница между пиками для100% нормальных и мутантных аллелей составляет две единицы вместо одной[89].134Рисунок19.Детекциямутацииm.652delG.Анализируемыйприпиросиквенсе фрагмент - [G]GTTTGGT [89, 93, 96, 108]:а) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по отсутствиюделеции G в позиции 652 митохондриального генома;б) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по наличиюделеции G в позиции 652 митохондриального генома;в) практическая пирограмма исследуемого образца ДНК (гетероплазмия поm.652delG в исследуемом образце составляет 28%).III типИнсерция одной пары нуклеотидовПроцент гетероплазмии по данному типу мутаций подсчитываетсяаналогично методу для мутаций I типа, эа исключением того, что при 100%аллелей с инсерцией размер исследуемого пика на 1 единицу больше [89, 93,95, 97, 108].Дляпримерапродемонстрируем,какподсчитываетсяпроцентгетероплазмии при мутации m.9537insC.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
